全 文 ：森林保护 ＦｏｒｅｓｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
３６ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＦＯＲＥＳＴＲＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
二
○
一
三
年
第
十
期
林
业
实
用
技
术
东北红豆杉内生菌对返魂草黑斑病的抗性研究
夏广清
（通化师范学院生命科学学院 吉林 通化 １３４００２）
［摘要］ 本实验对东北红豆杉的内生菌进行了分离培养，并检
测了不同浓度东北红豆杉内生菌对返魂草黑斑病病原菌的抑
菌效果。实验结果表明，红豆杉内生菌对返魂草黑斑病病原菌
具有较好的抑菌效果，其抑菌率最高可达４３％．该实验为生物
防治返魂草黑斑病提供了理论依据。
［关键词］ 东北红豆杉 内生菌 返魂草黑斑病 分离筛选
抗性
返魂草原植物为菊科麻叶千里光［Ｓｅｈｅｃｉｏｃａｎｎａｂｉ
ｆｏｌｉｕｓ ｌｅｓｓ．］，又名宽叶返魂草，为多年生草本植物，以
地上全草入药。具清热解毒、散血消肿、下气通经等
功效［１］，其中药商品市场前景十分看好。近年来，随
着开发种植面积迅猛增加，返魂草黑斑病已成为返魂
草生产栽培中最具毁灭性的病害。据调查，一般平均
发病率为８０％，严重时可造成大幅度绝收［２］。目前关
于该的防治以化学药物防治为主，有关生物防治的方
法鲜有报道。
植物内生菌是指生活在健康植物组织和器官内
部的真菌或放线菌，是植物在长期进化过程中衍生的
一类微生物［３］。研究表明，内生菌在演化过程中发生
了基因重组，获得了宿主植物的基因，能够产生与宿
主相同或相似的药用活性成分，并具有多种生理活
性［４］。对东北红豆杉内生菌研究结果表明，东北红豆
杉内生菌能产生一种或多种植物病原菌的抑制剂［５］，
但对返魂草黑斑病的研究尚未见相关报道。本研究
从东北红豆杉分离出内生菌，研究其对返魂草黑斑病
抑制效应，为合理开发利用东北红豆杉内生菌及某些
植物病害生物防治提供理论依据。
１ 材料和方法
１．１ 材料
１．１．１ 材料来源 供试菌种之一是经过分离纯化后
的返魂草黑斑病的病原菌，由本实验室保存；东北红
豆杉取材于通化师范学院植物园，采集时注意树皮带
有木质部并迅速放入无菌材料袋，经妥善处理后带回
作者简介：夏广清（１９７２－），博士，副教授 ．主要研究方向：生物化
学与分子生物学。
实验室供试。
１．１．２ 培养基 固体培养基包括水琼脂平板固体培
养基和ＰＤＡ固体培养基［６］，液体培养基是ＰＤＡ液体
培养基．ＰＤＡ液体培养基：将２００ｇ新鲜的马铃薯洗
净去皮，切成小块后加入适量蒸馏水，煮沸３０ｍｉｎ，纱
布过滤，取滤液，加入葡萄糖２０ｇ，加蒸馏水定容至
１ ０００ｍＬ，１．０５ｋｇ／ｃｍ２ 高压蒸汽灭菌３０ｍｉｎ［７］；ＰＤＡ
固体培养基：向上述ＰＤＡ液体培养基中加入１５ｇ的
琼脂粉后灭菌；水琼脂平板固体培养基：７ｇ琼脂，１Ｌ
水，１．０５ｋｇ／ｃｍ２ 高压蒸汽灭菌３０ｍｉｎ［８］。
１．２ 实验方法
１．２．１ 分离纯化东北红豆杉内生菌 分别取东北红
豆杉的主干和侧枝，剪成５ｃｍ的小段，用土温摇床振
荡１０ｍｉｎ后，用自来水冲洗红豆杉样品，以７５％酒精
浸泡１～２ｍｉｎ，升汞液浸泡约１０ｍｉｎ后，取出用无菌
水反复冲洗５次后待分离。分离前先用无菌滤纸吸
净树段上的无菌水，按无菌操作技术，削去黑色表层，
切取或剪取红豆杉小块树皮，约０．５ｃｍ×０．５ｃｍ大
小，置于水琼脂平板固体培养基上，在２５℃下避光培
养５～７ｄ，待树皮表面上菌丝萌发时，取大约５ｍｍ×
５ｍｍ顶部长有菌丝的琼脂块，转接到ＰＤＡ固体培养
基上，置２５℃培养３～５ｄ，切取同样大小的菌丝块再
接入ＰＤＡ固体培养基上，相同条件下培养，如此转接
３～５次以上，经过不断反复纯化培养即获得红豆杉内
生菌菌株 ．纯化后的菌种保存在ＰＤＡ 斜面培养基
上，放入冰箱中４℃保存备用。
１．２．２ 东北红豆杉内生菌对返魂草黑斑病病原菌的
抗性测定 本实验采用菌丝生长速率法进行测定。
在无菌条件下，在ＰＤＡ固体平板培养基上加入不同
浓度东北红豆杉内生菌的菌液，然后将制备好的菌片
接在ＰＤＡ培养基上，菌丝朝下，于２５℃恒温箱中培
养，每个处理３次重复。
培养３ｄ后开始测量培养皿菌落直径。每天测量
菌落直径，观察菌落形态、颜色，然后根据３次重复的
结果，算出各个处理菌丝的平均直径，与不加内生菌
菌液（空白对照）ＰＤＡ培养基上菌丝直径相比，计算不
DOI:10.13456/j.cnki.lykt.2013.10.007
森林保护 Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＦＯＲＥＳＴＲＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ３７
二
○
一
三
年
第
十
期
林
业
实
用
技
术
同浓度内生菌菌液对返魂草黑斑病病原菌菌丝生长
的抑制率［９］。将第５天的菌落直径换算成抑制率，进
而分析不同浓度东北红豆杉内生菌菌液对返魂草黑
斑病病菌的抑制作用。
抑制率＝
对照菌落直径－处理菌落直径
对照菌落直径 ×１００％
２ 结果与分析
２．１ 东北红豆杉内生菌的分离培养及形态学观察
２．１．１ 菌落群体形态 菌株在ＰＤＡ培养基上生长
迅速，因此将ＰＤＡ培养基作为固体形态观察培养基，
该菌在生长初期菌落直径较小，边缘较整齐，且呈白
色绒毛状。随着培养时间的延长，菌落直径逐渐增
大，培养至３～４ｄ时，菌落直径４．１～４．８ｃｍ，颜色逐
渐由白色变为灰褐绿色或暗绿色，菌落厚度约０．３
ｃｍ，如图１。
２．１．２ 菌落个体形态 菌丝暗色，多分支，有隔，径
为２～６μｍ，分生孢子梗细长，多呈树状分支，枝常对
生，顶端膨大成球型，为分生孢子囊，其中充满着大量
的分生孢子。
２．２ 东北红豆杉内生菌的抑菌实验
图１ 东北红豆杉内生东北红豆菌的形态学观察
Ａ，Ｂ：菌落形态特征；Ｃ：菌丝体；Ｄ：分生孢子梗和分生孢子
在用不同浓度东北红豆杉内生菌菌液处理的ＰＤＡ培
养基上生长的黑斑病病原菌的菌落大小（２５℃避光培
养５ｄ）见表１。从表中可知，东北红豆杉内生菌对返
魂草黑斑病原菌具有明显的抑制效果，且随着东北红
豆杉内生菌菌液浓度的增加，其抑菌效果越明显，最
高抑制率可达４３％。
表１ 东北红豆杉内生菌对返魂草黑斑病的抑制效应
菌液浓度 菌落直径／ｃｍ 平均值／ｃｍ 抑制率／％
原液 １．６ １．４ １．１ １．２ １．３ １．８ １．５ １．１ １．５ １．７ １．４２ ０．４３
１∕２ １．４ １．８ １．９ １．３ ２ １．６ １．６ １．４ １．３ １．６ １．５９ ０．３６
１∕３ ２．２ １．４ １．９ ２．０ １．７ １．８ １．８ １．８ ２．１ ２．０ １．８７ ０．３２
１∕４ １．８ １．７ １．７ １．９ １．９ ２．１ ２．２ １．８ １．９ １．９ １．８９ ０．２５
１∕５ ２．３ ２．４ ２．５ ２ ２．４ ２．２ ２．２ １．８ ２．０ ２．２ ２．２ ０．１２
０（ＣＫ） ３ ２．５ ２．２ ２．２ ２．０ ３．５ ２．１ ２．５ ２．４ ２．７ ２．５１ ０
３ 讨论
药用植物特别是中草药是个宝库，内生菌更是新
兴的资源，研究药用植物的内生菌，发现新成分，对于
解决部分药用植物匮乏的问题，提高药物疗效具有一
定的价值与开发潜力。通过实验，让我们对目前国内
研究较少的植物内生菌的功能有了更进一步的认识，
为我们更好的了解内生菌的功能打下了坚实的基础。
同时，也为返魂草黑斑病的生物防治提供了依据，减
少对返魂草造成的经济损失，进而提高返魂草药材的
质量和产量。
参考文献：
［１］ 秦佳梅，朱俊义，张卫东主编 ．长白山药用植物栽培技术
［Ｍ］．长春：吉林科学出版社，２００５．
［２］ 孙 华，张卫东，冯玉斌，等 ．返魂草黑斑病发病规律及
防治药剂筛选初报［Ｊ］．通化师范学院学报，２００７（２）：
５０－５２．
［３］ 李 强，刘 军，周东坡，等 ．植物内生菌的开发与研究
进展［Ｊ］．生物技术通报，２００６（３）；９５－９７．
［４］ 丁仁伟，邓 毅 ．药用植物内生菌活性成分及药效研究
进展［Ｊ］．西部中医药，２０１２（３）：１０９－１１３．
［５］ 李桂玲，王建峰，黄耀坚 ．几种药用植物内生真菌抗真菌
的初步研究［Ｊ］．微生物学通报，２００１（６）：６４－６８．
［６］ 王 坚，刁治民，徐 广 ．植物内生菌的研究概况及其应
用［Ｊ］．青海草业，２００８（３）：５６－５８．
［７］ 阮丽军 ．植物内生菌生物活性物质的研究［Ｊ］．上海医药
工业研究院，２００６（１０）：４１－４３．
［８］ 吴芳婷，陈代杰，钱秀萍 ．植物内生菌生物活性物质研
究新进展［Ｍ］．中国抗生素杂志，２００４（３）：１５－１８．
［９］ 方中达 ．植病研究方法［Ｍ］．北京：农业出版社，１９９８．★