全 文 ：中革焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2007年9月
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赤芍总苷对HepA肝癌小鼠肿瘤细胞凋亡的影响
许志玉1，陈志伟2，王继峰1，沈丽霞1，梁欣韫1，牛建昭”
(1．北京中医药大学细胞生化实验室，北京100029}2．齐齐哈尔医学院组胚教研室，黑龙江齐齐哈尔161042)
摘要：目的撵讨赤芍总苷对HepA肝癌小鼠肿瘤生长及肿瘤细胞凋亡的影响厦其机制。方法60只健康昆明
小鼠t随机分5组，分别为模型组，环磷酰胺(100mg，kg)组，赤芍总苷(240、120mg／kg)组·环磷酰胺(100rag／
kg)+赤芍总苷(240mg／kg)组。复制小鼠HepA肝癌皮下移植模型后，第2天ig给药，连续给药7d，第8夭处
死，取肿瘤组织．计算抑瘤率，流式细胞仪检测肿瘤细胞搠亡串和分析细胞周期，以及免疫组化法检测凋亡相关蛋
白Eel一2和Bax的表达。结累赤芍总苷高、低剂量明显抑制HepA肝癌小鼠肿瘤的生长}肿瘤细胞捐亡指数增
加}抑制肿瘤细胞Go／G。期比例。向S期细胞转化t凋亡率增高，下调肿瘤细胞中Eel-2蛋白的表达，同时明显提高
肿瘤细胞中Bax蛋白的表达。结论赤芍总昔对HepA肝癌小鼠肿瘤生长有明显抑制作用，并诱导肿瘤细胞捅亡，
其主要机制与调节Eel一2和Bax蛋白表达有关。
关奠词：赤芍总苷}肝癌HepA，凋亡
中圈分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)09—1364—04
Efleetofotalg ucosidesfromRadixPaeoniaeRubraOilapoptosis
ofhepatomacellinmice
XUHui—yul．CHENZhi—wei2，WANGJi—fen91，SHENLi—xial，LIANGXin—yunl，NIUJian—zha01
(1．LaboratoryofCellandBiochemistry，BeijingUdiversityofTraditionalChineseMedicine，Beijing100029，China·
2．DepartmentofHis oembryo，QiqihaerCollegeofM dicine·Qiqihaer161042，China)
Abstract：ObjeetiveToinvestigatetheinhibitoryeffectof hetotalg ucosidesfromRadixPaeoniae
RubraonthegrowthandapoptosisfhepatomacellsHepAanditsmechanism．MethodsKMMice(60)
inoculatedwithepatomacellswererandomlydividedintofivegroups：themodelgroup，the
cyclophoshamide(CY，100mg／kg)group，thegroupswithhigh—andlow—doses(240and120mg／kg)of
thetotalg ucosidesfromRadixPaeoniaeRubrathegroupwithcombinationofCY(100mg／kg)andhigh-
dose(240mg／kg)ofthetotalg ueosidesfromRadixPaeoniaeRubra，igadministrationw sg yentothe
miceindayZ，respectively．Theadministrationlasted7d，thenthemiceweresacrificedatday8andthe
tumortissuewasweighed．Theinhibitoryrateswerecalculatedbyweighingthetumorseparately}The
flowcytometer(FCM)wasusedtodeterminetheapoptosisratesofhepatomacells；Theexpressionlevels
ofBcl一2andBaxofthehepatomacellswereassayedbyimmunohistochemistry．ResultsThehepatoraa
收稿日期：200609—29
基盒项目r国家自然科学基金资助(305404200032}30510403202)}长江学者和创新团队发展计蜘资助(mT0413)，博士点基金赍助项
目(20050026012)·齐齐哈尔市科学技术计划重点项目
作者筒介。许惠玉(1973一)，女(朝鲜族)，讲师．2005级博士生，研究方向为中药抗肿瘤．
Tel：(010)64287538Email：czwzI_’@tom．corn
-通讯作者牛建昭TelI(010)64286716E—maillaiuiJ站@263．net
万方数据
中草焉Chines*TraditionalmadHerbalDrugs第37卷第9期2007卑9月
cellsinbothhigh-andlow-dosesgroupswiththetOtalgl【ucosidesfromRadixPaeoniaeRubrawere
inhibitednasignificantdifferencecomparedwiththemodelgroup；Itisshowedthatthelargerdosageof
thetotalglucosidesfromRadixPaeoniaeRubrais，theigherinhibitoryratesaref TheproportioninGo／
GlperiodcellscouldbeinhibitedandmadetotransfertoSperiodcellandincreasetheapoptosisratesby
thetotalg ucosidesfromRadixPaeoniaeRubraIThexpressionlevelsofBcl一2couldbedecreasedwhile
thexpressionlevelsofBaXinhepatomacellscouldbeincreasedbythetotalglucosidesfromRadix
PaconmeRubrat．COItclusionThetotalg ueosidesfromRadixPa—eonioeRubrac ninhibitthegrowthof
hepatomacellssignificantlyandinducetheapoptosisfhepatomacells，whichmaybecloselyrelatedwith
regulatingthexpressionlevels01Bcl一2andBax．
Keywordstthetotalg ueosidesfromRadixPaeoniaeRubra；hepatomacellHepAlpoptosis
赤芍为毛茛科植物芍药Paeonialactiflora
Pall．或川赤芍P．veitchiiLynch的干燥根，味酸、
苦，性寒，人肝脾经，凉血、活血。动物实验证明，赤芍
具有解痉、扩张血管、镇痛作用。赤芍是重要的活血
化瘀中药，常以复方组成成分用于肿瘤和血瘀症的
治疗，尤以肝病常见。赤芍总苷系赤芍中的主要活性
部位．其主要有效成分包括芍药苷(3．1％～7．o％)
芍药内酯苷(o．1％)羟基芍药苷(O．06％)，苯甲酰
芍药苷(0．01％)等单萜苷类化合物。文献报道赤
芍总苷有明显的抑制肿瘤作用[1“】，本实验进一步
探讨其抑瘤作用及其分子机制。
1材料与方法
1．1动物及瘤株：健康昆明种小鼠，50只，体重
(20士2)g，均为雄性，由中国中医科学院提供。
HepA瘤株由北京肿瘤医院提供，第5代。
1．2主要药物和仪器：赤芍总苷由西安奥晶科技发
展有限公司提供，批号060417，质量分数>95％。环
磷酰胺，上海华联制药有限公司生产，批号011016。
Bcl一2、Bax即用型免疫组化试剂盒，DAB染色剂均
购于武汉博士德生物有限公司。Olympus显微镜，
HIMAs—1000病理图文分析系统，流式细胞仪
(FAcScan，Beckman公司)，由北京东直门医院检
验科提供。
1．3赤芍总苷对HepA荷瘤小鼠的影响
1．3，1分组及给药无菌剥取传代8d的HepA肝
癌癌块，研磨300目筛阿过滤，用生理盐水调整细
胞浓度至1×1矿，台盼蓝染色，光镜下瘤细胞计数，
活瘤细胞>90％。每只0．2mL接种于小鼠右腋部
皮下，24h后60只小鼠随机分为5组：模型组，环
磷酰胺组，赤芍总苷高、低剂量(240、120mg／kg)
组，联合用药组，各12只。模型组ig生理盐水0．4
mL／只I赤芍总苷组ig赤芍总苷120、240mg／kgl
环磷酰胺组生理盐水ig赤芍总苷0．4mL／只，第3
天ip环磷酰胺100mg／kg}联合用药组ig赤芍总
苷120mg／kg，第3天ip环磷酰胺100mg／kg。各
组在接瘤后第z天开始给药，连续7d后禁食，第8
天处死动物。根据各组小鼠死亡情况每组取10只
动物，准备组织处理，测定指标。
1．3．2指标测定：动物处死后，称体重，取瘤组织，
计算抑瘤率[抑瘤率=(1一给药组平均瘤质量／模型
组平均瘤质量)×100％]。
1．3．3凋亡指数测定：取各组小鼠的肿瘤组织，
10％甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染
色。于光学显微镜下观察，每张切片取5个不同坏死
视野，记数500个肿瘤细胞阳性细胞所占百分比，计
算凋亡指数(凋亡指数=凋亡细胞数／总细胞数)×
100％。
1．3．4免疫组化测定Bcl一2及Bax蛋白表达：瘤组
织切片常规脱蜡至水，加3％H：O。室温封闭10
rain，PBS洗，浸泡于0．01mol／L枸橼酸缓冲液，高
压后冷却至室温。滴加5％BSA封闭液37℃、20
min，l抗蛋白4℃过夜，PBS洗，I抗37℃、2
min，PBS洗，滴加SABC试剂37℃、20rain，PBS
洗，DAB显色。Bcl一2、Bax抗体为单克隆抗体(1t
100)，以PBS代替I抗作为阴性对照。
1．3．5细胞周期分析：取70％冷乙醇固定的细胞
样品，用PBS洗两次，以洗去残留的乙醇，加碘化丙
锭染液(4℃、避光30min)，用流式细胞仪检测细
胞周期的变化，测定凋亡率。
1．3．6图像分析方法；采集Bcl一2和Bax免疫组织
化学染色图像，用Image—ProPlus分析软件进行图
像分析，每组涂片取lo个视野测定小鼠肿瘤细胞
Bcl一2和Bax蛋白阳性产物的积分吸光度，取平均
值代表Bcl—2和Bax蛋白表达强度，吸光度值越大
表示阳性产物表达越强。
1．4统计学方法：实验所得数据用；士s表示，各组
数据先行方差齐性检验，再进行单因素方差分析。
2结果
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2007年9月
2．1抑瘤率的比较：见表l。结果显示治疗组均有
一定的抑瘤作用，与模型组比较差异显著。环磷酰胺
组抑瘤效果最好，但死亡率高，小鼠消瘦，毛稀疏，食
欲降低。赤芍总苷高剂量组与低剂量组比较瘤体较
小，两组小鼠状态良好，但抑瘤效果不如环磷酰胺
组。而联合用药组不但抑瘤效果好，而且小鼠的生存
质量高。
2．2凋亡指数比较：见表1。结果显示与模型组比
较，治疗组凋亡指数明显升高，差异显著。模型组坏
死区面积大，坏死细胞多，凋亡细胞少，而治疗各组
坏死面积相应缩小，坏死细胞少，而凋亡细胞增多。
表1赤芍总苷对荷瘤小鼠肿瘤质量及肿瘤细胞凋亡的
影响(i士j，”一10)
Table1 Effectof otalghcosidesofRadixPaeoiaeRubra
oiltumorweightandtumor且poptosisin umor-
bearingmice(z土$十n一10)
与梗型组比较：一P<0·01
。。P2．3对小鼠肝癌细胞Bcl一2和Bax蛋白表达的影
响：见表2。Bcl一2和Bax蛋白定位于胞浆，阳性产物
为棕黄色颗粒。模型组肿瘤细胞中Bcl一2蛋白表达
增强，治疗组肿瘤细胞组中Bcl一2蛋白表达减弱，两
者表达的差异非常显著(P与模型组相比，治疗各组肿瘤细胞中Bax蛋白表达
都有所增强(P袭2赤芍总苷对HepA肿瘤细胞Bcl一2和Bax蛋白
表达的影响。士，，n一10)
Table2 Effectof otalg ucosidesfromRadixPaeoiae
Rubra011proteinxpressionofBcl一2andBax
iⅡhepatomacells(J士F，一10)
与模型组比较：一P<0．01
。。P<0．011p5modelgroup
2．4对体内小鼠肝癌细胞周期的影响：见表3。模
型组的细胞周期明显，模型组凋亡峰不明显．在较小
的摄亡峰前，有许多细胞碎片，而赤芍总苷高剂量组
裹3赤芍总苷对HepA肿瘤细胞周期的影响
(；士F，_一10)
Table3 EffectofotalgheosidesfromRad／xpo*oiae
Rubraontumorcellfideinhelmtomacells
(；士f．Ⅳ一10)
与摸型组比较·’P<0．。5一p<0．Ol
。P无细胞碎片，G。／G，期细胞比例明显减少，G。／G。期
前具有明显凋亡峰，S期细明显增多，与模型组比较
差异显著(P芍总苷高剂量组凋亡率明显增高。
3讨论
细胞周期是反映细胞生存周期的重要指标之
一，细胞周期各个时相的分布情况可以反映肿瘤细
胞增殖的状态。在细胞周期调控机制中有两个重要
点，分别位于G，期与S期。肿瘤细胞G。／G。期阻滞，
是拮抗肿瘤细胞发展的一个重要机制“]。本研究中，
在研究了抑瘤率和凋亡指数基础上，用流式细胞术
和免疫组织化学技术观察了赤芍总苷对肿瘤细胞周
期及细胞凋亡相关蛋白Bcl一2和Bax表达的影响。
结果显示，赤芍总苷能明显阻滞肿瘤细胞G。／G，期
细胞向s期细胞的转化。一定剂量的赤芍总苷诱导
肿瘤细胞凋亡，凋亡率为45．57％。细胞凋亡是一种
主动的受基因调控的细胞自杀过程。许多人体基因
Bcl一2、p53及相关基因Bcl一2、Bax、Bad等参与凋亡
的调控口]。Bcl一2家族成员可分为抑制凋亡和促进凋
亡两类，Bcl一2和Bax为其重要代表。Bel一2在肝癌
组织中异常表达通过抑制细胞凋亡而延长细胞寿
命，从而增加了肿瘤发生的机会并促进肿瘤发展。
Bax则具有对抗Bcl一2蛋白抑制细胞凋亡的作用，
可促进线粒体内细胞色素c的释放，促进细胞凋亡
的产生。最近的资料提示＆I一2能与几种Bcl—2相
关蛋白，尤其是Bax形成异二聚体，Bel一2的效应有
赖于和Bax的相互作用，二者的比值决定细胞接受
刺激信号是凋亡还是存活。Bax过量表达，细胞捅
亡IBcl一2过量表达，细胞存活。本研究结果显示，模
型组肿瘤细胞中Bcl一2表达较对照组有所增加，而
Bax表达明显减少，赤芍总苷能降低肿瘤细胞中
Bcl一2的表达。同时，赤芍总苷也能明显提高肿瘤细
胞中Bax的表达，表明赤芍总苷可以通过影响
Bcl一2和Bax的调节表达来促进肿瘤细胞捅亡，抗
万方数据
十革毒ChlnHeTraditionMandHerr№lDrugs第37卷第9期2007年9胃
肿瘤机制与獯亡有密切关系。本研究显示赤芍总苷
具有明显的抑瘤作用，有效诱导肿瘤细胞凋亡。
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蝙蝠葛酚性碱对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
张晓娟，罗宇芬，扬敏
(广东省人民医院药学部，广东广州510080)
摘要z目的研究螭蝠葛酚性碱对太鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法线栓法制备大鼠大脑中动
脉阻断局灶性脑缺血模型，缺血2h后再蔼注24h，观察蝙蝠葛酚性碱(5、10、20mg／kg，再灌开始时ip给药)对
神经功能评分、脑梗死范围、脑水肿和血噙屏障通透性的影响，测定瞄组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛
(MDA)水平和谷胱甘肚过氧化物酶(GSH—Px)活性。结果蝙蝠葛酚性碱能明显减轻大鼠的神经功能缺陷、缩小
脑梗死体积、减轻脑水肿和血脑屏障通透性，显著增加SOD和GSH-Px活性，降低MDA水平。结论蝙蝠葛酚性
碱对脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与降低血脑屏障通透性、抗脂质过氧化有关。
关键词：蝙蝠葛酚性碱；脑缺血再灌注损伤i血脑屏障}脂质过氧化
中田分类号tR286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)09—1367—03
ProtectionofphenolicalkaloidsfromMenispermumdauricumonfocalcerebral
ischemia—reperfusIoninjuryinrats
ZHANGXiao+juan，LUOYU—fen，YANGMin
(DepartmentofPharmacy，GuansdongProvincialPeople’sHo pital，Guanszhou510080·China)
Keywords：phenolicalkaloidsfromMenispermumdauricum(PAMD)；cerebralischemia—reperfusion
injury；bloodrainbarrier(BBB)；lipidperoxidation
蝙蝠葛酚性碱(phenolica kaloidsfrom
Menis，，eTTaumd Hcum，PAMD)是从防己科植物
蝙蝠葛MenispermumdauricumDC．根茎中提取的
多种脂溶性生物碱的混合物。其主要成分为蝙蝠葛
碱(dauricine)和蝙蝠葛苏林碱(daurisoline)，两者
均为双苄基异喹啉类生物碱，脂溶性高，易通过血脑
屏障(BBB)，在脑组织中有较高的浓度分布。经研
究证明PAMD对大鼠脑缺血再灌注继发的炎性损
伤具有抑制作用[1]，本实验进一步研究PAMD对大
鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。
1材料与方法
1．1药品与试剂；PAMD(含蝙蝠葛碱约83％，含
蝙蝠葛苏林碱约15％)，本实验室自制，用1mol／L
Hcl溶解后，再用1mol／LNaOH调pH值6．4。水
合氯醛、红四氮唑(TTc)，国药集团化学试剂有限
公司；伊文思蓝(EB)，Fluka进口分装；超氧化物歧
化酶(SOD)，丙二醛(MDA)、答胱甘肽过氧化物酶
(GSH—Px)试剂盒及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均
购自南京建成生物工程研究所。
1．2动物、分组及给药方法：SD大鼠(中山大学医
学院实验动物中心提供)，雄性，体重200250g，随
机分为5组：假手术组(除了不插尼龙线外，其余操
器霎品羿：絮嚣晶：荀5一)。女，山东文登人．主管药师．硬士．主要从事临床药学厦脑血管药理学研究．
TelI(020)83827812Emaillxiaojuanzhang@yahoo．coin,cⅡ
万方数据
赤芍总苷对HepA肝癌小鼠肿瘤细胞凋亡的影响
作者： 许惠玉， 陈志伟， 王继峰， 沈丽霞， 梁欣韫， 牛建昭， XU Hui-yu， CHEN Zhi-wei
， WANG Ji-feng， SHEN Li-xia， LIANG Xin-yun， NIU Jian-zhao
作者单位： 许惠玉,王继峰,沈丽霞,梁欣韫,牛建昭,XU Hui-yu,WANG Ji-feng,SHEN Li-xia,LIANG Xin-
yun,NIU Jian-zhao(北京中医药大学,细胞生化实验室,北京,100029)， 陈志伟,CHEN Zhi-
wei(齐齐哈尔医学院,组胚教研室,黑龙江,齐齐哈尔,161042)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(9)
被引用次数： 7次

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