全 文 ：·1838· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
体外血小板聚集，其作用与加入药物的质量浓度呈
剂量依赖关系，且质量浓度为25．0／-g／L的VSRN
对血小板聚集的抑制作用与40mg／L的LAS相
近。见表3。
表3 VSRN对大鼠体外血小板聚集的影响。士s，席一10)
Table3 EffectofVSRNoninvitroplateletaggregation
ofrats(j士s。露一10)
与NS组比较：一P<0．01
’‘P3讨论
本实验研究采用经典的电刺激诱发大鼠颈总动
脉血栓形成模型和瘀血诱发大鼠下腔静脉血栓形成
模型以评价VSRN的抗动、静脉血栓作用。结果表
明：VSRN具有显著的血栓形成抑制效能和强大的
抗血栓强度。本研究组在以往研究VnA时，曾发现
其抗血栓有效剂量为7．2～42．9,ug／kg，本次实验
发现VSRN的抗栓有效剂量为1．25一-5／-g／kg。由
此可见VSRN的抗栓作用强于VnA[8]。这些结果
可以说明：VSRN为VnA中重要抗栓活性成分。本
研究中还发现VSRN在5．00～20．00／卫g／kg剂量，
其抗动脉血栓作用随剂量增加不仅不增加，反而降
低；但其抗静脉血栓作用强度与其剂量呈依赖关系，
该现象的机制有待阐明。
本研究还表明VSRN尚具有强大的体内外血小
板聚集抑制活性，这提示该活性成分的抗血栓作用与
其抗血小板聚集作用有关。以上结果表明：乌苏瑞宁
为乌苏里藜芦总碱中重要的抗栓活性成分之一。
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眼镜蛇毒细胞毒素CTX—d诱导NB4细胞凋亡及其机制研究
陈纯，陈崇宏+
(福建医科大学药学院药理系，福建福州 350004)
摘 要：目的 探讨眼镜蛇毒细胞毒素CTX—d诱导NB细胞凋亡的机制。方法MTT法测定CTX—d体外细胞毒
作用，电镜、流式细胞仪观察CTX—d对NB4细胞的诱导凋亡作用，流式细胞仪检测NB4细胞线粒体膜电位的变
化，Western—blotting测定胞浆细胞色素c及caspase一9、caspase一3的变化。结果CTX-d作用NB4细胞6、12h的
IC。。分别为1．8、1．35tlg／mL；CTX—d引起NB4细胞线粒体肿胀、核固缩等形态学改变；诱导NB4细胞出现亚G-
期的凋亡峰，且有时效及量效关系；CTX—d(1．0tug／mL)作用0．5h，NB4细胞线粒体膜电位已开始下降，同时在
胞浆中检测到细胞色素C，显示细胞色素C已由线粒体释放入胞浆；easpase一9酶原的量在CTX—d(1．0}tg／mL)作
用1h时开始下降，而活化的easpase一3片断在0．5h即检测到，表明除了通过caspase一9,CTX—d还可能通过其他
途径激活caspase一3。结论CTX—d可通过降低线粒体膜电位、细胞色素c释放，激活caspase一9和caspase-3，从而
诱导NB4细胞凋亡，还可能通过其他途径激活caspase一3，参与凋亡作用。
收稿日期：2007—05—17
作者简介：陈纯(1972一)，女，博士，讲师，专业方向为抗肿瘤药物药理。
Tel：(0591)83756200Fax：(0591)83756200E—mail：chenchun--0428@163．corn
*通讯作者陈崇宏E—mail：chench2008@163．corn
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1839·
关键词：眼镜蛇毒；细胞毒素(cTxs)；凋亡；线粒体
中圈分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)12～1838—05
InductionofCTX-dfromcobravenomsonNB4apoptosisandtsmechanism
CHENChun。CHENChong-hong
(DepartmentofPharmacology，FujianMedicalUn versity，Fuzhou350004，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectsofCTX—dfromvenomsofcobra(Najanajatra)on
inducingNB4apoptosisanditsmechanism．MethodsTTwasu edtodetecttheantitumoreffectof
CTX—dinvitro；Electronmic oscopeandflowcytometrywe eusedtoobservethapoptoticinducingeffect
DfCTX—dinNB4cells；Mitochondrialtransmembranepotentialchange(△甲m)wasanalyzedbyflow
cytometry；Thelevelsofcaspase一9，caspase一3，andcytochromeCinthcytosolfractionwereanalyzedby
Westernblotting．ResultsTheIC50valuesofCTX—daffectedonNB4eellfor6and12hwere1．8and
1．35}￡g／mL，respectively．CTX—dcou dinducemorphologicalchanges，sucha condensedchromatinnd
swellingmitochondriainNB4cells．Analyzedbyflowcytometry，CTX-dinduceapoptosisinNB4cells
evidencedbyincreasingsubG1cellpopulationinadose-andtime—dependent-manner．Themitochondrial
membranepotentialofNB4cellshadalreadydecreasedwheni cubatedwithCTX—d(1．0肛g／mL)for0．5
h，andcytochromeCinthcytosolwasdetectedsimultaneously，whichindicatedt releaseofcytochrome
Cfrommitochondriatocytos01．Thecaspase-9wasactivatedinitiallyt1hafter1．0弘g／mLCTX—d
treatment，whereasthecleavageofcaspase一3wasdetectedat0．5h．Thissuggestedthatsomeother
mechanismmaybeinvolvedincaspase一3activation．ConclusionThere ultssuggestthatheJOSSof
mitochondrialmembranepot ntialandthereleaseofcytochromeCfromthemitochondriaintothecytosol
arethearlyeventsofCTX—donNB4apoptosis．Oncereleaseintothecytos01．cytochromeCprecedesth
activationofcaspase—·9and·—3toleadingtotheapoptosisandtherearemaybesomeothermechanism
involvedincaspase-3activation．
Keywords：venomsofNajan jaatra；cytotoxins(CTXs)；apoptosis；mitochondria
眼镜蛇毒细胞毒素(cytotoxins，CTXs)又称
膜毒素，来源丰富，抗肿瘤作用强，在蛇毒抗肿瘤作
用的研究中占首要地位[1~3]，但其作用机制仍不清
楚。多数学者认为CTXs与细胞膜结合，依赖其特
征性的空间结构“三指”插入细胞膜中形成孔道，可
能影响细胞内外离子的平衡，引起纽胞肿胀、破
裂14～7]。最近由不同研究室的学者在激光共聚焦显
微镜下分别观察到，CTX在数分钟内进入线粒体并
破坏线粒体结构[8]，以及CTX轻易进入活的肿瘤
细胞内并浓集于溶酶体(ArsenievAS)[9]，且其中
的量与CTXs的细胞毒作用密切相关，表明CTXs
作为小分子多肽，确实能轻易地通过细胞膜，在极早
期作用于胞内膜结构，由此提示CTXs影响线粒体
及溶酶体等胞内膜结构的功能可能是其早期主要作
用机制。研究显示线粒体是细胞凋亡调控的中心环
节之一。线粒体感受多种刺激发生线粒体渗透性转
变孔(MPTP)开放，释放膜间隙中的促凋亡蛋白细
胞色素C和凋亡诱导因子AIF等。释放到细胞浆的
细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡蛋白
酶激活因子一l(Apaf一1)结合，从而召集caspase一9
形成凋亡体，被激活的caspase一9能激活下游的凋
亡效应分子caspase一3，经蛋白水解级联作用引起细
胞凋亡。
CTXs在数分钟内即进入细胞内与线粒体结
合，是否对线粒体信号通路有影响还不清楚。本研究
从眼镜蛇毒中分离纯化得到不含磷脂酶A。(PLA：)
的CTX-d，观察CTX—d对人早幼粒细胞白血病细
胞株NB4的致凋亡作用，着重研究CTX—d对NB4
细胞线粒体膜电位、细胞色素C的释放、caspase一9
及caspase一3的活性变化的影响，从线粒体信号途
径人手，探讨CTX—d的细胞内作用机制。
l材料
1．1药物：CTX—d，经CM—SepharoseFF阳离子交
换和RP—HPLC(C。。柱)，从眼镜蛇粗毒中分离提纯
获得不含PLA。的CTX—CTX—d，相对分子质量
6800，质量分数为98．4％。
1．2细胞株：NB4细胞株，福建医科大学附属协和
医院血液研究所提供。
1．3 主要试剂：RPMI一1640培养基，Gibco公司；
小牛血清，杭州江滨生物技术有限公司；MTT、NC
膜，上海华美产品；Rhodamine123，Sigma产品；一
抗：细胞色素C(SC一13560)，SantaCruz产品；
万方数据
·1840· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
caspase一3(SC一7148)，caspase一9(SC一8355)，Actin
(sc一1616)，碱性磷酸酶标记的二抗及显色剂BCIP／
NBT等均为北京中山产品；考马斯亮蓝蛋白定量试
剂盒，南京建成生物工程研究所；其他生化制剂均为
上海生工产品。
1．4主要仪器：CO。培养箱，SHELLAB；趋净工作
台；酶标仪，ThermoLabsystems；J2—21低温高速
离心机，Beckman；流式细胞仪EpicsXL，Coulter
公司。EC250一90电泳仪，DYCZ一40B型转移电泳
槽，北京六一仪器厂。
2方法
2．1 MTT法测定CTX—d对NB4细胞的抑制作
用：NB4细胞生长于含10％小牛血清的RPMI一
1640培养液，于37℃、5％CO：的饱和湿度条件下
培养。取对数生长期的细胞以2×10s／mL的初始浓
度接种于96孔培养板中，每孔160肛L，加入40弘L
不同质量浓度的CTX—d(dH。O稀释)，细胞对照组
只加等量RPMI一1640培养液，空白对照组加
RPMI一1640和等量dH。O，每组设3个平行孔。培养
6、12h，每孔加5mg／mLMTT20弘L，混匀后继续
培养4h，每孔加裂解液(10％SDS，5％异丁醇，12
mmol／LHCI)100弘L，混匀，裂解过夜，以空白对照
孔调零，在492am波长下测定各孔吸光度(A)值，
计算细胞生长抑制率，再以线性回归方程计算
其IC500
生长抑制率一(1一药物组平均A值／细胞对照组平均
A值)×100％
2．2 电镜观察超微结构：NB4细胞经加药处理后，
离心(2000×g，10min)收集细胞，加电镜固定
液，常规包埋、超薄切片、染色后，在透射电镜下
观察。
2．3流式细胞仪DNA倍体分析：NB4细胞加药后
分别培养3、6h，各组细胞均用4℃PBS洗两次，
70％乙醇4℃固定过夜，再用PBS洗涤1次，离
心，弃上清，碘化丙啶(PI)染色，室温避光孵育20
rain，流式细胞仪检测，用MuhicycleforWindows
软件进行DNA分析，以DNA的量低于G。期的亚
G。期细胞为凋亡细胞。每组样本数3。
2．4线粒体膜电位测定：Rhodamine123是一种阳
离子亲脂性荧光染料，能选择性地为线粒体所吸收，
其吸收值随线粒体跨膜电位的改变而改变，因此根
据细胞的荧光强度可反映线粒体跨膜电位的变化。
实验方法参考文献方法[10]，NB4细胞加药作用，不
同时间点离心收集细胞，PBS清洗两次，重悬细胞，
加入Rhodamine123(终质量浓度为10弘g／mL)，
37℃共同孵育30min，PBS清洗2次，上流式细胞
仪检测荧光强度。每组重复3次。
2．5 Westernblotting测定：NB4细胞经药物作用
后，收集细胞，以PBS洗两次，转入EP管，3000x
g离心5min，弃上清，加入裂解缓冲液(3×106细
胞加100弘L裂解液)，轻吹打，于4℃裂解30
min，细胞色素C以12000×g离心30min，
caspase一3、caspase一9以10000×g离心10min，吸
出上清，蛋白定量，每个样品加等量2×上样缓冲
液，沸水浴5min后备用，按照每个样品上样蛋白量
为30弘g，均以1×上样缓冲液调节至20弘L，上
SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶4％，分离胶
12％)。电泳后转膜，140mA4h，NC膜以丽春红染
色观察转膜效果，并标出各标准相对分子质量的位
置，以蒸馏水漂洗脱色，再加入含5％脱脂奶粉的
封闭液4℃封闭过夜，加一抗，室温作用2h，PBS
洗2次，TBS洗1次，加碱性磷酸酶标记的二抗，室
温作用1h，TBS洗3次，加入底物BCIP／NBT显
色。结果用图像分析仪进行条带密度分析，并计算与
p-actin的密度比。
细胞色素C所用裂解液：250mmol／LSucrose，
20mmol／LHepes—KOH，pH7．5，10mmol／LKCI，
1．5mmol／LMgCl2，1mmol／LEDTA，1mmol／L
DTT，0．1mmol／LPMSF，用于胞质蛋白提取。
Caspase一9、caspase一3所用裂解液：50mmol／L
Tris—HCl，pH8．0，150mmol／LNaCl，1mmol／L
PMSF，1mmol／LAprotinin，1％NP一40，用于总
蛋白提取。
2．6统计分析：实验结果以z土5表示，用DAS软
件进行t检验。
3结果
3．1 CTX—d体外细胞毒作用：CTX—d对NB4细胞
株具有明显的生长抑制作用，6、12h的IC。。分别为
1．8、1．35／19／mL，结果见表1。
表1 CTX—d对NB4细胞的生长抑制作用(；±s，厅一3)
Table1 Growthin ibitionofCTX．donNB4
cellinesG士s，庙一3)
药物质量浓度／
(1ug·mL一1)
生长抑制率／％
6h 12h
4
2
i
0．5
IC50
88．
51．
28．
11．
1． O
95．8
65．2
37．4
19．3
1．35
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1841·
3．2形态学观察：CTX—d(1．o；zg／mL)作用3h，
部分细胞核染色质凝聚、边缘化等(图l-A)典型凋
亡改变；线粒体肿胀明显，内嵴消失(图1一B)，显示
CTX—d可早期作用于NB4细胞线粒体，并引起凋
亡样改变。
图1 CTX-d(1．0tJg／mL)作用3hNB4细胞电镜图
Fig．1ElectronmicrographofNB4cellstreated
byCTX—d(1．0ug／mL)for3h
3．3流式细胞仪DNA分析结果：各组NB4细胞
经处理后上流式细胞仪进行DNA分析
(Multicycle软件处理)显示：0．5弘g／mLCTX—d作
用3h，亚G，期细胞增多不明显；1．0／19／mL及1．5
／zg／mLCTX-d作用3h，出现明显的亚G-期凋亡
峰。CTX—d(0．5、1．0、1．5／-g／mL)作用6h均出现
亚G，期凋亡峰，并与剂量成正相关，与对照组比较
差异显著(图2)。
摹、
留
最
，u
熙
踩
一
。
茸
1一对照组2～4-CTX—d0．5、1．0、1．5btg／mL
1-controlg up2—4一CTX-d0．5，1．0，and1．5肛g／mL
与对照组比较；。P。P图2 CTX—d对NB4细胞的诱导凋亡作用。士s，露=3)
Fig．2InductionofCTX—donNB4apoptosis
(；士s，捍一3)
3．4线粒体膜电位的变化：MPTP的开放常通过
检测线粒体跨膜电位的变化来反映。采用流式细胞
仪检测NB4细胞内Rhodamine123的荧光强度，
以荧光强度反映跨膜电位的变化，结果显示，CTX—d
(1．0；zg／mL)作用0．5h，NB4细胞跨膜电位已开
始下降，随着作用时间延长，下降程度逐渐加大，3h
最明显(41．9％±6．7％的细胞荧光强度降低，见
图3)，表明CTX—d作用在线粒体上，引起线粒体跨
膜电位下降，MPTP开放。
摹＼
蜊
疆
米
斌
与对照组(Oh)比较：+P<0·05～P。P图3 CTX—d(1．0vg／mL)作用不同时间NB4细胞
线粒体膜电位的变化(；士j，咒一3)
Fig．3Mitochondrialmembranepotentialch nges
ofNB4cellstreatedbyCTX—d(1．0vg／mL)
fordifferenttimes(；士s，n一3)
3．5 Westernblotting结果：见图4。经CTX—d
(1．0／lg／mL)处理0．5h，NB4细胞胞浆中检测到
细胞色素C，且在3h内随着作用时间延长，胞浆中
的量逐步增多。显示在CTX—d作用早期，细胞色素
C即由线粒体释放入胞浆，发生时间及变化趋势与
线粒体膜电位的下降相符。
NB4细胞中caspase一9酶原的量在CTX—d作
用0．5h时无明显变化。作用1hcaspase一9酶原的
量开始下降，表明caspase一9被活化。活化的
caspase一3片断(17ooo)在CTX—d作用0．5h即
检测到；作用3h，活化片断明显增加。表明CTX—d
作用0．5h时，caspase一9尚未被活化，caspase一3已
激活。
图4 CTX—d(1．0ug／mL)作用。0．5、1、3h对NB4细胞
中caspase一9、caspase一3及胞浆细胞色素c的影响
(；土s，弹一3)
Fig．4EffectofCTX-d(1．0IJg／mL)oncaspase一9，
caspase一3，andcytochromeCincytosol
fractionofNB4cellstreatedfor0．5，1，
and3h(i士s，万一3)
万方数据
·1842· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
4讨论
本实验结果显示CTX—d对人早幼粒白血病细
胞NB4具有促凋亡作用。本实验在电镜下观察到，
CTX—d(1．0弘g／mL)作用于NB4细胞3h，即出现
典型凋亡改变及线粒体结构改变。NB4细胞经不同
剂量CTX—d处理后上流式检测，作用3h，1．0弘g／
mL及1．5pg／mLCTX—d出现明显的亚G1期凋亡
峰；作用6h，CTX—d(O．5、1．0、1．5／zg／mL)均出现
亚G。期凋亡峰，并与剂量成正相关。可见，诱导凋亡
是CTX—d对NB4细胞的早期主要作用，且CTX—d
对NB4细胞的诱导凋亡作用具有剂量依赖及时间
依赖关系。Chia等E11]报道，CTX对神经元细胞的作
用以凋亡为主，对心肌细胞和胶质细胞以坏死为主。
Feofanov[123等从眼镜蛇毒中分离的CTX可致
HL60细胞坏死。本实验结果显示CTX—d作用早
期，NB4细胞以凋亡为主。
近年来的研究还表明，诱导肿瘤细胞凋亡是许
多抗癌药物的作用机制之一。凋亡主要有两条途径：
一条是胞外信号激活细胞膜表面Fas／FasL受体
(CD95)，从而激活caspases酶级联反应；另一条是
通过线粒体途径激活caspases。本实验首次证实
CTX—d对NB4细胞线粒体信号通路的影响：CTX—
d(1．0t卫g／mL)作用0．5h，NB4细胞线粒体膜电
位已开始下降，细胞色素C由线粒体释放人胞浆，
膜电位的下降与细胞色素C的释放两者变化趋势
相符。另外，caspase一9酶原的量在CTX—d(1．0／zg／
mL)作用1h时开始下降，而活化的caspase一3片
断(17000)在0．5h即检测到，表明除了通过
caspase一9，CTX—d还可能通过其他途径激活
caspase一3。结果显示，CTX—d可通过降低线粒体膜
电位、细胞色素C释放、caspase一9被活化、激活
caspase一3等诱导凋亡，还可能通过其他途径激活
caspase一3，参与凋亡作用。
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甜菜碱对HepG2人肝癌细胞[Ca2+]t和细胞膜电位的影响
季宇彬，杨红丹，高世勇，何立巍
(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站，黑龙江哈尔滨 150076)
摘要：目的研究甜菜碱对肝癌HepG。细胞内游离ca2+浓度([ca2+]i)和细胞膜电位的影响。方法Fluo一3／AM
标记，激光扫描共聚焦显微镜观察HepG：细胞[Ca2+]；，TMRE标记，激光扫描共聚焦显微镜测定细胞膜电位的影
响。结果甜菜碱能够升高HepG。细胞[Ca2+]。，降低细胞膜电位。升高[Ca抖]。的强度具一定的剂量依赖性，随甜
菜碱剂量的增大而升高。甜菜碱50、25mg／mL组与对照组比较差异非常显著(P收稿日期：2007—06—20
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30400352)；教育部重点项目(205045)；黑龙江省自然科学基金资助项目(D200611)I黑龙江
省研究生创新基金资助项目(YJSCX2006—0077HSD)
作者简介：季字彬(1956一)，男，教授，博士生导师，研究方向为肿瘤药理学的研究。
万方数据
眼镜蛇毒细胞毒素CTX-d诱导NB4细胞凋亡及其机制研究
作者： 陈纯， 陈崇宏， CHEN Chun， CHEN Chong-hong
作者单位： 福建医科大学药学院,药理系,福建,福州,350004
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(12)
被引用次数： 2次

参考文献(12条)
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8. 王计良.蔺俊文.史泽晋.台英杰.任洁.何毅刚.黄华元.何世勇.WANG Ji-liang.LIN Jun-wen.SHI Ze-jin.TAI
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引证文献(2条)
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响[期刊论文]-中华肝胆外科杂志 2010(4)
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