全 文 ：中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·599·
图谱的对照指纹图谱，为杜仲药材提供了质量上的
技术监控手段。
References：
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鉴定学)rMl．Beijing：ChinaPressofTraditionalChinese
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太子参脱病毒苗的核糖体ITS序列研究
朱艳1，秦民坚r，杭悦宇2
(1．中国药科大学中药资源教研室，江苏南京210038；2．江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京210014)
摘 要：目的研究太子参脱病毒苗与外界苗rDNAITS区碱基序列的异同。方法运用PCR直接测序法对9种
太子参脱病毒苗和4种外界苗的rDNAITS区(包括ITSl、5．8S、ITS2)碱基序列进行了序列测定。结果太子参
脱病毒苗与外界苗的5．8S碱基序列完全一致，变异位点基本上位于ITSl的起始端与ITS2的终止端，其中江苏
溧阳和安徽宣城的脱病毒苗变异位点较多。使用UPGMA法构建了系统发生树，从分子生物学角度说明了它们之
间的内在联系。结论rDNAITS碱基序列的比较分析从分子水平上进一步阐明了脱病毒苗的遗传稳定性。
关键词：太子参；脱病毒苗；rDNAITS区；DNA序列
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)04—0599—03
SequenceanalysisofrDNAITSofde-virusseedlingsofPseudostellariahete ophylla
ZHUYanl，QINMin—jianl，HANGYue—yu2
(1．DepartmentofTraditionalChineseMedicinalMaterialResources，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210038，
China；2．InstituteofPlant，JiangsuProvinceandChineseAcademyofSciences，Nanjing210014，China)
Abstract：ObjectiveTostudyrDNAITSsequencesimilaritiesandifferencesbetweenthede—virus
seedlingsa doutsidese dlingsofP eudostellariaheterophylla．MethodsThsequencesofITSregion
(includingITSl，ITS2，and5．8S)fromninede—virusseedlingsa dfouroutsidese dlingsweretudiedby
themethodofDNAsequenceanalysis．ResultsTherew rethesamesequencesin5．8Sregionbetween
thede—virusseedlingsa doutsidese dlingsofP，heterophylla．Variablesiteslayintheinitialpositionof
ITSlandterminationofITS2basically．Thede—virusseedlingsfromLiyang(JiangsuProvince)and
Xuancheng(AnhuiProvince)hadmorev riablesites．PhylogeneticdendrogrambasedonITSwas
constructedbyusingUPGMAmethods．whichshowedt einherentrelationatthe1evelofmolecular
biology．ConclusionTheanalysisofrDNAITSofP．heterophyllahasfurtherclarifiedtheinherit
stabilityofde—virusseedlingsatthemolecularlevel．
Keywords：Pseudostellariaheterophylla(Miq．)PaxexPaxetHoffm．；de—virusseedlings；rDNA
ITS；sequencesofDNA
太子参为石竹科孩儿参属植物孩儿参
Pseudostellariaheterophylla(Miq．)PaxexPaxet
Hoffm．的干燥块根，收载于《中国药典》[1]，具有益
气健脾，生津润肺之功效，主治心悸自汗，疲倦乏力，
脾虚食少，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳等症。太子
参主产于江苏、山东、安徽、福建等省，长期无性繁殖
易发生病毒病，关于太子参脱病毒的具体情况，笔者
已作了初步的研究‘引。近年来，rDNAITS区以进化
速率快且与植物生活型呈相关性，而被广泛用于近
缘属问、属内系统发育及种内居群间的差异性研
究‘3～引。 余永邦等嘲曾对部分产区的太子参进行
rDNAITS区序列的比较，那么太子参脱病毒苗与
外界苗间是否也存在DNA序列上的差异?脱病毒
苗是否既脱除了病毒，又保持了该品种的优良特性?
收稿日期：2006—07—31
基金项目：江苏省自然科学基金资助项目(BK2005206)
作者简介：朱艳(1972一)，女，江苏吴江人，硕士研究生，助理研究员，主要从事药用植物种质资源保存和生物技术等方面的研究。
*通讯作者秦民坚Tel：(025)85391290E—mail：minjianqin@sohu．corn
万方数据
·600· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
为此，以不同产地太子参脱病毒苗与外界苗为研究
对象，采用PCR产物直接测序的方法，对太子参各
产区脱病毒苗与部分外界苗的rDNAITS序列进
行了测定，旨在从分子水平上进一步阐明太子参脱
病毒苗的遗传稳定性。
1材料与方法
1．1 材料：实验所用的外界苗为2002年7月～
2005年6月间采自江苏、山东、安徽、福建、辽宁等
我国太子参主要产区的栽培种及野生种，脱病毒苗
采自中国药科大学药用植物园组培室。材料来源详
见表l。
表1实验所用太子参来源
Table1 SourcesofP．heterophyllausedinexperiment
1．2 总DNA提取：采用改良CTAB法提取总
DNA，具体步骤如下：取样品叶片或块根适量，用冷
蒸馏水清洗干净，用液氮速冻，然后在研钵中迅速将
其研磨成粉末，在化冻之前将粉末转移至2．0mL
聚丙烯离心管中，加入1．5mL预热的DNA提取
缓冲液(2VooCTAB，100mmol／LTris—HCI，20
mmol／LEDTA，1．4mol／LNaCl，2％PVP，p一巯
基乙醇0．1oA)，混匀，65℃水浴保温40～90min，
氯仿一异丙醇(24：1)抽提2次，异丙醇沉淀DNA，
70％乙醇洗涤2次，沉淀风干，50肛L重蒸水溶解，
一20℃保存备用。
1．3 ITS区片段的扩增与测序：rDNAITS片段扩
增采用的引物根据余永邦的引物略加修改而得，分
别为位于18S上的IPl(57一AGTCGTAACAAGG—
TTTCCGATGGTG一37)和位于26S上的IP2(57一
TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG一3’)。
PCR扩增反应在30肛L的体系中完成，反应液
含lO×PCRbuffer3弘L，MgCl2(25mmol／L)2．0
pL，dNTPmix(2．5retool／L)1．5肚L，Template
DNA1．0弘L，Primer1(10mmol／L)1．0弘L，
Primer2(10mmol／L)1．0pL，Taq酶0．2肛L。反
应在PTC200型PCR仪上进行，扩增条件为：95℃
预变性4min，95℃变性50S，54℃复性45S，
72℃延伸50S，35个循环后，72℃延伸10min。
以ddH。O代替模板DNA作空白对照。
PCR产物用上海华舜纯化试剂盒进行纯化，然
后采用ABIPRISM377—96型自动测序仪进行测
序，为保证所测序列的准确性，使用双向测序，交由
上海生工进行测序。
1．4 DNA序列数据分析：所得DNA序列输入计
算机后，用ClustalX(1．8)软件进行对位排列，并
辅以人工校对，用MEGA3．0软件分析脱病毒苗与
外界苗之间DNA序列上的差异，并以石竹科近缘
属蝇子草属植物Sileneaegaea为外类群(资料来
自GenBank，登录号AJ299839)，与9个产地的外
界苗及相应脱病毒苗的ITS序列进行分析，采用非
加权平均法(UPGMA法)重建系统发生树。
2结果与讨论
2．1 太子参脱病毒苗的rDNAITS区序列的大
小：本研究共测定了13个种，包括9种脱病毒苗和
4种外界苗，其中福建柘荣(Fj)、贵州施秉(Gz)、江
苏溧阳(Ly)i山东文登(Sw)、山东临沂(S1)的
ITS序列参考了余永邦[6]的结果，有关脱病毒苗的
ITS序列为首次报道，其核糖体DNA内转录间隔
区ITSl和ITS2与3个编码区18S、5．8S和26S
的界限的决定参考了余永邦【61的结果及GenBank
中石竹科近缘属蝇子草属植物S．aegaea的ITS
序列(登录号AJ299839)。
根据测序结果，各脱病毒苗间ITS序列的长度
除江苏溧阳(S6)为614bp以外，其余长度完全一
致，均为611bp，G+C的量ITS一2区高于ITS一1
区，分别为54．7％～56．0％和52．9％～54．6％。所
有太子参脱病毒苗的5．8S序列都很保守，长度均
为156bp，碱基完全一致。
2．2 太子参脱病毒苗与外界苗的rDNAITS碱基
序列的差异与分析：从太子参外界苗及其脱病毒苗
的ITS序列变异位点比较(图1)中，发现其变异较
小，变异位点基本上位于ITSl的起始端与ITS2的
终止端。其中外界苗柘参1号(Z1)、福建柘荣与脱
病毒苗S1、S3、S4、S7、S8的ITS碱基序列完全一
致；柘参2号(Z2)与其相应的脱病毒苗(S2)的碱基
仅在82位点(T—K)存在变异，同时发现所测太子
参的ITS序列除柘参2号和与其相应的脱病毒苗
S2以外，其余序列在该位点上碱基均为G，这是否
与该品种不开花有关联，该差别能否作为鉴别太子
参品种开花与否的分子标记，还需要进一步的实验
来证实。
万方数据
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·601·
15555555566666666666
5854558889900000llllll
357832446723501045690[2345
G^Oc-1G^^I℃GTGTlH—C玎G-拭；AC-
⋯．一K⋯．⋯⋯一⋯⋯．．一
⋯．一⋯．．T^TAC．眦．TA．一
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-●●一⋯●-⋯⋯一●-● ⋯●●一
●●●●一●⋯● ⋯⋯一●●● ●●⋯
圈1太子参外界苗及其脱病毒苗的ITS序列变异位点比较
Fig．1Comparisonofvariablesit sinITSsequences
OfP．heterophyllafromoutsidese dlings
ande-virusseedlings
所测脱病毒苗的ITS序列中，以安徽宣城(S5)
和江苏溧阳(S6)的变异尤为明显，其中江苏溧阳的
外界苗与脱病毒苗的ITS序列的碱基变异主要发
生在ITSl与ITS2上，变异位点主要为3位点
(G—A)，8位点(C—A)，556位点(T—A)，557位
点(C—A)和613位点(A—T)；安徽宣城的碱基
变异主要发生在lTS2上，变异位点主要为582位
点(G—T)，583位点(T—A)，585位点(G—T)，
590位点(T—A)，591位点(T—C)和612位点
(G—A)。这一方面可能与脱病毒苗制备过程中具体
采用的方法有关系口]，由于江苏溧阳和安徽宣城有
着悠久的栽培太子参的历史，长期的无性繁殖，使得
太子参病毒病非常严重，因此不得不采用多种方法
共同处理，特别是化学试剂病毒唑的使用，可能会对
其产生影响；另一方面，太子参不同产地的种质资源
存在遗传多样性叩]，其中以安徽宣城的变异较为
明显。
2．3不同产地太子参及其脱病毒苗的系统发生树
重建．：由于ITSl和ITS2两个片段的长度有限，各
自提供的信息量有限，因此将这两个片段综合起来
分析，以UPGMA法重建系统树。
分析一个脱病毒植株与母本之间的关系，最直
接的方法就是分析它们的基因序列上的变化，即
DNA序列分析的方法，这种基因序列分析的方法
比形态学的方法更快速、更准确、更可靠，更能准确
地反映出脱病毒植株和母本之问的遗传关系。从图
2可见，不同产地太子参的脱病毒苗与相应的外界
苗基本上聚在一起，这就从分子水平上进一步阐明
了脱病毒苗的遗传稳定性。
圈2基于ITS序列的不同产地太子参外界苗与
脱病毒苗的系统聚类树
Fig．2SystematicdendrogrambasedonITSsequen—
cesofP．heterophyllafromoutside
seedlingsa de-virusseedlings
笔者看到作为外类群的S．aegaea自成一支，
不同产地的太子参样品的ITS序列存在着种内的
变异，其中安徽宣城(Ah)和江苏溧阳(Ly)的变
异尤为明显，福建柘荣、柘参1号、柘参2号、贵州施
秉、山东文登、山东临沂(S1)聚在一起，而辽宁凤
城(Ln)单独聚为1支。由此可以看出福建地区的太
子参品种与山东地区的太子参品种亲缘关系较近，
而与地道产区江苏的亲缘关系较远；柘参1号、2号
为从当地种质资源中选育出的新品种，其遗传物质
保持着相对的稳定性；辽宁凤城的野生太子参品种
与福建、贵州、山东地区的亲缘关系较近，而与江苏、
安徽地区的亲缘关系较远，这些可能与各地区不同
～的土壤和气候等环境条件的影响有很大关系，这需
4要进一步研究加以确证。
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∞
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8；h从H骺∞蝴
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万方数据
太子参脱病毒苗的核糖体ITS序列研究
作者： 朱艳， 秦民坚， 杭悦宇， ZHU Yan， QIN Min-jian， HANG Yue-yu
作者单位： 朱艳,秦民坚,ZHU Yan,QIN Min-jian(中国药科大学,中药资源教研室,江苏,南京,210038)
， 杭悦宇,HANG Yue-yu(江苏省中国科学院植物研究所,江苏,南京,210014)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(4)
被引用次数： 1次

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引证文献(1条)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200704042.aspx