全 文 ：·908· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月
巴戟天与常见混伪品的rDNA—ITS序列分析及其分子鉴定
丁 平，方 琴
(广州中医药大学中药学院，广东广州 510405)
摘要：目的 比较巴戟天与常见混伪品之间的rDNA—ITS碱基序列的差异及其规律，同时为巴戟天及混伪品的
指纹图谱鉴别提供分子标记。方法 对巴戟天及其常见混伪品的rDNA—ITS进行了PCR扩增、测序，并运用
CLUSTALX、MEGA软件对该区进行序列分析。结果测定了巴戟天及其混伪品的rDNA—ITS区序列，包括
ITSl、5．8s和ITS2全长序列以及18S、26S部分序列。巴戟天与假巴载天、羊角藤在ITSl和ITS2区的差异性分别
为2．9％～5．8％和2．9％～4．2％，而与虎刺在ITsl和ITS2区的差异性则为21．2％和18．9％。根据ITS序列
特征构建的系统树，混伪品假巴戟天与羊角藤首先聚类，然后与巴戟天聚在一起，而虎刺则单独聚为一支。结论
rDNA—ITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法。
关键词：巴戟天；混伪品；核糖体DNA内转录间隔区
中图分类号：R282．710．3文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)06—0908—04
RibosomalDNA—ITSsequenceanalysisandmolecularidentification
ofMorindaofficinalisanditcounterfeitsp cies
DINGPing，FANGQin
(CollegeofChineseMateriaMedica，GuangzhouU iversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China)
Abstract：ObjectiveTocomparetherDNA-ITSdifferentiationanditsregulationbetweenMorinda
officinalisanditcounterfeitsp cies，andprovideDNAmolecularmarkersforthefingerprintide ification
ofthem．MethodsTherDNA—ITSregionsfM．officinalisanditscounterfeitsp ciesw reamplifiedand
sequenced。thenanalyzedbymeansofCLUSTRALXandMEGAsoftwares．ResultsTheinternaltr n—
scribedspacers(ITS)includingITSl，5．8S，ITS2，andpartial18Sand26Sweredetermined．InDNA
DISTanalysis，therangofdiversityamongM．officinalisandM． hughuaeusis，M．umbellatawas
2．9％一5．8％and2．9％一4．2％basedonITSlandITS2；therangeofdiversitybetweenM．officinalis
andDamnacanthusi dicuswas21．2％and18．9％basedonITSlandITS2．Phylogenetictreebasedon
ITSand5．8SsequencedataindicatedthM．umbellataandM．s^“口咒g矗“口P，zsi5werecloselyrelatedhen
withM．officinalis，whileD．ind cuswamonophyleticgroup．ConclusionTherDNA—ITSsequenceisa
bettermolecularmarkerfoidertificationofM．officinalisanditscounterfeitspecies．
Keywords：MorindaofficinalisHow；counterfeitspecies；ribosomalDNA—internalt anscribedspacers
(rDNA—ITS)
巴戟天别名鸡肠风(广东、广西)、鸡眼藤、黑藤
钻、糠藤、三角藤(广西)、兔儿肠、兔仔肠、猫肠筋(福
建)。巴戟天为常用中药，是著名的“四大南药”之一。
《中华人民共和国药典》收载的巴戟天来源于茜草科
巴戟天属植物巴戟天MorindaofficinalisHow的
根，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿之功效。其主要活
性成分为蒽醌、环烯醚萜类、低聚糖、多糖等[1]。巴戟
天属(MorindaLinn．)植物在全世界约有100种，分
布于热带、亚热带和温带地区，尤以亚洲和大洋洲最
多，美洲和非洲有少数。我国产约26种、6变种，分
布于西南部到东南部，以及台湾和香港地区[2]。由于
近几年巴戟天有效成分的深入研究，巴戟天作为药
食两用的资源得到了广泛的开发和利用。但由于栽
培与种植仍满足不了目前的需求，市场上屡屡出现
混伪品，如假巴戟天、羊角藤、虎刺等，这些药材和原
植物在外形上与巴戟天极为相近，尤其是同属的假
收稿日期：2004—06—08
基金项目：广东省科技计划项目(2003C34401)；广东省自然科学基金项目(04010057)
作者简介：丁平(1965一)，女，河南汝南人，研究员，博士，主要从事中药资源及中药质量标准的研究。Tel：(020)39358063
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月·909·
巴戟天、羊角藤，更是容易以假乱真，因此，解决中药
材的来源问题仍是目前急需解决的问题，也是中药
走向现代化的瓶颈问题。而近几年分子生物学中
DNA分子遗传标记技术的研究则为解决该问题提
供了客观而有效的手段。DNA分子标记技术用于中
药材鉴定和品质评价等方面的研究已有很多的报
道，关于植物核糖体DNA中的内转录间隔区(ITS)
序列测定已广泛用于中药材近缘属间，属内以及种
内居群问的差异性研究[3“]。但在巴戟天属植物中尚
未见有这些方面的研究，因此本研究通过对rDNA—
ITS序列差异分析，对巴戟天及其近缘植物和常见
混伪品的遗传关系作深入的研究，并为制定巴戟天
分子指纹图谱以及准确进行巴戟天及混伪品的鉴别
提供客观依据。
1材料与方法
1．1材料：材料来源见表1，所有材料均为新鲜叶
片，以硅胶于燥，笔者经形态鉴定确定其学名。
1．2 DNA提取和检测：参照PlantDNAIsolation
Kit实验步骤改进，具体如下：植物叶片经蒸馏水洗
净后剪碎，在钵体中用液氮冷却碾碎成细粉。取100
mg加入6倍预热至60℃的CTAB提取缓冲液，10
肛L蛋白酶K，4弘L核糖核酸酶A及10弘L2一ME
水浴温育30min。加入等体积抽提液氯仿一异丙醇
(24：1)抽提，15000xg离心10min。取上清液加
2／3体积的异丙醇及1／10体积的3mol／LNaAc，完
全混匀，0℃放置20min，以100 0Xg离心10min，
弃上清液，用80％和70％乙醇洗DNA两次，室温干
燥30min，加适量TE缓冲液溶解DNA，存于4℃待
用。取5弘L提取的DNA于0．8％琼脂糖凝胶(含1
弘g／mLEB)上，用0．5xTBE电泳缓冲液在10V／
cm电泳1h后，琼脂糖凝胶外的DNA谱带通过EB
染色后，在紫外光(254nm)下观察抽提结果。
1．3 ITSl和ITS2的扩增、纯化和测序：扩增ITS
序列引物依据文献设计[5“]。引物序列为：正向AGA
增，或分别扩增ITSl和ITS2，分别扩增时使用1对
内引物，分别为：正向GCATCGATGAAGAAC
GCAGC，反向GATGCGAGAGCCGAGATA
TCCGTT。取约10ng样品DNA，加入0．2mmol／
LdNTPs，0．2ttmol／L引物，1．5mmol／LMgCl2，1
UTaqDNA聚合酶(上海生工公司)及1×缓冲液，
加入ddH：O使总体积为20肛L，置于PE480型PCR
扩增仪中，94℃、1min45S后，按下列参数进行40
个循环：94℃、30S，45℃、30S，72℃、30S，最后
72℃、7min。用1．5％琼脂糖凝胶(含1Ftg／mL
EB)电泳检测PCR扩增产物。在胶中回收、纯化
PCR扩增片段(胶回收试剂盒，上海生工公司)或
PCR产物直接纯化(PCR产物纯化试剂盒，上海生
工公司)后，用四色荧光标记的双脱氧链中止法测序
(PE—ABI377全自动测序仪，上海鼎安生物科技有
限公司)，为保证序列的准确性，用2次PCR产物测
序或用反向引物再测。
1．4 序列分析和系统发育树构建：所得序列用
CLUSTALX(Version1．8)同源对齐，必要时用手
工排序；ITSl和ITS2的位置参照其二级结构和文
献确定[6|。用MEGA(Version2．1)分别计算各样品
ITS序列的差异性(Kimura2一parameter)，用最大
简约法(maximumparsimony，MP)和邻接法
(neighbor—joining，NJ)构建系统发育树，并以boot—
strap作100次可信度分析。将序列鉴定结果与形态
鉴定结果核对，确认后在GenBank登记注册，其注
册登记号见表1。
2 结果
本研究测得巴戟天属3种植物和虎刺属一种常
见混伪品的片段包括ITSl，5．8S和ITS2全长序列
以及18S，26S部分序列，长度为691～700bp。从图1
中可见，部分18S，26S序列长度分别为61和68bp，
5．8S全长为13lbp，编码区序列严格保守，而ITSl
和ITS2序列长度和碱基组成随种类不同而有差异，
AGTCGTAACAAGTTCCGTAGG，反向 ITSl和ITS2长度和GC含量详见表1和图1。
TCCTCCGCTATGATATGC。ITS整段扩 本研究中巴戟天及其常见混伪品的ITSl和
表1 巴戟天及其3种混伪品ITSl和ITS2序列G+c含■、长度及在GenBank的注册登记号
Table1 G+CcontentsandlengthsofITSlandITS2ofM．officinalisandthree
counterfeitsp ciesandtheirregisterednumbersinGenBank
万方数据
·910· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月
*18S *ITSl
2601AG从GTOGTAAC从GGT-rTCcGTAGGTG从OcrGOGG从GGATcATT TCG从TCcTGCCOGA—CG从CGAOcGCG从cC
2501AG从GTcGTA^CA^GGTTTCcGTAGGTG从CcTGcGGAAGG^Tc^町GTCG从TCcrGCCOGA—0G从oG^ccGoG从cc
2001^G^^GTOGT^ACA^GGT’rrCC研^ GTG^AOCTG ：(；(；从GGATC^TTGTCGAA CC?f’GcCCGAAC^AAcGACCGOGAACA
2602AG从GTOGTAAcAAGGTTTCCGTAGGTG从OcrGOGG从GGATC^TT TcG从 CCmcCCTAGCAGAccAcTGOG从CA
OGTTG^一^C^ACcGCcGGGcG cGGc GcGOGGGAGAcccCGCcOGTcGG删OGAGCCC从cTT从CTccOGGOGc
c(；℃^-^CAAa弼0。GGGGlⅪGGo()GGCGIDGG(、A从CCcI’GCOOGTOGa℃000GAGaocAAal．从a旧c()。GOGC
CGTTGA-AcAAcTGCcGGGcGccGGOGGGcO GG从AccCcG000∞cGG T咖AGOccAAOcT从CTcc0GGcGC
cGTT从OG从A∞GOGGGACGO I黜GGGGG从AcCAOGOcoGTCGGcT00c0队一C^AAACCAAAcT T0GlGcAC
GG“TGcGccAAGGAATACTC AAcGG^TGGccGGc0GccCTGOGGcTTC0GOGGGGcGAGOcGAGoGTCTGATOGTTTA
GGAATGOGcc从GG从TACrcA^ACGG^TGGCcGGOCGccocGcGGcTTC0GCGGGGCGAG0cGAGOGTCT ATcGmA
GGAATGCGoc从GG从TAcTCAAAoGGATGGccGGccGGCccGcGGClTCGcGGGGOGAGccGAGCGTCT ATcGmA
GGAATGTG<．)c^^《；^^^’I、^(?rCAA^CGGAccGTCGGCCTOCTCGCGGCTTCcGCGGGGGGCGCCGTGOGTCTG^TCGCTTA
宰5．8S
AccAAAAoGAfircTcGGCAAc GATATcTCGGcTcTcGcATcGATG从GAAcGTAGOG从ATGOGATACTTGGTG GA^T
^cc^A^^oG^cTcTCOGC从oGGAT^TcTCGGcTCrcGcATcGATG从GAA∞tAGCG从A1Ⅸ吼TACTTG删AAT
ACC从从0GACTcTCGGC从0GGATATcTCGGcTc GcATOGATG从GAACGTAGcG从ATGOGATACTTGGTG GAAT
AcA从从cGACTcTOGGC从cGGAT^TCTCGGcTc cGcATOGATG从GAAcGTAGOG从ATGOGATAcTTGGTG GAAT
*ITS2
TGcAG从TccCGTGA^CcAT0G^GTrIvrTG从∞cAAG竹GcGCocG从GoC^TTAGGCcG^G GC^CGTcTGOCrGGGC
TGc^GAATcCCGTG从ccATG=^GTTTTl’G从OGc^^GTTGcGCccGAAGccATTAGGcTGAGGGcAcGT∞GOcTGGGc
TGcAG从TccGGTG从CCATOGAGlvr-兀TGAAa CAAGTTGcGcCcGAAGCCATT^GGcTGAGGGcAOGTcTGccTGGGc
TGcAG从TCCOGTG从ccATGAGTTTTTG从0GcA姗．GcGOOcG从GocATCAGGccGAGGGCACGTCTGOcTGGGc
GTC^GGcATcGcGTcGOoGC嘲CcTcGcOcT^GAA^TTC GAc0GACGGGGGTGA∞GAAGTTGGCcTcocGT 0 c
GTcACGcATCGcGTcG0cAC删OcTOGocTAG从ATT GAOGGACGGGTGAOGGATGTTGGCCTcc0GTGccc
GTcACGcATCGNGTcGOcAC嘲CCTGG0cTTAGG从TTO GAoGGGcGGGGGTGAOGT TTGGccCcccGTGcCC
GTcACGcAccGcGTCGTcACCccc_一—cAc G丁COGGTcAOGGGCOGACGGGGATGAOGGATATTGGcCTcCOGTGccc
TcGOGGOGcGGOC GOcT从AcGcGAGTccOcGGcccGGGAOGTcAOGACGAGToGTGGT1眦唧CAAcTcGAGAG
cCGOGGOGOGGcC GccT从^TGOG^GTcCTCG ccCGGGAOGTCACGACGAGTGGTGGT从CccTTC从cTOGAGAG
TcGcGGOGcGGc 嘲AATGcG_^GTccTcGGCccGGGACGTCAOGACG^GTGGTGGTAAcccTTC从CTOGAGAGOcG7瞄0GcG麟OcT从ACGcGAGTTCOOGc AcGGGAO cAoGACGAGTGGTGGT从CTGcTC从CAoG_ATTG
26S
cOGTcGAGACGAcGOccGACGGGG从凹cT从CGAOO∞AGGGcTATOGGcccc7舰∞GA AGGAGCoGOGAGC研TOG
COGToG^G^CGAcG0c0GACGGG_从crCCNAcG_ACccTAGGGcTATcGGccCC一—-GAGAGGAGCOGOGA OcTTOG
00GTOGAGAcGAcGcoOGAcG GG从cTcT从cGAcOcrA脚GToGGC cC一—GA A僦cG0GAGccrTCG
CTGTcGCGACG^a淞DCGACGGGGA．CTUlAOCGAC0cTAGA OGAOGGCocC——_GA^AGGAGTCA0GATOcl了0G
A00GoGAOccCAGGTCAGGCGGGATTACcCGcTGAGlvrTAAGC TATC从T从GOGGAGG从
ACCGCGACCCC^GGTcAGGCG(mTTA00cGcTG^GmAA C T^TC从TAAGOGGAGG从AOCGOGACcc删CAGGcGGGATTA0ccGCTGAGTTTAAGC TATC从T从GOGGAGG从
ACCGoGAI：CCC^GGTCAGGCGG ^，fTAo。CGC?rI≥～G7r．rTAAGC^TATC¨TAAGCGGAGGAA
图1 巴戟天及其常见混伪品的ITS序列排列
Fig．1AlignedITSsequencesofM．officinalisanditscounterfeitsp cies
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第6期2005年6月·911·
ITS2区序列差异性见表2。表中ITSl和ITS2的差
异性范围分别为2．9％～26％，2．9％～18．9％，差
异最小的均为2601与2501之间，差异最大的出现
在2602与其他3种之间。
表2 巴戟天及其混伪品rDAN—ITS序列的差异
Table2 DiversityofrDNA—ITSsequencebetween
M．officinalisanditscounterfeitsp cies
标本 2601 2501 2001 2602
2601 0．029 0．042 0．183
2501 0．029 0．029 0．189
2001 0．058 0．052 0．189
2602 0．260 0．251 0．212
*下三角为ITSl的差异性，上三角为ITS2的差异性
*downtriangleisdiversityofITSl，uptriangleisdiversityof
ITS2
根据序列特征用几种方法构建的系统发育树结
果一致，bootstrap可信度分析在82％以上(图2)。
混伪品假巴戟天与羊角藤首先聚类，然后与巴戟天
聚在一起，而虎刺则单独聚为一支，这与传统分类结
果相一致，巴戟天与混伪品假巴戟天、羊角藤均为巴
戟天属植物。而虎刺为虎刺属植物，与巴戟天的亲缘
关系最远。
2601
01
2602
图2 巴戟天及其常见混伪品的系统发育树
(分支上数值为靴带可信度)
Fig·2DendrogramofM．officinalisanditscounterfeit
species(Numbersabovrancharebootstrap
percentagesv luesbyreplication)
3讨论
在本研究中，由于巴戟天含有较多的植物多糖
成分，在DNA提取过程中存在一定的困难，笔者改
进方法，用多种极性大的溶剂去除糖分，从新鲜植物
叶片中提取到了较高质量的总DNA。利用通过引物
进行PCR扩增，可得到预期的rDNA—ITS片段。同
时因高等植物rDNA～ITS区的拷贝数极多，在使用
过程中不易受材料总DNA降解的影响，因此利用
该方法较易提取到稳定的DNA产物。
经过rDNA—ITS基因测序表明，ITSl和ITS2
区的长度分别为：巴戟天181、255bp，假巴戟天
180、255bp，羊角藤为180、260bp，虎刺为181、250
bp。因所见混伪品中假巴戟天、羊角藤为巴戟天同
属的植物，差异较小(ITSl：2．9％～5．8％和ITS2：
2．9％～4．2％)。而虎刺则为虎刺属(Damnacanthus
Gaerth．f．)的植物，差异较大(ITSl：21．2％～26％
和ITS2：18．3％～18．9％)。根据rDNA—ITS的序列
比较可看出，巴戟天及其以上几种常见的混伪品在
rDNA—ITS序列中存在较大的差异，且这种差别具
有较好的稳定性，并且通过以嫩叶反复测定后得到
验证，结果准确可靠。通过这些序列差异比较表明，
rDNA—ITS序列能较好地反映出巴戟天及其混伪品
种间的差异，因此可利用该方法找出一种较好的分
子指纹图谱鉴别标记特征，以用于巴戟天及其常见
混伪品的准确鉴定。在应用过程中可将以上序列作
为一个标准对照，输入计算机库中，利用巴戟天以其
伪品的序列数据库及遗传分析软件，通过待检药材
的rDNA～ITS区序列测定，与计算机数据库中巴戟
天及其常见混伪品的rDNA—ITS区全序列进行分
析比较，只要所测基因序列与已知对照序列相一致，
就可以成功鉴别巴戟天及其混伪品的品种。
虽然DNA测序技术操作复杂，但稳定性好，准
确性高，且具有较好的重现性，因此作为中药材真伪
鉴别的指纹图谱分子标记方法，具有客观和实用的
特点，并且随着DNA测序成本的降低，此方法将会
进一步得到推广和应用。
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万方数据
巴戟天与常见混伪品的rDNA-ITS序列分析及其分子鉴定
作者： 丁平， 方琴， DING Ping， FANG Qin
作者单位： 广州中医药大学中药学院,广东,广州,510405
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(6)
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