全 文 ：中革葛ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第3期2006年3,El·405·
94．4％)，不影响测定的准确度。鸟§方法学验证，新建
立的测定方法符合药动学要求“]。据文献报道n]，猕
猴ivGI．Q223300pg／kg后，药物在体内的消除半
衰期81／2F为(3．7士1．5)h。本实验结果显示，猕猴iv
MTCS220pg／kg后，药物在体内的消除半衰期
“Ⅲ为(3．8±1．4)h。说明MTCS与天然的天花粉
蛋白的体内过程基本一致。
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原花青素对p一淀粉样肽25—35诱导PCI2细胞par一4
和bcl一2基因表达的影响
梅寒芳1，谢朝阳2，扬红1，祝其锋”
(1．广东药学院生物化学教研室．广东广州 510006；2．广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524023)
掎要：且的探讨原花青索(Pc)对p淀粉样肚(A＆s，s)诱导凋亡PCI2细胞par一4和bcl2基因mRNA和蛋
白表达的影响。方法采用MTT比色法分析细胞存活率，Hoechst33258+PI荧光染色法检测细胞凋亡，RT—PCR
方法检测PCI2细胞par一4和bcl一2基因mRNA的表达，Westernblotting检测PCI2细胞Par一4和Bcl一2蛋白表
达。结果不同剂量(5、10、20、30mg／L)PC预处理PCI2细胞1h可剂量依赖性对抗Ap挣as引起的细胞礴亡，提
高PCI2细胞的存活率，减少A日脊。；引起的PCI2细胞核固缩、凝聚和碎裂，降低par一4基因mRNA表达及蛋白表
达，增加bcl一2基因mRNA表达爱蛋白表达。结论PC可剂量依赖性对抗ApzⅢs对PCI2细胞的毒性作用，其机
制可能与下调凋亡基因par一4和上词抗凋亡基因bcl一2表达有关。
关键词：原花青索(PC)；A口25刚PCI2细胞；细胞摘亡；par一4{bcl一2
中圈分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：02632670(2006)03—0405—04
Effectofprocyanidinsonge eexpressionofpar‘‘4andbcl—r2
inPCI2cellsinducedbyA1325—35
MEIHan—fan91，XIEZhaoyan92，YANGHon91，ZHUQifen92
(1．OepartmantofBiochemistry．GuangdongPharmaceuticalCollege，Guangzhou510006·China；2．Institute
ofBiochemistryandMolecularBiology，GuangdongMedicalC lege，Zhanjiang524023，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheffectofprocyanidins(PC)onmRNAandpr teinxpressionof
par一4andbcl一2genesinPCI2cellsinducedbyAp25_35．MethodsCellsurvivaIratewasevaluatedbyMTT
assayndapoptosiswasanalyzedbyHoechst33258一PIfluorescencestaining．Theexpr ssionsofmRNA
andproteinforpar一4andbcl一2weretestedbvRT—PCRandWesternblotting．ResultsPretreatmentwith
differentconcentrationsofPC(5、10、20．and30mg／I，)forl hincreasedthsurvivaIrateofPCI2eelIina
dose—dependentmanner．PCpreventedthPCI2cellsnucleifromshrinkage，condensation，andcle vage
inducedbyAp25m．PCdecreasedth xpressionofpar一4mRNAandprotein，andincreasedth xpression
收穰日期；2005—0614
基盒项目t广东省重点学科重点项目资助(9808，
作者简介t拇塞芳(1977一)，女．黑龙扛牡丹江人，硕士，助教，主要从事衰老生化研究
Td：(020)89239472I3602463964E—mail：meihf37@183conl
*通讯作者祝其锋Tel{(0759)2388850
万方数据
中革喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第3期2006年3月
ofbcl一2mRNAandprotein．ConclusionPCcanprotectPCI2cellsfromapoptosisinducedbyAB2w5ina
dosedependentma ner．Themechanismofprotectionislikelyrelatedodecreasingthepar一4geneexpres—
sionandincreasingthebcl一2geneexpression．
Keywords：procyanidins(PC)}pamyloidpeptide“35(Ap25-35)；PCI2cells；apoptosis；par一4；bcl一2
p淀粉样肽(pamyloidpeptide，Aft)是阿尔茨
海默病(Alzheimer’sdisease，AD)的特征性病理
改变——老年斑的重要成分n3，A口在脑实质中沉积
与AD的发病密切相关，目前常用A恕sm诱导体外
神经毒实验的AD模型。原花青素(procyanidins，
PC)是植物中广泛存在的一种多酚化合物，是植物
体内天然的抗氧化物质，富含于葡萄、山楂、花生等
植物中，其生物学活性广泛，如抗氧化、抗炎、抗突
变、抗病毒、抗真菌等口]。目前对于PC的研究，多集
中于抗癌、抗缺血一再灌注损伤等。前期研究发现PC
对n13。。。诱导体外培养的PCI2细胞凋亡有保护作
J月”。本实验将进一步对PC保护作用的机制进行
探讨。
1材料
PCI2细胞由军事医学科学院基础医学研究所
马子敏博士惠赠；AB。；。。购于Sigma公司(用时以
pH7．4的PBS溶解)；原花青素(Pc)购自南京学
子医化研发中心，为葡萄籽提取物，质量分数大于
95％；各种规格培养皿均为美国CorningCostar公
司产品；DMEM及马血清均购自Gibco公司；胎牛
血清为杭州四季青公司产品；琼脂糖为Amreseo公
司产品；小鼠抗大鼠Par一4多克隆抗体、兔抗大鼠
Bcl一2多克隆抗体均为SantaCruz公司产品；
MML—V逆转录酶、TaqDNA聚合酶、Oligod(T)、
RNAsin为Promega公司产品；100bpDNAmark
er为华美生物工程公司产品；其余试剂为国产分析
纯；引物为上海生物工程公司合成。
2方法
z．1 细胞培养oJ：PCI2细胞在DMEM基质中培
养，其中加10％灭活马血清、5％胎牛血清、100U／
mL青霉素及100mg／ml。链霉素，于37C、5％
CO。培养箱中培养。
2．2实验分组：每次实验均分为对照组(opmol／L
A8：。。)、诱导组(10#mol／I，Ap。。。)和药物保护组
(PC+AB：”s)，每组至少重复3次。
2．3 MTT法检测细胞存活率：取对数生长期的
PCI2细胞以1×108／L接种于96孔板，培养24h，
分别加入不同终质量浓度(5、10、20、30mg／I，)PC
预处理lh，再加入10FLmol／LA口：。。，继续培养20
h，每孔加入MTT(5g／I。)15pL，继续培养4h，倒
出培养液，每孔加入DMSO10pL，摇床震摇10～
15min，待紫色结晶完全溶解后，用M450型
ELISAReader酶标仪检测各组细胞的吸光度(A)
值，以A。。／A。。代表细胞活力，并以0vmol／l。
Ap。。作为对照组，其细胞存活率为100％，计算其
余各组细胞存活率。
存活率=弓毳器器黼X100％
2．4细胞凋亡的细胞核形态学检测：取对数生长期
的PCI2细胞以2×10s／L接种于67L板，每孔2
mL，培养24h，分别加入不同终质量浓度(10、20、
30mg／L)PC预处理1h，再加10umol／LAB25_35，
继续培养24h，收集细胞于1．5mLEP管中，冷
PBS(pH7．4)洗2次，每管加Hoechst33258至终
质量浓度为5mg／L和PI至终质量浓度为50mg／
L，37℃避光孵育30min，于荧光显微镜下观察并
拍照。
2．5 RT—PCR检测par一4和bcl一2基因mRNA表
达：取对数生长期的PCI2细胞以2×108／L接种于
6孔板，每孔2mL，培养24h，分BU加入不同终质量
浓度(10、20、30mg／L)PC预处理1h，再加10
ttmol／LA口zs_35，继续培养24h，收集细胞，提取总
RNA，用紫外分光光度仪测定A。。⋯／A。。。，比值
在1．7～2．0，计算RNA质量分数。引物设计：(1)
Ratpar一4：正义引物：5’一ATCCCCGAACA—
GATAGAAGT一3，L“，反义链：5’一AAAAGCAGG—
TTTCCCACAC一3’(扩增产物340bp)；(2)Ratbcl一
2：正义引物：5’一CTGGTGGACAACATCGCTC—
TG一3““，反义链：57一GGTCTGCTGACCTCAC—
TTGTG一37(扩增产物227bp)。逆转录体系：总
RNA5弘L(2肛g)、Oligod(T)2ttlu5×M—MLV
缓冲液5pL、dNTP(每一种浓度为2．5mmol／L)
混合物5弘L、M—MLV(2×108U／L)1pL、RNasin
(4×107U／L)1p 、DEPC处理水6ttL，总体积25
pL，稍离心后混匀，42℃水浴60min。合成的cD-
NA于一20℃保存备用。从上述反应体系中取5
pLcDNA，加10×缓冲液5弘L、dNTP(每一种浓
度为2mmol／L)5pL、GAPDH正反义引物(6．25
umol／L)各1bLL，par一4正反义引物(25ttmol／L)
万方数据
中革药ChineseTraditionalandHerbalDr gs第37卷第3期2006年3月·407-
各1pL或bel一2正反义引物(25ttmoI／L)各l
pl。Taq酶(5×106U／L)0．3pL、灭菌三蒸水29．7
pL，总体50L，混匀，瞬间离心，于PE9600型PCR
仪上扩增。反应参数为：95℃、5min，94‘C、1min，
58℃或55c、45s，72C、1min，共30个循环，最
后72℃延伸10min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶
电泳分离检测。
2．6 Westernblotting检测Par4和Bel一2蛋白的
表达：PCI2细胞以2×108／L接种于6孔板，每孔2
mL，培养24h，分别加入不同终质量浓度(10、20、
30mg／I。)PC预处理1h，再加10txmol／LAB％⋯
继续培养24h，低温收集细胞，每管加100pL细胞
裂解液(50mmol／I。TrisHCl、150mmol／I，NaCl、
5 mmol／LEDTApH8．0、1％NP40、0．05％
PMSF、2mg／LAprotinin、0．5mg／Leupeptin)，
提取蛋白，考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白浓度，
与等体积2×上样缓冲液混匀，煮沸5min。每孔上
样50／lg，SDSPAGE分离样品。4℃、90mA、15h
将蛋白转至NC膜上，将膜封闭后，与一抗(小鼠抗
大鼠Par一4多克隆抗体1：400，兔抗大鼠Bel2多
克隆抗体1：500)室温孵育2h，洗涤，再与以1；
4000体积比稀释的二抗稀释液室温孵育1．5h，洗
涤，加入ECL试剂，暗室曝光，显影，定影，拍照，扫
描并分析。
2．7统计学处理：F与Bonferroni或Tamhane7S
T。检验，采用SPSSl0．0统计软件包完成，数值用
j±s表示。
3结果
3．1 MTT结果：培养的PCI2细胞用不同终质量
浓度(5～30mg／L)PC预处理1h，再加入10
”-mol／LA8。。继续培养24h，细胞的存活率随PC
剂量的增大而升高，具有明显的量效依赖性。5rag／
LPC即具有保护作用(JP
显示，用10btmol／LAp：。；处理PCI2细胞24h，可
见染为高亮蓝色的典型凋亡小体，其细胞核明显固
缩、凝聚和断裂(图2A)，而药物保护组(20～30
mg／I。PC+10}tmol／LA口25．35)的细胞核(图2一B、
图2一C)与对照组细胞的细胞核(图2D)形态逐渐
接近，说明PC对At?。。。诱导的细胞凋亡有明显的
保护作用。
100
手8【1
整60
妊40
姜20
0
对照A目㈣，5 10 20 30
PC／(mg-L。。)
与对照组比较：4P<0．05
44P<0．01
与A口25哪诱导组比较t。P<005 一r<0．01
4P
图l PC对A0：Ⅻ诱导凋亡PCI2细胞存活率的
影响“±s，”一3)
Fig，1EffectofPConsurvivalrateofapoptotic
PCI2cellsinducedbyA如5M(，土s，n=3)
A‘lOumol／LAl3纠{B’20mg／LPC+101．motfbAi3盱，sc‘如ms，LPC+10umol／LAp盱*D-对照
图2荧光染色分析凋亡PCI2细胞核形态改变(×400)
Fig．2AnalysisofnucleuschangesinPCI2cellsbyfluorescencestaining(×400)
3．3 PC对A&53s诱导的PCI2细胞par一4和bcl2
基因mRNA表达的影响：结果见表l。RT—PCR结
果显示，用终质量浓度为10、20、30mg／LPC预处
理细胞1h，par一4mRNA的表达随药物质量浓度的
增加而减少，bcl一2mRNA表达随药物质量浓度的
增加而增加。
3．4 PC对A口。。。诱导的PCI2细胞Par一4和Bel一
2基因蛋白表达的影响：结果见表1。Westernblot—
ting结果显示，用终质量浓度为10、20、30mg／LPC
预处理细胞1h，Par4蛋白的表达随药物质量浓度
的增加而减少，Bd一2蛋白表达随药物质量浓度的增
加而增加。
4讨论
Ap。。；可诱导体外培养的成神经细胞瘤细胞和
原代培养的海马与新皮质神经元发生脂质过氧化反
应，导致细胞中过氧化物生成增多，膜脂质过氧化程
度增高；维生素E等抗氧化剂可抑制此过程，保护
细胞免受A口。。m的损伤一“，说明A13毒性和氧化应
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第3期2006年3月
表1 PC对AB2”5诱导凋亡PCI2细胞par一4和bcl一2基因mRNA和蛋白表达的影响(i土s，H一3)
Table1 EffectofPConmRNAandproteinxpressionofpar。。4andbcl--2genesinapoptotic
PCI2ceilsinducedbyA13M(j--s，n一3)
*P
的抗氧化物质，它对无烟烟草提取物(STE)诱导的子上的WTl结合位点，而减少bcl一2基因启动子的
人类n腔角化细胞的脂质过氧化、DNA断裂和凋转录，调节Bcl一2蛋白的表达‘”1。
亡有明显的保护作用‘目；对巴豆油刺激所引起的大 本研究结果提示，Pc可能是通过其抗氧化活
鼠多形核白细胞(PMNs)H。O。水平的增加，肝线粒性，抑制与AB。。。。毒性相关的氧化应激反应，继而减
体脂质过氧化有显著的抑制作用，并能提高肝线粒 少凋亡基因par4的表达，增强抗凋亡基因bcl2
体SOD活性”；本实验观察到，10～30mg／LPC 的表达，保护细胞免受损伤。
可拮抗Ap。。。对PCI2细胞的毒性，剂量依赖性增References：
加PCI2细胞的存活率，可减少A口25m引起PCI2细‘“。BBa。bpotaraenrKi。,tM。。8r。t叫inU删,Hpe。n mingt。Wd’neuet。a1．。IInh。ipopbiti侧on}占i。
胞凋亡时的核固缩、凝聚和破裂，对Ap*ss诱导的细 [z3：等：麓：?dP，S。d，U。IliS扎A,。1；9A99‰,96d。。9f篙野j兰。。0fb。d
胞凋亡有明显的保护作用。Hse[J]WorldPhytomed(N)b医药：植物药分册)，1996，
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sponse，par)是Sells等于1994年从凋亡的前列腺；舞冀￡：5ap[J]op．tos“ism01，岂i￡劣?簧；曩b年y学l’a杂my志lo)i：
肿瘤细胞中分离出来的，包括par-1、par一2、par3、 [4]z20boan5R,2G5(x2，)：zhlu59三譬jstudy。fNGFtolnduc。Pcl2。川，
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凋亡的关系最为密切“⋯。对神经退行性疾病‘包括
E5]v。Cull一“ee。Ct。,fZPh。u，Y4,。。Kirmieg町mlste。in。J,。etadl．怒tehnc[J]efo．r．，th＆e荔inAD)的病人和动物模型死亡后脑组织的病理研究 BhdmwMetab 2001，21(4)：334—343
表明，在损伤的神经元中，Par-4水平也明显升高， [83。M。ducichi。o。’2I芝焉篙：嚣。oM。。,etthral．。：誉蜀富。cr。o。|vasis，／。a。nctoj。r
AIa作用于PCI2细胞，在细胞活性明显下降的同 黑ri孙nmr㈣yhRipp⋯p“⋯⋯[’]‘。删“㈨1999’274：
时，Par-4的表达明显增强。1“，提示Par-4参与A口ET]裂盎盛1ps。JB。,L。es。0xiieymR，,e[J]ta1．‘点爱ro：；：焉等未裟
对PCI2细胞的毒性。Par一4蛋白分子的羧基末端含[8]I沁cKM，BalmoonJ．gagchlD．，etal_Smokele．sstobacco：
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PKCg，Bcl2等)相互作用，通过影响这些凋亡调节t[iJo]n．oc^ft耋IOPz^a⋯nd。lipifdBs。o“xy(b中at戳盗翳舄：芝蕊；?吉焉；
蛋白而间接影响凋亡。本研究结果最示，10Fmol／L[10]；。6lZl。。s65F-，w∞dDP．Jr，“nfcomnl。。amy““E⋯
A口一。s诱导组，par一4基因的mRNA和蛋白表达增：嚣=：署：盘饕；嚣‘：怠o。。f。⋯apopltlo。“[Js]in．雳笞：淼
加，b。1—2基因的mRNA和蛋白表达减少，与对照[11]笔墨k翟?‰。5。：。4J5．7-P4r066虬a．⋯popt0。i⋯。p⋯“。⋯l。。d
组比较差异非常显著(P
mRNA和蛋白表达减少，bel一2基因的mRNA和蛋口“⋯Lan。“R备。Ye。。Z。品．宁鬣戮；镜竺≥?夸=：：i船：：
白表达增加，NxCN±11比较差异显著(P
后，通过抑制NF—KB的活性，下调抗凋亡因子bcl2 1 9995—20005．
万方数据
原花青素对β-淀粉样肽25-35诱导PC12细胞par-4 和bcl-2基
因表达的影响
作者： 梅寒芳， 谢朝阳， 杨红， 祝其锋， MEI Han-fang， XIE Zhao-yang， YANG Hong，
ZHU Qi-feng
作者单位： 梅寒芳,杨红,MEI Han-fang,YANG Hong(广东药学院,生物化学教研室,广东,广州,510006)
， 谢朝阳,祝其锋,XIE Zhao-yang,ZHU Qi-feng(广东医学院生物化学与分子生物学研究所
,广东,湛江,524023)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(3)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200603033.aspx