全 文 ：　　文章编号: 1672-6685( 2004) 04-0055-03
两种红豆杉属植物细胞悬浮培养生产紫杉醇的初步研究
⒇
唐丽娟
(淮海工学院 化学工程系 ,江苏 连云港　 222005)
摘　要: 进行了不同培养条件对东北红豆杉悬浮细胞生长影响的研究 ,比较了东北红豆杉 ( T .
cuspidata )和曼地亚红豆杉 ( T . media )悬浮细胞体系中紫杉醇的生产量。结果表明 ,东北红豆杉细
胞悬浮培养适宜的接种量是 2 g /瓶、培养基为 B5基本培养基、蔗糖质量浓度 20～ 30 g /L时悬浮培
养细胞的生长较好。东北红豆杉悬浮细胞在 B5培养基中质量浓度为 0. 127 mg /L,曼地亚红豆杉悬
浮细胞在 B5培养基中质量浓度为 0. 487 mg /L。
关键词: 东北红豆杉 ;曼地亚红豆杉 ;细胞悬浮培养 ;紫杉醇
中图分类号: Q813. 1　　　文献标识码: A
Taxol Production by Cell Suspension Culture from Two Taxus Species
TANG Li-juan
( Dept. of Chemical Eng ineering , Huaihai Institute o f Technolog y, Lianyungang 222005, China )
Abstract: The effect of dif ferent cultural condi tions on suspension cell grow th is studied, and the
yields of taxo l in the cell suspension f rom T . cuspidata and T . media are compared. Resul ts
show tha t the optimum inocula tion amounts and mediums a re respectiv ely 2 g /f lask, B5, and 20
～ 30 g /L of sucrose concentration. The tax ol mass concentra tions in cell suspension f rom T .
cuspidata and T . media in media B5 are respectiv ely 0. 127 mg /L and 0. 487 mg /L.
Key words: T . cuspidata; T . media; cell suspension culture; taxo l
0　引言
紫杉醇 ( tax ol )最初是从短叶红豆杉 ( Taxus
brev ifol ia)的树皮中分离出的有抗肿瘤活性的二萜
生物碱 [1 ]。目前临床上使用的紫杉醇主要从各红豆
杉属的树皮中提取 ,此方法不但产量低而且造成该
属植物野生资源被破坏。因此 ,解决紫杉醇的来源问
题引起了人们的关注。1991年自 Christen等获得红
豆杉细胞培养的第一个专利以来 [ 2] ,已有 10种红豆
杉属植物细胞悬浮培养得到了国内外广泛的研究 ,
该技术已成为商品化生产紫杉醇的优选方法 [ 3] ,而
商品化生产紫杉醇主要取决于增加产物量 [4 ]。 目前
的紫杉醇产量对于商业需求来说仍比较低 ,所以 ,研
究人员致力于优化细胞悬浮培养条件 ,并采用基因
工程等手段改良细胞系 [5 ]。本文利用东北红豆杉和
国内没有报道的曼地亚红豆杉作为研究材料进行其
细胞悬浮培养条件和紫杉醇生产的研究 ,以期获得
实验室水平含量的紫杉醇。
1　试验部分
1. 1　材料、试剂与仪器
建立细胞悬浮系的愈伤组织为实验室继代培养
4～ 5次。二氯甲烷、甲醇、乙腈、三氧化铬、依文斯蓝
等为分析纯 ,紫杉醇标准品购自中国药品生物制品
检定所。
TU-1901型紫外扫描分光光度计 , BS-2F恒温
振荡培养箱 ,高速离心机 ,真空旋转蒸发仪 ,烘箱 ,精
第 13卷 第 4期
2004年 12月 淮海工学院学报 (自然科学版 )Journal of Huaihai Institute o f Techno lo g y Vol. 13　 No. 4Dec. 2004 　
⒇收稿日期: 2004-08-31;修订日期: 2004-11-22
确到万分之一的电子天平 ,细胞悬浮培养瓶为 100
m L三角瓶。
1. 2　细胞悬浮培养条件
每个培养瓶装 25 mL培养基 (均已高压灭菌 ) ,
在培养箱中 120 r /min, 25℃黑暗振荡培养。
1. 3　悬浮细胞鲜重测定
每瓶悬浮细胞鲜重为取样时将悬浮细胞液在离
心机上以 4 000 r /min离心 20 min后称量而得。每
瓶可增鲜重 ( g )= 每瓶悬浮细胞鲜重 ( g ) -接种量
(g )。
1. 4　紫杉醇的检测
紫杉醇少量溶于胞外 ,大部分储存在胞内 [6 ] ,故
采用以下方法处理样品。 细胞悬浮培养 20 d后取
样 , 4 000 r /min离心 20 min,沉淀细胞于 - 20℃冷
冻 1 d后转入研钵 ,研磨至匀浆状态后与上清液混
合 ,再加入等体积的二氯甲烷和甲醇混合液 (体积比
为 10∶ 1)重复萃取 3次 ,收集有机相 , 30℃减压旋
转蒸发 ,残留物用 2 m L二氯甲烷溶解 ,加入 2 mL
蒸馏水混合 , 5 000 r /min离心 20 min,收集二氯甲
烷部分并在 25℃下干燥 ,然后将残留物溶于 2 mL
乙腈中备用 ,在紫杉醇特征波长下进行紫外扫描。
2　结果与讨论
2. 1　愈伤组织接种量对悬浮细胞生长的影响
细胞悬浮培养中首先进行了东北红豆杉愈伤组
织接种量对其细胞生长率和活率影响方面的试验 ,
生长率 ( g /( L· d ) )= 每瓶可增鲜重 ( g )× 40 /培养
天数 ,细胞活力的测定用质量分数为 0. 05%依文斯
蓝染色 (染色的为死细胞 ,未被染色的为活细胞 ) ,结
果如图 1和表 1所示。
图 1　接种量对悬浮细胞生长率的影响
Fig. 1　 The ef fect of inoculat ion amount on the growth
ratio of cell suspension
由图 1可以看出 ,在接种量低于 0. 8 g /瓶时细
胞生长较慢 ,当接种量达到 1. 2 g /瓶时生长率上升
较快 ,此后又缓慢上升 ,直到 2. 0 g /瓶时达到最大。
说明细胞密度需积累到一定程度才有利于细胞悬浮
生长 ,接种量稍大或稍小不利于细胞生长。
表 1　接种量对细胞活率的影响
Table 1　 The eff ect of inoculation amount on the active
ratio of cell suspension
接种量 /( g /瓶 ) 细胞平均活率 /% 0. 05显著性 0. 01显著性
1. 2 88. 2 a A
1. 6 87 a A
2. 0 84. 8 a A
2. 4 75. 6 b A
表 1结果表明接种量对细胞活率的影响不是很
大。 2. 4 g /瓶的接种量与其他 3种有显著差异 ,这可
能是因为接种量大 ,养分不足 ,致使细胞死亡数增
多。 但 4种接种量未达到极显著的水平差异。综合
图 1和表 1结果 ,细胞悬浮培养接种量以 2. 0 g /瓶
较适宜。
2. 2　适宜培养基的选择
用三氧化铬溶液使东北红豆杉细胞分散形成均
匀的悬浮液 ,然后用血球计数板计数得细胞密度进
行比较。如图 2所示 , 3种培养基中细胞数目增长的
变化情况表现为一条“ S”形曲线。 东北红豆杉细胞
悬浮培养适宜继代时间是 14 d。 B5, M S和 6, 7-V 3
种基本培养基的比较结果表明 ,悬浮细胞在 B5培
养基较在 M S和 6, 7-V上有更好的生长势头 ,细胞
增殖较快 , M S次之 ,细胞在 6, 7-V培养基上生长情
况波动较大 ,刚开始增殖速度均低于 B5和 MS,后
期与 MS相当 ,但仍未高于 B5。 所以 , B5较适合细
胞悬浮培养。
图 2　培养基对悬浮细胞生长的影响
Fig. 2　 The eff ect of media on the growth of cell suspension
2. 3　蔗糖质量浓度对悬浮细胞生长的影响
蔗糖浓度作为营养条件和影响细胞悬浮性状的
因素而起着重要作用 [7 ]。 本实验中不同蔗糖质量浓
56 淮海工学院学报 (自然科学版 ) 2004年 12月　
度对悬浮细胞生长的影响结果如图 3所示。
图 3　不同蔗糖质量浓度对悬浮细胞生长率的影响
Fig. 3　 The eff ect of sucrose concentration on the growth
ratio of cell suspension
结果表明 ,不同质量浓度的蔗糖对东北红豆杉
悬浮细胞的生长有很大影响。在蔗糖质量浓度为 20
～ 30 g /L时 ,悬浮培养细胞的生长率较高 ;当质量
浓度低于 10 g /L时 ,细胞生长率急剧下降 ;当质量
浓度高于 30 g /L时 ,细胞生长率也呈下降趋势。
2. 4　细胞悬浮体系中紫杉醇含量的测定
将曼地亚红豆杉在与东北红豆杉试验相同的
B5培养基上建立细胞悬浮系 ,悬浮培养条件相同 ,
以测定二者在同种培养基上的紫杉醇生产能力。
庄晓蕾等用紫外扫描法进行紫杉醇的定量检
测 [8 ] ,其平均回收率为 91. 82% ( HPLC)。本试验首
先用薄层层析 ,待样品显示紫杉醇特征斑点后用紫
外扫描法检测紫杉醇含量。经测定 ,样品特征波长与
紫杉醇标准品的特征波长相同 (如图 4所示 ) , 紫杉
醇在 227. 5 nm波长下有明显的特征吸收峰。紫外
扫描测定结果显示 ,东北红豆杉悬浮细胞和曼地亚
红豆杉悬浮细胞在 B5培养基中紫杉醇质量浓度分
别为 0. 127 mg /L和 0. 487 mg /L。可见两种红豆杉
细胞悬浮培养均有生产紫杉醇的能力。
3　结论
研究结果表明 ,本文所选的细胞悬浮培养适宜
条件是接种量 2. 0 g /瓶 ,以 B5为基本培养基 ,蔗糖
质量浓度为 20～ 30 g /L。 在紫杉醇生产量测定中 ,
东北红豆杉和曼地亚红豆杉在同种培养基 B5上 ,
均具有生产紫杉醇的能力。
图 4　紫杉醇紫外扫描
Fig. 4　 The Uv-scan chromatogram of taxol
参考文献:
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作者简介:唐丽娟 ( 1977- ) ,女 ,辽宁大连人 ,淮海工学
院化学工程系教师 ,硕士 ,主要从事制药方面的研究。
(责任编辑: 秦海明 )
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