全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月·1847·
响因素较多，为了排除干扰，实验中除了调节药物
pH值外，还进行了内毒素回收率实验，在相同的稀
释度下比较各提取部位抗内毒素活性。本实验中发
现由于各提取部位的颜色干扰，使得测定的内毒素
值变异度非常大，有的远超过外加内毒素量，如果不
设立药品阴性对照以消除颜色干扰，实验结果的可
靠性就值得商榷，目前采用鲎试剂抗内毒素研究中
有的提到了颜色的干扰，他们虽然设了药品阴性对
照，但在计算内毒素破坏率时并没有说明药物组内
毒素量与药品阴性对照之间的关系[4]，因此笔者考
虑用药品阳性和药品阴性的临界时间差值代替实测
内毒素值，差值越小说明抗内毒素活性越强。此外，
在体外实验中还首次采用血清药理学方法制备含药
血清，参照文献方法得到的含药血清与药物直接加
入反应系统的实验结果基本相符。为了弥补体外实
验的不足，本实验还建立了内毒素诱导的大鼠发热
模型，该方法能够有效地观察药物对内毒素致热的
抑制作用。通过以上体内外实验的结合，以期达到相
互印证，互为补充的目的。
本实验发现全方水煎液无论是体内还是体外均
显示出良好的抗内毒素活性，其次是水溶部位和氯
仿部位，结果表明各提取部位的药理作用弱于全方，
说明泻心汤抗内毒素作用是多种化学成分共同作用
的结果，其中发挥关键作用的可能是水溶部位中的
结合蒽醌和氯仿部位中的游离蒽醌。氯仿部位和正
丁醇部位在体内和体外实验中作用强度有所改变，
氯仿部位在体外实验中作用强于正丁醇部位，但解
热作用却略弱于正丁醇部位，这可能是药物在体内
外抗内毒素作用机制不同造成的。综合结果分析，水
溶部位是本实验筛选出的一个有效部位。总的说来，
以上3个实验结果的重复性还是比较理想的，以它
们作为筛选平台是切实可行的，这些工作为下一步
泻心汤的各个拆方抗内毒素有效部位(群)的研究
打下了基础。
References：
[1]ZhouH，MeiGY，WangQ．AdvancesoftraditionalChinese
medicineonantiendotoxinEJ3．ChinPharmJ(中国药学杂
志)，2005，40(3)：235—237．
E2]ChP(中国药典)Es3．VolI．2005．
[3]XueJ，XieML．Advancesinstudiesonmethodologyin
serumpharmacologyofChinesemateriamedica[J]．Chin
TraditHerbDrugs(中草药)，2003，34(6)：a—ix—xi．
E4]LiuZF，LiGS，FuFH，gta1．Studiesofantiendotoxin
effectofeightChineseherbinjections抽vitro[J]．Chin
TraditHerbDrugs(中草药)，2002，33(1)：58—59．
粉防己碱对体外培养软骨细胞的影响
崔元璐1’2”，姚康德2，戚爱棣3，王虹1’3
(1．天津中医药大学中医药研究中心，天津300193；2．天津大学高分子材料研究所，天津300072；
3．天津中医药大学方剂学省部共建教育部重点实验室，天津300193)
防已是传统中药，始载于《神农本草经》，有祛风
湿、止痛、利水的功效；在传统中药方剂中常用于治
疗风湿痹痛，现多用于风湿、类风湿性关节炎的治
疗。现代研究表明，防己最主要的有效成分是粉防己
碱(tetrandrine)，属于双苄基异喹啉类生物碱，具
有抗炎和免疫抑制作用，可以抑制炎症过程的多个
环节，包括抑制炎症细胞功能、抗自由基损伤、抑制
炎症介质释放和对抗炎症介质的效应。
在近年发展起来的组织工程研究中，体外培养
的细胞可能会逐渐去分化，丧失细胞表型与功能。此
时可利用骨形态发生蛋白(BMPs)、软骨衍生形态
发生蛋白(CDMPs)、转移生长因子(TGF—B)等保
持细胞再分化[1]、调节细胞增殖并改变细胞的产物
合成而作用于组织形成的过程。因此在组织工程研
究中，用支架材料控制释放这些因子，以达到促进组
织修复重建，维持细胞表型与功能的作用。生长因子
多为来源于人或动物体内的水溶性蛋白质，价格昂
贵，生物性质很不稳定，使其负载于支架材料有一定
难度。传统中药的某些有效成分具有与细胞因子类
似的功能和相应的药理作用，且价格低廉，理化性质
相对稳定，具有作为细胞因子替代物应用的良好前
景。基于粉防己碱已知的药理作用和临床治证，本研
收稿日期：2006—02—19
基金项目：国家自然科学基金项目(30570495)；天津市应用基础研究重点资助项目(06YFJzJc01900)
作者简介：崔元璐(1972一)，男，天津市人，博士，研究员，博士生导师，主要从事中药药理学和中药制剂学研究。
E—mail：euiyl@tju．edu．cn
万方数据
·1848· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月
究考察了粉防己碱对体外培养牛软骨细胞的影响及
应用于组织工程领域的可能性。
1材料
粉防己碱(质量分数>98％)，中国药品生物制
品检定所。细胞增殖酶联免疫检测试剂盒(Cell
ProliferationELISA，BrdUKit)，瑞士Roche公
司；MTT、1，9-二甲基亚甲基蓝、鲨鱼硫酸软骨素
C、木瓜蛋白酶，Sigma公司产品；牛血清白蛋白
(BSA)，美国Amresco公司；小鼠抗Ⅱ型胶原抗体
(单克隆抗体，COL一2)，Sigma公司；过氧化物酶标
记的羊抗小鼠IgG，北京中山生物技术有限公司。
TecanSpectraⅢ酶标仪，奥地利。
2方法
2．1 软骨细胞分离及培养：按照文献方法[21培养牛
关节软骨细胞，用0．25％胰蛋白酶溶液消化分离
单层生长的细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为
l×105／mI。，按每孑L100弘L接种于96孔细胞培养
板中，在37℃、5％CO：、湿度100％的培养箱中恒
温培养。
将粉防己碱溶解在0．01mol／L盐酸中，配制
成100mg／mL溶液后再加入DMEM培养基中。细
胞在培养板中培养48h后换液，加入含有不同质量
浓度(O．5～20mg／L)粉防己碱的培养基，以不加
药物的培养基做空白对照。为了保持实验的一致性，
在所有培养基中都加入等量的0．01mol／L盐酸。
2．2 溴代尿苷酶联免疫吸附(BrdUELISA)测定
细胞增殖：在DNA合成过程中，5一溴一2L脱氧尿苷
(BrdU)可以代替胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到细胞新
合成的DNA中。基于这个原理，通过比色免疫测定
的方法，可以对软骨细胞增殖进行定量分析。软骨细
胞加入含粉防己碱的培养基48h后，加入BrdU，使
其在培养基中的终浓度达到10gmol／L[3]。继续培
养18h，然后使用细胞增殖酶联免疫检测试剂盒，
测定新合成的BrdU—DNA的量。
2．3 MTT试验：软骨细胞在加入含粉防己碱的培
养基48h后，用MTT试验检测细胞活性，利用酶
标仪，在570nm波长处测定吸光度(A)值[43。
2．4糖胺聚糖分泌量测定：软骨细胞在加入含粉防
己碱的培养基培养10d后，测定软骨细胞分泌的总
糖胺聚糖量。用1，9一二甲基亚甲基蓝法，以鲨鱼硫
酸软骨素C作为标准品[s,63，在525nm波长处用酶
标仪测定A值。
2．5 Ⅱ型胶原细胞酶联免疫吸附(CellELISA)
测定：利用细胞酶联免疫吸附试验(wholecell
enzyme—linkedimmunosorbentassay，CellELISA)
检测在含有粉防己碱的培养基中培养的软骨细胞的
Ⅱ型胶原分泌量[7~9]。软骨细胞在含有粉防己碱的
培养基中培养10d后，吸去培养基，用PBS冲洗1
次，用福尔马林溶液(含4％甲醛的PBS)在4℃
固定30min。用PBS冲洗培养板2次，用含有2％
BSA的PBS溶液在37℃封闭无关抗体1h。用
PBS冲洗1次，加入一抗。将小鼠抗Ⅱ型胶原抗体
用含有1％BSA的PBS溶液按照l：1500稀释，
配成一抗工作液，每孑L加入100弘L。37℃孵育1h，
培养板用含有0．05％聚山梨酯20的PBS(PBS／
聚山梨酯)洗4次，加入二抗。将过氧化物酶标记的
羊抗小鼠IgG用含有1％BSA的PBS溶液按照
1：1000稀释，配成二抗工作液。每孔加入100肛L，
37℃孵育1h，然后用PBS／聚山梨酯洗4次。最后
每孔加入200,uL含0．1％邻苯二胺、0．03％H。O：
的100mmol／L柠檬酸钠(pH5．0)溶液作为过氧
化物酶生色底物。显色20min后，每孔加人20弘L
2．25mol／LH：SO。终止反应。在492nm波长处用
酶标仪测定A值。以没有接种软骨细胞的培养板孔
作为空白，对实验数据进行校正。
2．6统计分析：所有各项测试数据除特殊说明外，
每组均取6个平行对照样本(咒一6)，以z±s表示。
通过单向方差分析(one—wayANOVA)来评价结
果的统计差异性。以Scheff6法来衡量组间差异性。
3 结果
3．1细胞增殖：软骨细胞加入含不同质量浓度粉防
己碱的培养基后细胞增殖情况可以通过细胞新合成
的DNA的量反映出来。在DNA合成过程中，通过
BrdU掺入到细胞新合成的DNA中的量，得到了在
不同质量浓度粉防己碱影响下软骨细胞的增殖速
率。图1表明低质量浓度的粉防己碱(2．5mg／L)
可以促进软骨细胞的增殖(P<0．05)，而高质量浓
度的粉防己碱(>10mg／L)抑制软骨细胞的增殖
(P<0．01)。
3．2 细胞活性：通过MTT试验测定培养基中不同
质量浓度粉防己碱对软骨细胞活性的影响。图2表
明低质量浓度的粉防己碱(1、2．5、5mg／L)能够提
高软骨细胞的活性，高质量浓度的粉防己碱(15、20
mg／L)抑制软骨细胞的活性。
3．3糖胺聚糖分泌：图3所示，低质量浓度的粉防
己碱(1、2．5mg／L)能够提高软骨细胞分泌糖胺聚
糖的量，高质量浓度的粉防己碱(10、15、20mg／L)
抑制软骨细胞分泌糖胺聚糖。
万方数据
中草蔼ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷笫12期2006年12月·1849·
一
l
馨
飞
§
暑
弋
一
锲
磐
墓
最
粉防己碱P／(mg·L。)
与粉防己碱0mg／L组比较：。P。P图1不同质量浓度粉防己碱对软骨细胞增殖的影响
Fig．1Effectof etrandrineinvariousconcentra—
tionsonchondrocytesprOliferatiOn
目
基
弋
趟
蚝
基
最
粉防已碱P／【mg·L。1)
与粉防己碱0mg／L组比较：一P’”P图2不同质量浓度粉防己碱对软骨细胞活性的影响
Fig．2Effectof etrandrineinvariousconcentrations
onchondrocytesviability
3．4 Ⅱ型胶原合成分泌：图4表示低质量浓度的粉
防己碱(1、2．5mg／L)能够提高软骨细胞分泌Ⅱ型
胺原的量，高质量浓度粉防己碱(10、15、20mg／L)
抑制软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。
4讨论
本实验结果表明，在体外培养软骨细胞的培养
基中加入粉防己碱，对软骨细胞的增殖、细胞活性、
糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的分泌量都有显著影响。培养
基中的粉防己碱在低质量浓度时，可以促进软骨细
胞的增殖，提高软骨细胞的活性，维持软骨细胞的功
能表达。而当培养基中粉防己碱的质量浓度高于
5mg／L时，软骨细胞的功能表达(糖胺聚糖和Ⅱ型
胶原分泌)即受到抑制，但却仍能促进细胞增殖和
提高细胞活性。当培养基中粉防己碱的质量浓度高
于10mg／L时，细胞增殖和细胞活性也受到抑制。
由粉防己碱对体外培养软骨细胞的作用，结合
f
冒
面
0
耀
磔
警
懿
0 1 25 5 10 15 20
粉防己碱P／(mg·L。1)
与粉防己碱0mg／L组比较：一P’’P图3 不同质量浓度粉防己碱对软骨细胞分泌糖胺聚糖的
影响
Fig．3Effectof etrandrineinvariousconcen—
trationssecretionoft talsGAG
producedbychondrocytes
l
莩
弋
一
蟹
垡
副
蛊
粉防己碱P／【mg·L‘。)
与粉防己碱0mg／L组比较：～P一P图4不同质量浓度粉防己碱对软骨细胞分泌
Ⅱ型胶原的影响
Fig．4Effectof etrandrineinvariousconcen—
trationso secretionofc llagenTypeⅡ
producedbychondrocytes
防己的中医传统临床用途分析，粉防己碱用于风湿、
类风湿性关节炎治疗的机制，可能不仅限于抗炎、抗
变态反应，还有维持软骨细胞功能表达和促进病损
软骨组织修复的作用。
以往的研究表明，大剂量口服和静脉注射粉防
己碱会引起中毒，体外软骨细胞培养实验也得到了
与此一致的结果。按照MTT试验作为细胞毒性评
价的标准，高质量浓度的粉防己碱对软骨细胞具有
细胞毒性。研究结果也提醒临床医生在处方使用粉
防己碱时，应该注意剂量，避免不良反应。
近年来软骨组织工程和软骨组织体外重建研究
方兴未艾，本研究结果表明低质量浓度粉防己碱不
仅促进体外培养的软骨细胞增殖，而且增强软骨细
5
0
5
0
5
0
2
2
l
1
0
O
万方数据
·1850· 中草喃ChineseTraditiolaalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月
胞的功能表达，有利于体外软骨组织重建。在组织工 glycansbyuseofdimethylmethyleneblue[J]·Biochim
程与生物材料研究领域有着很好的应用前景。 [。]嚣黧AMc，taDo,1。98。6。,。8s8．3‘2：。73曩i。，。。。igati。。。f。h。
Referentes2
PEMA／THFMApolymersystemasabiomaterialfor
[1]ReddiAH·Morphogenesisandti sueengineeringofbone cartilagerepair[J]．Biota口terials，2000，21(4)：335—343．
andcartil89e：inductiVesignals，sterncells，andbiomimetic[7]130yanBD，SchwartzZ，SwainLD，et口LInitialef eetsof
biomaterialsEJ]·TissueEng，2000’6(4)：351—359· partiallypurifiedbonemorphogeneticpro eino the
[2]CuiYL’QiAD’LiuWG，etal· Biomimeticsurface
expressionofglycosaminoglycan，coUagen，andalkaline
moditi。8‘10n0 poly(L-lacticacid)w th。h1‘088nand1ts
phosphataseinnonunioncellcultures[J]．ClinOrthop，1992
。ff8。‘8onarticular。ho“d‘o。y‘。8in
vitro[J]·Biomaterials,(278)：286—304．
r]200324(21)：3859-3868．， [8]FrahmsO，Rud。lphP，DworeckC，ef口z．Immun。一
3 MaghniK，NicolescuOM，MartinJG．Suitabilityofcell
⋯
‘
metaboliccolorimetricassavsforassessmentofCD4+Tcell 8n2ymatlc
det8。tlonot th8n。w P。0Ilte‘atlon8s80。1at8d
proliferation：comparisonto5一b omo-2一deoxyuridine(BrdU)protein
p100bymeansofacellularELISA；specificdetection
ELISAⅢ．JImⅢⅫolMethods，1999，223(2)：185—194．ofcellsincellcyclephasesSG2andM[J]-Jlmmunol
[4]MarquesAP，ReisRL，HuntJA．Thebiocompatibilityof
Methods，1999，223(2)：147—153·
novelstareh—basedpolymersandcomposites：in口itrostudies [9]FuhrmannS， KirschMWewetzerK，
etal· Useofcell
[J]．BiomⅡteria[S，2002，23(6)：1471—1478．ELISAforthescreeningof eurotrophicactivitiesonminor
[5]FarndaleRW，ButtleD J，BarrettAJ．Improved cellpopulationsinretinalmonolayerculturesEJ]．JNeurosci
quantitationndiscriminationofsulphatedglycosamino— Methods，1997，75(2)：199—205．
蜂胶提取物对流动血液中血小板与纤维蛋白原聚合作用的影响
张云香1’2，李伟1，潘艳华3，韩纪举1，任道玲1，吴亚平4，王家富p
(1．泰山医学院，山东泰安271000；2．潍坊市人民医院，山东潍坊261041；
3．泰安市中心医院，山东泰安271000；4．乌特勒兹大学，荷兰)
在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发
生、发展过程中，脂质代谢紊乱、血管内皮损伤、炎症
反应和血栓形成等因素起关键性作用。血栓的形成
常与血小板、血管、凝血因子、纤溶系统、抗凝系统、
红细胞、白细胞、血黏度和血液流变性等因素有关。
其中血小板数量增多，黏附、聚集性增高、血液凝固
性增强和纤溶活性减弱等尤为重要。在高切变率条
件下，血小板黏附聚集是依赖于vonWiIlebrand
factor(vWF)与血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)
Ib的交互作用，导致血小板活化和血小板整合素
％“风的构象改变，使整合素上的纤维蛋白原
(fibrinogen，Fg)与血小板之间形成的稳定的聚集
物网络群口]，造成附壁血栓的形成，促进了AS的发
生、发展。因此，抗血小板黏附和聚集在AS的防治
中具有重要作用。
蜂胶是蜜蜂采集松树和杨树等植物的芽孢分泌
物和树脂等，并混入蜂蜡及其上颚腺分泌物混合而
成的一种具有芳香味的胶状物。其抗炎、抗肿瘤、免
疫调节等作用已研究甚多[2叫]，但改善血小板活性
的形态学研究尚未报道，本实验运用体外灌注的方
法，研究了蜂胶提取物对血小板与纤维蛋白原聚合
功能的影响。
1材料
1．1药物与试剂：7mg／mL纤维蛋白原(荷兰乌
特勒兹大学吴亚平博士赠送)；阿魏酸(批号
20031118 国药集团化学试剂有限公司)；蜂胶24％
乙醇提取(EEP，源自新鲜的泰山松柏蜂胶)；肝素
钠(天津市生物化学制药厂)；牛血清白蛋白(BSA，
上海伯奥生物科技有限公司)；乙醇和甲醇均为分析
纯；三蒸水。阿魏酸和蜂胶提取液均用24％乙醇配
制成2．0mg／mL溶液用于灌注实验口]。
1．2设备：体外灌流设备一灌流池(荷兰乌特勒兹
大学血栓与凝血实验室提供)见图1，恒温水浴箱
(宁波新芝生物科技股份有限公司)；micromfusion
收稿日期：2006—03一10
基金项目：山东省教育厅基金资助项目(J00K62)
作者简介：张云香(197l一)，女，山东省潍坊市人，主治医师，硕士，2006年上半年在荷兰乌特勒兹大学从事血栓与凝血研究，现于潍坊
市人民医院病理科工作，研究方向为AS的发病机制。E—mail：dewdrop720@163．corn
*通讯作者王家富Tel：(0538)6229902E—mail：jfwang@tsmc．edc．cn．
万方数据
粉防己碱对体外培养软骨细胞的影响
作者： 崔元璐， 姚康德， 戚爱棣， 王虹
作者单位： 崔元璐(天津中医药大学,中医药研究中心,天津,300193;天津大学高分子材料研究所,天津
,300072;天津中医药大学,方剂学省部共建教育部重点实验室,天津,300193)， 姚康德(天津
大学高分子材料研究所,天津,300072)， 戚爱棣(天津中医药大学,方剂学省部共建教育部重
点实验室,天津,300193)， 王虹(天津中医药大学,中医药研究中心,天津,300193;天津中医
药大学,方剂学省部共建教育部重点实验室,天津,300193)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(12)
被引用次数： 5次

参考文献(9条)
1.Reddi A H Morphogenesis and tissue engineering of bone and cartilage:inductive signals,stem
cells,and biomimetic biomaterials[外文期刊] 2000(04)
2.Cui Y L;Qi A D;Liu W G Biomimetic surface modification of poly (L-lactic acid) with chitosan and
its effects on articular chondrocytes in vitro[外文期刊] 2003(21)
3.Maghni K;Nicolescu O M;Martin J G Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment
of CD4+ T cell proliferation:comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU)ELISA[外文期刊] 1999(02)
4.Marques A P;Reis R L;Hunt J A The biocompatibility of novel starch-based polymers and
composites:in vitro studies[外文期刊] 2002(06)
5.Farndale R W;Buttle D J;Barrett A J Improved quantitation and discrimination of sulphated
glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue 1986(02)
6.Wyre R M;Downes S An in vitro investigation of the PEMA/THFMA polymer system as a biomaterial for
cartilage repair[外文期刊] 2000(04)
7.Boyan B D;Schwartz Z;Swain L D Initial effects of partially purified bone morphogenetic protein on
the expression of glycosaminoglycan,collagen,and alkaline phosphatase in nonunion cell cultures
1992(278)
8.Frahm S O;Rudolph P;Dworeck C Immunoenzymatic detection of the new proliferation associated
protein p100 by means of a cellular ELISA:specific detection of cells in cell cycle phases S,G2 and
M[外文期刊] 1999(02)
9.Fuhrmann S;Kirsch M;Wewetzer K Use of cell ELISA for the screening of neurotrophic activities on
minor cell populations in retinal monolayer cultures[外文期刊] 1997(02)

引证文献(5条)
1.谢文.冯坤 中药对体外培养软骨生长作用的研究进展[期刊论文]-世界中西医结合杂志 2008(9)
2.曹金.杨兆文.李凤.赵洪艳.张源潮 汉防己甲素的临床应用进展[期刊论文]-世界临床药物 2013(2)
3.武文君.徐先祥.夏伦祝.戴岳 植物有效成分治疗骨关节炎的研究进展[期刊论文]-中国野生植物资源 2008(4)
4.胡长玲.林兵.郑承剑.秦路平.韩婷 抗类风湿性关节炎的天然药物及其作用机制研究进展[期刊论文]-中草药
2011(7)
5.王丽红.何英 中西医治疗骨关节炎的研究进展[期刊论文]-中国老年学杂志 2011(10)

本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200612033.aspx