全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 713·
·药材与资源·
半夏多倍体复合体基因组DNA甲基化状态的MSAP分析
薛梅1，陈成彬2，陈
(1．中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京
力2，马小军1。
100094；2．南开大学生命科学学院，天津300071)
摘要：目的分析半夏多倍体复合体DNA甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式)。方法应用甲基
化敏感扩增多态性(methylationsensitiveamplifiedpolymorphism，MSAP)技术，采用34对引物进行选择性扩增。
结果扩增共得到7708条带，其中5636条带为甲基化多态性带在半夏7倍、8倍、9倍、10倍体值株间DNA甲基
化水平变化不大。总扩增位点甲基化水平在54％～58％，全甲基化率为24．1％～24．3％，高倍性植株甲基化程序相
应比较高。除甲基化水平稍有变化外，半夏不同倍性株间的DNA甲基化模式也形式各异，检测到的带型分为两大
类(I和I型)。其中，不同倍性间DNA甲基化状态保持不变的位点占52．5％，归为】型；少部分检测位点(占
47．5％．归为I型)的DNA甲基化模式在不同倍性间存在显著差异。结论半夏多倍体复合体各倍性植株间存在
大量的胞嘧啶甲基化变异且整体甲基化水平较高。
关键词：DNA甲基化，半夏；多倍体复合体；甲基化敏感扩增多态性
中国分类号：R282．12 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11—1713一04
DNAMethylationofpolyploidc mplexofPinelliaternatabyMSAPanalysis
XUEMeil，CHENCheng—bin2，CHENLi2，MAXiao—junl
(1．InstituteofMedicinalPl ntDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCo lege，
Beijing100094，China；2．CollegeofLifeScience，NankaiUniversity，Tianjin300071，China)
Abstract：ObjectiveToanalyzethDNAmethylations atusofpolyploidcomplexofPinellia
ternata．MethodsMethylationsensitiveamplifiedpolymorphism(MSAP)techniquewascarriedouto
analyzethemethylations atusofpolyploidcomplexofP．ternata．Thirty—fourselectiveprimer
amplificationswereusedtocheckthestatusofcytosinemethylationDNAsamples．ResultsAtotalof
7708bandswereobtained．Amongthem5636bands，eachrepresentingarecognitionsitecleavedbyone
orbothoftheisoschizomers(HpaI andMsI)，wereamplified．Furthermore，methylationpatterns
variedamongthefourpolyploids：heptaploid，octoploid，nonuploid，anddecaploid．Totalandfull
methylationlevelsinP．ternatawere54％一58oAand24．1％一24．3％．AUtypesofMSAPpatterns
detectedinthestudybelongedtotWOclasses，typeI andI．52．5％ofdetectedbandsbelongedtoType
I；Another47．5％weretypeI，whichshowedthemethylationdifferencesamongthefourpolyploids．
ConclusionTheresultsdemonstrateDNAm thylationeventsoccurinP．ternatandthegeneral
methylationlevelsarehigher．
Keywords：DNAmethylation；Pinelliaternata(Thunb．)Breiti polyplo dc mplex；methylation
sensitiveamplifiedpolymorphism(MSAP)
表观遗传学(epigenetics)研究的是没有DNA
序列变化的、可遗传的基因表达改变L1]。进入后基因
组学时代，其已成为当前分子生物学研究的热点领
域之～。DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容
之一，参与基因的差异表达、胚胎发育、细胞分化、染
色质失活、基因组印迹、转基因沉默等多个生物学过
程[2’3]。因此，DNA甲基化的研究备受重视。检测
DNA甲基化的方法有多种，其中，甲基化敏感扩增
多态性(methylationsensitiveamplifiedpoly-
morphism，MSAP)技术操作简便、高效且敏感，已
被广泛应用于多种植物基因组DNA甲基化的水平
和模式分析[“引。MSAP技术是Reyna—Lopez等[6]在
AFLP技术基础上建立起来的，首次被用来检测真
菌的基因组DNA甲基化。该技术采用两个同裂酶，
／-／paI和MspI，这两个酶都识别和切割57-CCGG
的四核苷酸位点，但对甲基化敏感程序不同。／-／pa
收稿日期：2008—02—05
基金项目：教育部博士点基金项目(20040023022)
*通讯作者马小军Tel：13877131887E—mail：xjma@public．bta．net．Cn
万方数据
·1714· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
I不识别双链上的胞嘧啶甲基化，但它可以对仅一
条链上胞嘧啶甲基化的位点进行酶切；而MspI可
以识别单链或双链上内部胞嘧啶甲基化，但不识别
外部胞嘧啶甲基化，即仅不能消化含4CCGG
或1C“CGG的位点[7]。该方法是检测植物全基因组
DNA甲基化状态非常有效的方法。
本研究首次利用MSAP技术从全基因组水平
上对常用中药材半夏7倍、8倍、9倍和10倍体植株
的DNA甲基化水平和模式进行分析。
1材料和方法
1．1材料：半夏Pinelliatern ta(Thunb．)Breit．，
采自湖北潜江、安徽鹞落坪、河北安国和山东莒县，
栽种于中国医学科学院北京协和医学院药用植物研
究所内。经染色体数目鉴定后，取半夏7倍、8倍、9
倍和10倍体植株的幼嫩叶片迅速冻于液氮中备用，
染色体数目鉴定参照陈成彬等E8]的方法。 ‘
1．2 DNA的提取：采用修改后的CTAB方法[9]，同
时提取相同培养条件下的半夏7倍、8倍、9倍和10
倍体植株的总DNA，用不含DNase的RNase
(Takara)处理总DNA，除去可能含有的RNA污染。
用紫外分光光度计(NanoDrop)测定DNA的浓度和
纯度，琼脂糖凝胶(0．8％)电泳观察其质量。总DNA
存于一20℃待用。
1．3酶切、连接及PCR扩增：将DNA分别稀释至
400ng／弘L，用识别四碱基的／-／pa1和MspI同裂
酶(promega)分别与识别六碱基的核酸内切酶EcoR
I(promega)组合对样本DNA进行双酶切，酶切反
应体系为10pL。第1个反应中，1弘L样本DNA，1×
T4连接酶缓冲液(含1mmolATP)，EcoRI和I-Ipa
I内切酶各3U，37℃保温过夜。第2个酶切反应的
条件同第1个反应，只是内切酶组合为EcoRI和
与EcoRI和I@aI／MspI酶切位点互补的人工
接头(表1)。接头连接体系为20弘L，其中T4连接酶
(上海生工)1．5U，EcoRI和l-IpaI／MspI接头
各50pmol，16℃连接过夜。应用AFLP扩增程序进
行预扩增和选择性扩增。预扩增反应体系为25肛L，
其中含有1×PCR缓冲液，200mol／LdNTPs
(Takara)，0．5mol／L预扩增引物(表1)，1肛L
DNA连接反应混合物，1U死口DNA聚合酶
(Takara)。反应条件为：94℃、30s，56℃、1min，72
℃、1rain，21个循环，72℃延伸10min。预扩增产物
稀释20倍，供选择扩增用，选择扩增体系同上。条件
为：94℃、30S，65～56℃、30S，72℃、1rain，13个
循环，以每个循环降0．7℃进行降式PCR扩增；94
℃、30S，56℃、30s，72℃、1min，23个循环，72℃
延伸10min。
1．4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：取2弘L选择扩增
PCR产物与等体积的上样缓冲液混合，94℃变性10
rain，冰浴2min后，上样于6％变性聚丙烯酰胺凝胶
进行垂直板电泳(DYCZ2813型号电泳仪，北京六一
厂)，30W，电泳2h后银染观察。
2结果
2．1 MSAP分析：为研究半夏7倍、8倍、9倍和10
倍体植株DNA甲基化状态发生的变化，采用MSAP
技术对4个倍性半夏DNA甲基化水平和模式进行
分析(图1)。实验中对DNA提取、酶切、接头连接、预
扩增及选择性扩增反应、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
均进行了3次重复，以避免实验过程中的假阳性。共
采用34对引物(表1)进行选择性扩增，结果显示
MSAP带型具有很好的稳定性，并对其进行了统
计，共得到7708条带。
2．2不同倍性半夏植株DNA甲基化水平：7倍、8
MspI。随后，在酶切片段的两端加上人工设计的 倍、9倍和10倍4个倍性半夏的DNA分别用甲基化
裹1 MSAP分析的接头和引物序列
Table1 SequenceofadaptersandprimersusedforMSAPanalysis
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 715·
E35／(H／M)24 E35／(H／M)25
ml-7倍体半夏的＆根I／MspI酶切、扩增产物
h1—7倍体半夏的EcoRI／HspI酶切、扩增产物
m2—8倍体半夏的EcoR1／MspI酶切、扩增产物
h2—8倍体半夏的EcoRI IHs／,i酶切、扩增产物
m3—9倍体半夏的EcoRI／Msp1酶切、扩增产物
h3·9倍体半夏的EcoRI／HspI酶切、扩增产物
m4—10倍体半夏的EcoRI／MspI酶切、扩增产物
h4—10倍体半夏的EcoRIIHspI酶切、扩增产物
扩增所用引物组合标明在其顶部：M一相对分子质量(50bpladder)
ml—fragmentsobtainedafterdigestionw thEcoRI／MspI from
heptaploidhl—fragmentsobtainedafterdigestionwithEcoRI?
／-&aI fromheptaploidm2-fragmentsobtainedafterdigestion
withEcoRI／MspI fromoctoploidh2一fragmentsobtainedafter
digestionw thEcoRI／HpaI fromoctoploidm3一fragments
obtainedafterigestionw thEcoRI／MspI fromnonuploidh3一
fragmentsob ainedafterdigestionwithEcoRI／／-／pa1 from
nonuploidm4-fragmentsobtainedafterdigestionw thEcoRI f
MspI fromdecaploidh4-fragmentsobtainedafterigestionw th
EcoR1／l-lpai fromdecaploidPrimercombinationswere
indicatedontopoffigureM--Markerof50—-bpladder
图1 MSAP分析不同倍性半夏DNA甲基化电泳图
Fig．1Electrophuretogramofmethyl tiononp lyploid
complexofP．ternatabyMSAPanalysis
敏感性不同的限制性内切酶组合EfDRI／HpaI
(H)和EcoRI／MspI(M)消化、连接、预扩增后，
采用不同的引物组合进行选择性扩增。考虑到所用
凝胶的有效分离范围和条带的可重复性，试验中只
对大小位于100500bp的片段进行了统计，每个
泳道中检测到的条带数目从15～50条不等。总的甲
基化扩增片段数(包括全甲基化和只有一条链甲基
化的半甲基化)分别为1072、1060、132、118，总
扩增位点的甲基化水平(总甲基化片段数／总扩增片
段数)分别为56．1％、54．4％，58．1％、58．2％，而其
中全甲基化(双链都为5-C。CGG一37)的带数分别为
460、471、469、468，全甲基化率(全甲基化带数／总扩
增片段数)分别为24．1％、24．2％、24．2％、24．3％
(表2)。
裹2 4个倍性半夏DNA甲基化水平
Table2 Methylationlevelsoffourpolyploids
fromP．ternata
样品 甲基化总带数总甲基化率／％全甲基化带数全甲基化率／％
5636个甲基化位点所呈现出的分布模式可分
为两大类(I和I)，I型为单态性位点，它们在不同
倍性半夏中带型模式相同不表现多态性；I型为多
态性位点，在不同倍性半夏中带型有差异，显示多态
性条带。I型主要有两种模式，I一1型为全甲基化
类型，Hpa1不能识别并切割，而MspI能识别并
切割，从而产生(1、o、1、o、1、o、1、o)的模式(将甲基
化敏感限制性内切酶不能识别并切割，最终没有扩
增产物的记为“o”，而能被酶识别并切割，在泳道中
有扩增带出现的记为“1”)。反之，I-2为半甲基化
类型，HpaI能识别并切割，而MspI都不能切割
的位点，产生(o、1、0、1、0、1、0、1)的模式。具备这两
种带型的共有2960条，显示在半夏各多倍体间有
52．5％的甲基化位点的状态保持不变。I型占
47．5％，模式比较复杂，主要体现在不同倍性之间相
同位点的甲基化状态不同，包括去甲基化、单
链1CCGG或“C4CGG与“CCGG之间的转换。
3讨论
本研究结果显示半夏基因组总甲基化水平为
54．4％～58．2％，这只是对基因组中部分同裂酶识
别位点(CCGG)的胞嘧啶进行了检测，而这些胞嘧
啶也只是基因组中的一小部分胞嘧啶，所揭示的甲
基化水平只反映了CG或部分CCG核苷酸序列中的
甲基化程度，在植物中，甲基化也会发生在CAG、
CTG序列中[71；因而半夏整个基因组中胞嘧啶的甲
基化率应高于本实验的检出结果。7、8、9、10倍4个
倍性半夏的甲基化水平差异不大，差异主要体现在
甲基化模式上。在较高倍性中并没有过多的超甲基
化位点出现，甲基化程度增加和减少同时并存，甚至
甲基化状态的减少多于增加，例如：8倍体总甲基化
水平略低于7倍体，总甲基化水平最低。在己研究的
高等植物中，胞嘧啶发生甲基化的比例因植物种类
而异，从4．6％～30％不等[10’¨]，而且90％以上的甲
基化作用都是发生在DNA的CpG双碱基序列处。
万方数据
·1716· 中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
半夏的甲基化水平在50％以上，这可能与半夏的高
倍性有直接关联。因为当几个基因组综合到一个核
中，会发生超量表达的浪费现象，为减少这种过量的
基因表达，多倍体半夏中许多结构基因可能发生了
遗传二倍化，即多倍体中基因的表达水平被减少到
与其二倍体祖先相近或相同。这种遗传二倍化是通
过两种途径之一来实现的：基因沉默或基因剂量补
偿。而迅速发生的可遗传胞嘧啶甲基化增加变异可
能是遗传二倍化的一种有效途径[12‘。而不同倍性半
夏间的甲基化程度差别不大(54．4％～58．2％)，
提示半夏多倍化过程中还存在其他表观遗传作用途
径，比如：组蛋白修饰、染色质重改构等，这些表观遗
传所控制的基因程序化表达的结果就是保证多倍体
植物能够正常生长发育。
本实验结果表明，不同倍性多倍体半夏之间存
在大量的胞嘧啶甲基化变异。但由于至今未发现半
夏的二倍体，还不能确定与二倍体祖先相比，多倍体
半夏形成过程中胞嘧啶甲基化变异的水平以及这些
基因组变异是否具有随机性和稳定性。异源多倍体
物种的一个重要特性是基因分化，即基因在剂量上
的重复使得部分复等位基因可以分化成具有不同功
能的新基因。这些伴随异源多倍体物种形成所迅速
产生的表观遗传变异无疑可作为自然选择及适应性
进化的原材料，进而有助于多倍体物种在进化上的
成功，这也许就是半夏多倍体复合体具有如此广泛
分布区这一生态优势的主要原因。本研究结果为半
夏多倍体复合体的地理分布演化趋势研究奠定了一
定的理论基础。
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何首乌cDNA文库的构建及分析
谭雪梅1，申彦晶2，严 萍2，郑传进2，赵树进p
(1．广州军区广州总医院，广东广州 510010，2．华南理工大学，广东广州510640)
摘 要：目的 为进行药用植物次生代谢产物的生物合成基因调控研究，构建了三年生何首乌叶eDNA文库。方法
以何首乌成熟叶片为材料提取其总RNA；纯化出mRNA；反转录合成双链eDNA；钝化eDNA末端；连接上EcoRI
接头；经XhoI酶切后．使用SepharoseCL一2B凝胶介质滤过，收集400bp以上的片段与Uni—ZAPXR载体连接，经
包装蛋白包装成eDNA文库。Uni—ZAPXR载体可以在辅助噬菌体ExAssisthelperphage的共感染下，快速释放出
pBluescriptSK一噬菌粒，经转染E．coliSOLR后，铺于氨苄青霉素抗性平板。分别利用PCR和双酶切的方法鉴定插
入片段的大小。结果测定该初始文库的滴度为1．07×106pfu／mL。含有5．4×105个重组子，插人片断长度为
0．s～2．0kb；扩增文库的重组子为4．25X10“个，重组率为98．5％。结论经检测所构建的文库库容量满足基因筛
选要求．为进行中药材相关功能基因调控研究奠定基础。
收稿日期：2008—01一Z0
基金项目：广东省科技厅重点项目资助(63108)
作毒简介：谭雪梅(1982)．女，广东省江门市人，在读研究生，研究方向为生物制药。E—mail：txml021@126．corn
’通讯作者赵树进E—mail：gzzsjzhs@pub．guangzhou．gd．cn
万方数据
半夏多倍体复合体基因组DNA甲基化状态的MSAP分析
作者： 薛梅， 陈成彬， 陈力， 马小军， XUE Mei， CHEN Cheng-bin， CHEN Li， MA Xiao-jun
作者单位： 薛梅,马小军,XUE Mei,MA Xiao-jun(中国医学科学院,北京协和医学院药用植物研究所,北京
,100094)， 陈成彬,陈力,CHEN Cheng-bin,CHEN Li(南开大学生命科学学院,天津,300071)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(11)
被引用次数： 3次

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