全 文 ：科技导报 2012，30（04）
0 引言
随着社会的老龄化，阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，
AD）亦称老年性痴呆，其发病率呈逐年上升趋势，AD 的病因
及其病理机制仍未明确，治疗手段十分有限。随着对 AD研究
琐琐葡萄多糖对 PC12 细胞损伤的
神经保护作用
摘要 体外培养 PC12 细胞，采用 20μmol/L β 淀粉样蛋白 25-35(Aβ25-35)作用 24h 诱导细胞损伤，建立阿尔茨海默病（AD）细胞
模型，研究琐琐葡萄多糖（VTP）对 PC12 细胞损伤的神经保护作用。 设立对照组、模型组和 VTP 保护组（20，40，80μg/mL），CCK-
8 法检测各组细胞的存活率，乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞膜通透性及完整性，化学比色法测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、丙
二醛（MDA）含量，流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果显示，20，40，80μg/mL VTP 可提高 PC12 细胞存活率，减少 LDH 渗漏，增加
SOD 活力，减少 MDA 含量，降低细胞凋亡率，与模型组比较有显著差异（P<0.01）。由此推论，VTP 对 Aβ25-35 诱导的 PC12 细胞
凋亡和氧化损伤具有明显的保护作用。
关键词 琐琐葡萄多糖；PC12 细胞；Aβ25-35；氧化损伤；细胞凋亡
中图分类号 R965 文献标识码 A doi 10.3981/j.issn.1000-7857.2012.04.006
袁 芳，张景萍，马 龙
新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830011
Protective Effects of Polysaccharide from Vitis vinifera L on Aβ25-35
Induced Injury in PC12 Cells
收稿日期： 2011-12-19；修回日期：2012-01-30
基金项目： 新疆医科大学博士研究生创新基金项目（DC2010-1）
作者简介： 袁芳，副教授，研究方向为新疆特色药食兼用植物的开发应用，电子信箱：yuanfang398@163.com；马龙（通信作者），教授，研究方向为新疆特色药
食兼用植物的开发应用，电子信箱：ml@xjmu.edu.cn
YUAN Fang, ZHANG Jingping, MA Long
College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
Abstract In order to investigate protective effects of polysaccharide from Vitis vinifera L on β-amyloidprotein 25-35(Aβ25-35) induced
neurotoxicity in PC12 cells, PC12 cells were treated with Aβ 25-35 in vitro for 24h to establish an Alzheimers disease (AD) model.
Control group, model group (20μmol/L Aβ25-35), and different concentration of VTP groups (20, 40, 80μg/mL) were set up, and cellular
morphological change was observed by using the inverted microscope. Cell viability of each group was assayed with Cell Counting Kit-8
(CCK-8) method; the penetration and completion of the cell membrane were detected by means of lactic acid dehydroge-nase (LDH)
method; the level of antioxidant enzymes (SOD) and malondialdehyde (MDA) were evaluated by using chromatometry; and apoptotic rates
were detected by means of Annexin V-FITC and staining with PI. The results show that comparing with the model group, VTP groups
could improve cell injury, the cell numbers of the VTP groups raise obviously, the morphological change of the cell improves
significantly, the survival rate of PC12 cells increases; LDH percolation activity decreases, SOD activity increases, MDA level decreases,
and the apoptotic rate reduces. In summary, VTP has the protective effects on both oxidative damage and apoptosis of PC12 cells induced
by Aβ25-35.
Keywords VTP; PC12 cells; Aβ25-35; oxidative damage; apoptosis
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的深入， 中药及保健功能性食物预防和治疗 AD 的作用日益
受到重视。 琐琐葡萄（Vitis vinifera L）为葡萄科葡萄属植物山
葡萄，主产于新疆吐鲁番、和田、鄯善等地，是医药文献如《神
农本草经》、《维吾尔药志》等所记载的药用葡萄品种之一。 以
新疆医科大学马龙教授为首的课题组长期致力于琐琐葡萄
医药保健功能的开发应用，从琐琐葡萄提取了多糖、黄酮、三
萜等活性物质，研究其抗突变、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老作用。
其中多糖是由醛基和酮基通过糖苷键连接而成的高分子聚
合物，也是构成生命的四大基本物质之一。 它毒性小、安全性
高、功能广泛，具有非常重要和特殊的生理活性，从植物尤其是
从中药中提取的水溶性多糖，均具有显著的药效功能，如增强
免疫功能、降血糖、调血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老作用等 [1-2]。
近年来研究表明，葡萄中提取的原花青素、白藜芦醇具有防治
老年痴呆的作用，人参、枸杞、黄芪、灵芝等中药中提取的多
糖对神经细胞有保护作用 [3-7]，但未见对琐琐葡萄多糖（VTP）
神经保护作用的报道。前期研究发现 VTP具有很强的抗氧化
作用，为了开发 VTP 的医药保健功能，本试验采用 Aβ25-35
诱导 PC12 细胞损伤，制备 AD 体外细胞模型，研究 VTP 对神
经细胞的保护作用，为将 VTP 开发为防治 AD 的药物提供实
验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
琐琐葡萄购自吐鲁番维吾尔药材市场，为 Vitis vinifera L
的成熟干燥果实。 分离、纯化提取 VTP，培养液溶解，0.22μm
尼龙滤膜过滤除菌，-20℃避光保存，临用时稀释至所用浓度。
DMEM 培养液 ， 美国 Hyclone 公司 ；Aβ25-35，Sigma 公
司；胎牛血清，杭州四季青公司；CCK-8 检测试剂盒，武汉博
士德生物工程有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶
（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒均购自南京建成生物研究
所；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（BioVision）。
1.2 细胞培养和分组
PC12 细胞（高分化）购自中国科学院上海细胞生物学研
究所细胞库。 细胞常规培养，DMEM 高糖培养液含 10%灭活
胎牛血清、100U/mL 青霉素、100μg/mL 链霉素， 置 37℃、5%
CO2饱和湿度的恒温培养箱，隔天换液，3—4d 传代。 每次实
验均分对照组 ， 模型组 （20μmol/L Aβ25-35），VTP 保护组
（20，40，80μg/mL）。
1.3 细胞存活率的测定
CCK-8 试剂盒测定细胞存活率， 按照试剂盒说明书操
作， 在酶标仪 450nm 测定吸光度， 计算各组 PC12 细胞存活
率。 每组设 5个复孔，实验重复 3 次。
1.4 LDH活性的测定
Aβ25-35 诱导 24h 后 ， 分别收集各组细胞上清液 ，按
LDH 试剂盒说明书操作，计算各组细胞上清液中 LDH 活性。
酶标仪测定吸光度，波长 450nm，每组设 5 个复孔，实验重复
3 次。
1.5 SOD活性、MDA含量的测定
按上述方法收集各组细胞上清液，按照试剂盒说明书操
作，分光光度计测定吸光度，每组设 5个复孔，实验重复 3 次。
1.6 细胞凋亡的检测
细胞接种于 6 孔板，按上述方法分组并培养细胞，将各
组的细胞消化后收集，1000r/min 离心 5min，用冷 DMEM 洗涤
2 次，结合缓冲液中重悬成单细胞悬液，密度为 1×106/mL，室
温下加入 5μL Annexin V-FITC 和 5μL PI 染料，轻轻振荡、混
匀，室温下避光孵育 15min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。
1.7 统计学处理与分析
数据用x軃±s表示，采用 SPSS 16.0 软件进行统计处理。
2 结果与分析
2.1 VTP对 PC12 细胞存活率的影响
倒置显微镜下观察细胞形态（图 1）。 正常组细胞贴壁生
长旺盛，细胞间突起相互连接紧密；模型组细胞数目显著减
少，细胞突起回缩，部分细胞皱缩、变圆，细胞间隙增大，呈现
明显损伤形态；VTP 保护组细胞数量增多，细胞贴壁良好，形
态正常有突起，脱落细胞减少，受损程度明显减轻。 CCK-8结
果显示（图 2），与对照组相比，模型组细胞生长受到抑制，细
胞存活率下降 （P﹤0.01）；VTP 保护组明显改善细胞损伤，与
模型组相比，细胞存活率增加（P<0.01）。
2.2 VTP对 PC12 细胞 LDH的影响
LDH 活性测定结果表明，VTP 保护组细胞膜外 LDH 活
性显著降低（P﹤0.01），表明 VTP 能拮抗 Aβ25-35 所致的细
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胞膜损伤（图 3）。
2.3 VTP 对 PC12 细胞 SOD活性的影响
与对照组比较， 模型组细胞的 SOD 活性显著下降 （P﹤
0.01）；与模型组相比，VTP 保护组细胞 SOD 活性显著增加（P
﹤0.05），见图 4。
2.4 VTP 对 PC12 细胞 MDA含量的影响
由图 5 可以看出，与对照组相比，模型组细胞的 MDA 含
量显著增高（P﹤0.01）；与模型组相比，VTP 保护组细胞 MDA
含量显著降低（P﹤0.05）。
2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率
流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示，对照组细胞凋亡
率为 4.58%；模型组凋亡率为 25.18%，两组间比较有显著性
差异（P﹤0.01）；与模型组相比，VTP 保护组显著降低细胞凋
亡率（P﹤0.01）（图 6）。
3 讨论
AD 临床上表现为渐进性智力障碍和记忆力减退， 随着
社会老龄化的发展，已成为老年医学迫切需要解决的疾病之
一。 AD发病机制复杂，特征性病理改变为 β淀粉样蛋白在大
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脑内的沉积，可导致神经元及其突触的丢失，并最终导致痴
呆。 因此，国内外研究筛选抗痴呆药物多采用 β 淀粉样蛋白
诱导神经细胞损伤模型 [8-9]。本研究采用 20μmol/L Aβ25-35 作
用于 PC12 细胞 24h，构建 AD 体外模型，实验结果显示，模型
组细胞存活率下降至 77.61%，LDH 活性显著增高 （P<0.01），
表明此模型可以作为评价 VTP 保护作用的神经损伤体外模
型。Aβ25-35 损伤细胞前加入 20，40，80μg/mL的 VTP，相较于
模型组，细胞存活率显著增加，细胞上清液中的 LDH 含量显
著减少（P<0.01），且随着 VTP 浓度增加，保护作用增强，表明
VTP对 Aβ25-35 诱导的神经细胞损伤具有保护作用。
Aβ 是各种原因诱发 AD 的共同通路，是 AD 病理机制的
核心问题。 在正常情况下，机体内自由基的产生和清除系统
处于动态平衡状态，Aβ可通过诱导产生氧自由基使脑细胞膜
系统的脂质和蛋白被氧化修饰，使活性氧增加，促进氧化反
应和过氧化物形成，诱导氧化应激损伤，降低抗氧化作用，自
由基损伤是 Aβ 发挥细胞毒性的方式之一。 氧自由基也可促
进生成 Aβ，二者具有相互促进效应。 神经细胞丢失是 AD 的
一个重要特征， 细胞凋亡是丢失的重要前提，Aβ 能引起神经
细胞的凋亡。 MDA 和 SOD 是反映自由基损伤最具有代表性
指标。 实验结果显示，Aβ25-35 诱导的模型组与正常组比较，
细胞 SOD 活性明显降低，MDA 含量显著增加，细胞凋亡率显
著升高（P<0.01），提示细胞损伤与脂质过氧化有关；与模型组
比较，VTP各浓度保护组均可提高 SOD 活性、降低 MDA 含量
（P<0.05），细胞凋亡率减少（P<0.01），提示 VTP 可能通过抗氧
化、抗凋亡起到对神经细胞损伤的保护作用。
综上所述，本实验采用 20μmol/L Aβ25-35 作用 24h 诱导
PC12 细胞损伤， 构建 AD 细胞模型，Aβ25-35 损伤细胞前加
入 20，40，80μg/mL 的 VTP 干预，VTP 能提高细胞存活率，减
少细胞释放的 LDH 含量，改善细胞膜的损伤，降低细胞凋亡
率，VTP 组细胞 SOD 活性增加、MDA 含量降低， 表现出抗氧
化活性，具有潜在药用价值，本研究为维药琐琐葡萄防治老
年痴呆等神经系统疾病提供科学依据，为促进维吾尔医药的
理论发展，同时也为充分利用新疆丰富的葡萄资源，变资源
优势为经济优势，研发安全、有效、价廉抗痴呆民族新药提供
新思路。
4 结论
本研究表明，VTP 对 Aβ25-35 诱导的 PC12 细胞凋亡和
氧化损伤具有保护作用， 能够明显改善神经细胞的损伤，对
防治老年痴呆等神经系统疾病具有潜在药用价值。
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（责任编辑 吴晓丽）
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