全 文 ：·718· 中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
药理与I临床
羟基积雪草苷对转基因肌萎缩侧索硬化小鼠的治疗作用
刘颖菊1’2，小林裕太2，李颂华2，高丽佳1
(1．重庆医科大学药理教研室，重庆400016；2．日本岛根大学医学实验中心，出云693—8501)
摘 要：目的 探讨羟基积雪草苷对铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Znsuperoxided smutase，SODl)-G93A突变肌萎
缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)小鼠的治疗作用。方法通过行为学和组织学测定，观察羟基积
雪草苷对SODl一G93A突变ALS小鼠发病时间、生存时间、运动功能变化和神经元病理改变的影响。结果羟基
积雪草苷(61．1士11．o)和(185．6±18．7)mg／(kg·d)在小鼠日龄70d时开始给药至死亡，能分别延长SODl一
G93A突变ALS小鼠的生存时间11．4和9．4d，但对发病时间无影响；同时(61．1士11．o)rag／(kg·d)组小鼠在
肌力缓慢下降期运动功能降低减缓，与对照组比较差异显著(P
关键词：羟基积雪草苷；肌萎缩侧索硬化；铜锌超氧化物歧化酶
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)05—0718一04
Therapeuticpo entialofmadecassosideintransgenicmiceofamyotrophiclaterals erosis
LIUYing—jul’2，KOBAYASHIYuta2，LISong—hua2，GAOLi—jial
(1．DepartmentofPharmacology，ChongqingUniversityofMedicalScience，Chongqing400016，China；
2．CentreforIntegratedResearchinScience，ShimaneUniversity，Izumo693—8501，Japan)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheth rapeuticpo entialofmadecassosideinmiceexpressinga
mutanthumanCu，Znsuperoxidedismutase(SODl)-G93Alinkedtohumanmyotrophiclaterals erosis
(ALS)．MethodsEffectsofmadecassosideononsetofclinicaldisease，survivalofmice，declineofmotor
function，andmotoreuron(MN)degenerationwereobservedbybehavioralanalysisandhistologicaleva—
luation．ResultsMadecassoside(61．1土11．O)and(185．6±18．7)rag／(kg·d)igadministration，be in—
ningat70dofageuntildeath，prolongedsurvivalofSODl一G93AALSmiceby11．4and9．4d，respec—
tively(P<0．05)，butdidnotdelayheonsetofdisease．Madecassoside(61．1--4-_11．0)rag／(kg·d)de—
creasedignificantlythedeclineofmotorstrengthofSODl一G93AALSmiceduringtheslowerdeclining
stageuntilend—stageofdisease(P<0．05)．Histologicalevaluationofthelumbarspinalcordrevealedthat
madecassosidetreatmentpreventedthpathologicalchangestypicalofthetransgenicdiseasemodelat120
dofage．AverageMNcountsperectionnthelumbarspinalcordinmadecassoside—treatedanimalswer
significantmorethantheseofuntreatedSODl一G93AALSmice(P<0．05)．Nisslbodiewerefoundincy—
toplasmofmoremotorneurons．ConclusionMadecassosidec uldprotectmo orneurondegenerationand
increasethlongevityofSODl一G93AALSmice．
‘Keywords：madecassoside；amyotrophic1ateralscle sis(ALS)；Cu，Znsuperoxided smutase
(SoD】)
肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsc ero—
sis，ALS)是一种以脊髓和脑中的运动神经元变性
为特征的神经系统疾病。近年发现氧化损伤、炎症反
应和细胞凋亡在神经元变性中起着重要作用m引。积
雪草Centellaasiatica(L．)Urban为伞形科药用植
物。现代药理研究证明积雪草主要活性成分为三萜
皂苷类‘3|。有报道积雪草总苷对小鼠棉球肉芽肿和
二甲苯所致炎症有明显的抑制作用嘲；能抑制A8
诱导的海马运动神经元凋亡‘53；可抑制髓过氧化物
酶(MPO)及减少丙二醛(MDA)形成，从而抑制
收稿日期：2005—10-05
基金项目：日本岛根县难病研究所、重庆市自然科学基金资助(CSTC，2005BB5036)
作者简介：刘颖菊(1963一)，女，四川德昌县人，副教授，博士，主要从事神经药理和新药临床前药动学研究，在该领域已发表论文10余
篇。Tel：(023)68485038E—mail：liuyingjbh@yahoo．corn．cn
万方数据
中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·719·
炎症反应及减轻氧自由基损伤[6]。以上研究提示积
雪草可能对ALS有一定治疗作用。羟基积雪草苷
(madecassoside)是积雪草三萜皂苷的主要活性成
分之一，本实验以人铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn
superoxided smutase，SODl)一G93A突变转基因
小鼠为实验对象，探讨其对ALS的治疗作用，为开
发治疗ALS药物提供依据。
1材料 ‘
1．1药品和试剂：羟基积雪草苷购自广西昌洲天然
植物开发有限公司，质量分数95％。DNA提取试剂
盒和PCR试剂盒及引物购自美国Biotronics公司。
1．2 动物：B6SJL—TgN(SoDl一G93A)1Gur雌性
小鼠和非转基因B6SJLF1雌性小鼠购自Jackson
实验室(BarHarbor，ME)。小鼠饲养在12h灯光
昼夜交替的标准化实验室中。所有操作规程均按照
日本岛根医科大学实验动物应用原则进行。
1．3仪器：转棒仪(Rotarod)为Colombus仪器公
司生产，PCR仪和电泳仪由美国伯乐公司生产。
2方法 -
2．1 B6SJL—TgN(SoDl一G93A)1Gur小鼠的繁
殖筛选：B6SJL—TgN(SODl一G93A)1Gur雄性小
鼠5只，日龄60d时开始与B6SJLF1雌性健康小
鼠按1雄3雌交配。子代小鼠剪尾提取DNA(按试
剂盒要求)，加SODl引物57一CATCAGCCC—
TAATCCATCTGA一37和5-CGCGACTAACAA—
TCAAAGTGA一3’经PCR0个循环扩增，确定
200～300bp间的SODl基因条带。淘汰无SODl
突变基因的小鼠。
2．2行为学测定：按文献报道方法[7]，将小鼠放在
转棒仪上(60Hz／min，①90ram)，记录小鼠放上转
棒至落下的时间。每时间点每只小鼠测定3次，取
小鼠呆在转棒上时间最长的1次反映小鼠的运动功
能，如时间大于180S则中止测定，按180S计算。
第3代SODl基因突变小鼠从日龄60d开始用转
棒仪测定运动功能。以后每4天观察测定1次直至
死亡。
2．3治疗过程
2．3．1实验分组：第3代SODl基因突变小鼠日龄
70d时按运动功能情况，随机将小鼠分为3组。分
别是：ALS对照组，饲普通饲料；羟基积雪草苷小剂
量治疗组和大剂量治疗组，分别饲相应特殊饲料；另
设无SODl突变基因的B6SJL健康小鼠对照组，饲
普通饲料。每组26只，雌雄各半。
2．3．2实验给药：羟基积雪草苷混匀在AIN一93G
饲料中，制成含药0．4(小剂量组)和1．2g／kg(大
剂量组)特殊饲料。小鼠日龄70时开始分别给予含
药特殊饲料直至死亡。在小鼠60～80d时根据小鼠
每周消耗的饲料量及小鼠体重估计两组小鼠的给药
量，分别相当于每只小鼠给药(61．1士11．0)和
(185．6±18．7)mg／(kg·d)。
2．3．3发病时间和生存时间：当小鼠在转棒上的时
间较前次测定时间降低30％以上时确定为肌力降
低。据此运动功能的变化和观察小鼠前肢有无震颤
确定小鼠的发病时间。当小鼠仰卧在光滑的平面上
30S不能翻正反射过来或单、双眼出现严重的感染
时确定为小鼠死亡将其处死。小鼠从出生至死亡的
时间为小鼠的生存时间。
2．3．4脊髓运动神经元测定：在日龄120d时，各
组分别取小鼠6只，雌雄各半，4％多聚甲醛磷酸缓
冲液(o．1mol／L)心脏穿刺灌流固定，取L2～5脊
髓，石蜡包埋，连续切片8张(10肚m)作尼氏染色，
光镜下观察脊髓前角运动神经元形态并计数，取8
张切片的平均数进行比较。
2．4统计处理：采用PQMS医学统计软件进行t
检验(两组比较均数)和方差分析(多组比较)。
3结果
3．1 羟基积雪草苷延长SODl一G93A小鼠生存时
间：SODl一G93A对照组小鼠在日龄113d左右时
开始发病，平均生存时间为(137．8土2．5)d。羟基
积雪草苷两个剂量组在小鼠70d时开始给药，对小
鼠发病时间没有影响，但能明显延长小鼠的生存时
间，小剂量组平均生存时间为(149．2土3．0)d
(P<0．01)，大剂量组为(147．2±3．4)d(P<
0．05)，见表1。B6SJL健康小鼠无临床症状，生存时
间在1年以上。实验中测定运动功能时对照组1只
小鼠和羟基积雪草苷大、小剂量治疗组各有2只小
鼠逃跑。
表1 羟基积譬草苷对转基因SODl一G93A小鼠发病
时间和生存时间的影响(i±s)
Table1 Effectsofmadecassosideononset
ofclinicaldiseasendsurvivaltime
ofTgN(SODI—G93A)mice(；土s)
一
剂量／ 动物／只 发病时间／ 生存时间／生存时问组别(mg．kg一1．d一-)1函丽dd延长／d· 一·一1)雄性雌性 延长／d
与SODl一G93A对照组比较：+P<0．05一P<0．01
。P<0．05+’P<0．01USSODl一G93Acontrolgroup
万方数据
·720· 中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月
3．2 羟基积雪草苷延缓SODl一G93A小鼠运动功
能降低：SODl一G93A小鼠运动功能降低分为两阶
段：发病时肌力快速降低和随后肌力缓慢下降至完
全瘫痪。羟基积雪草苷治疗不能防止肌力的快速降
低，但小剂量组在肌力缓慢降低阶段能延缓小鼠运
动功能的降低，与对照组比较差异显著(P<0．05)，
见图1。
∞
＼
龊
嚣
臀
!圈
85 95 105 115 125 135 145 155
小鼠日龄／d
图1羟基积■草苷对SODl一G93A小鼠运动功能的
影响。土s，弹一18～19)
Fig．1Effectofmadecassosideonmotorfunction
ofSoDl—G93Amiceo士s，n：18—19)
3．3 羟基积雪草苷延迟SODl一G93A小鼠脊髓运
动神经元变性：B6SJL健康对照小鼠120d时L2～
5脊髓前角平均每张切片有(22．o±1．8)个运动神
经元，细胞浆中有大量尼氏体，胞体较大。未治疗的
SODl一G93A小鼠120d时L ～5脊髓前角运动神
经元明显减少，平均每张切片(8．3±1．4)个，细胞
体积明显缩小，细胞浆中尼氏体消失。羟基积雪草苷
大、小剂量组平均每张切片运动神经元数分别为
(12．2±2．5)和(14．3士2．3)个，与未治疗组比较
差异显著(P
4讨论
本实验结果首次证明羟基积雪草苷对SODl一
G93A小鼠的治疗作用。实验结果显示羟基积雪草
苷(61．1±11．0)和(185．6土18．7)rag／(kg·d)
在症状前期(70d)开始给药至小鼠死亡，能分别延
长ALS小鼠的生存时间11．4和9．4d，同时
(61．1±11．o)rag／(kg·d)组小鼠在肌力缓慢下降
期运动功能降低缓慢，与对照组比差异显著(P<
0．05)。120d时L2～5病理切片显示两治疗组脊髓
前角运动神经元数目明显高于SoDl一G93A小鼠
A一健屎对照组B-SODl一G93A组C、D一大小剂量羟基积雪草组
A—normalcontrolgroupB—SODl一G93AgroupC，D-largeandsmalldoseofmadecassosidegroup
图2小鼠120d时脊■腰段的组织切片(露一6)
Fig．2Histologicalevaluationof120-day-oldlumbarspinalcordinmice(一一6)
(P
鼠运动神经元有保护作用，从而能改善小鼠运动功 基因小鼠过度表达时，引起小鼠进行性运动神经元
能，延长生存时间。但两剂量组发病时间与对照组比 变性，出现与人类相同的症状和病理特征[9]。SODl一
较无差异，说明该药不能阻止或延缓发病，对神经元 G93A突变转基因小鼠是目前国际上最常用和可靠
变性的初始诱发因素无干预作用，只延缓小鼠发病 的ALS动物模型，小鼠在出生后3～4个月左右时
后的病理进程。小剂量组作用更显著并能延缓运动 发病，发病1个月左右后死亡。由于ALS疾病的发
功能降低，实验中也发现大剂量组小鼠没有小剂量 生发展由多因素介导、参与，单一药物很难产生非常
组生长状况好，这可能是由于大剂量组药物剂量过 显著的效果。以前的研究显示用药物治疗SODl介
大，产生不良反应影响了治疗效果。为确定最佳治疗 导的ALS在转基因小鼠只能产生轻、中度效果，维
剂量和效果，尚需进一步选用更小的剂量进行实验。 生素E和gabapentin等均不能延长SOD—G93A小
ALS发生有散发性和家族性两种形式，他们在 鼠的生存时间。FDA批准并推荐使用的唯一药物
病理和临床表现上没有差异[8]。家族性ALS是基因Riluzole(谷氨酸拮抗剂)也只能延长SODl一G93A
瑚瑚啪㈨m啪啪∞∞加o
万方数据
中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第5期2006年5月·721·
小鼠的生存时间10～15d，而对发病时间无影
响[1州。本实验结果显示羟基积雪草苷虽不能延迟小
鼠发病但能延长小鼠生存期10d左右，这已是一个
很好的苗头，且积雪草在我国长江以南地区广泛生
长，药源丰富，因此有必要进一步研究并将其开发为
治疗ALS和其他神经元变性疾病的药物。
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芫花根总黄酮含药血清对小鼠细胞免疫功能的影响
高晓雯，郑维发+，彭烨城
(徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州 221116)
摘 要：目的 建立小鼠血清中芫花根总黄酮(TFRD)各成分的HPLC测定方法，探讨TFRD含药血清对正常小
鼠细胞免疫功能的影响。方法HPLC法测定小鼠单次ig给药后不同时间点血药浓度；MTT法检测多次ig给药
后含药斑清对正常小鼠脾淋巴细胞增殖、NK与LAK细胞杀伤活性和腹腔巨噬细胞的吞噬功能等细胞免疫功能
的影响。结果单次igTFRD后血药浓度在20～30min达到高峰；TFRD含药血清能促进脾淋巴细胞增殖，增加
NK和LAK细胞杀伤活性，增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力。结论TFRD含药血清能增强正常小鼠细胞免疫功能。
关键词：芫花根总黄酮；血清药理学；细胞免疫
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)05—0721—05
Effectofserumcontainingtotalf avonoidsfromrootsofDaphnegenkwa
oncellimmunityinmice
GAoXiao—wen，ZHENGWei—fa，PENGYe-cheng
(KeyLaboratoryforBioteehnologyonMedicinalPl ntsofJiangsuProvince，
XuzhouNormalUniversity，Xuzhou221116，China)
Abstract：ObjectiveToestablishHPLCmethodforassayingtotalf avonoidsfromtherootsof
Daphnegenkwa(TFRD)inserumof iceandtoelucidatetheffectofmiceserumcontainingTFRDon
cellimmunityinmice．MethodsTFRDConcentrationinserumwasdeterminedfromthemicereceived
singleigTFRDatcertaint meintervalsusingHPLCmethod．TheeffectsofTFRDserumonlymphocyte
proliferation，killingactivit esofNKandLAKcell，andphagocyticac vityofmacrophagewered tected
bvMTTmethod．ResultsTFRDin erumreacheditshighestconcentrationin20—30minafterigadmi—
nistration．TFRD—containingserumsignif cantlyimprovedtheproliferationoflymphocyte，enhancedthe
killingactivitiesofNKandLAKcells。ande forcedthephagocyticact vityofmacrophage．Conclusion
TFRD—containingserumisaneffectiveagentsforenhancingellimmunityinmice．
收稿日期：2005—10—24
基金项目：教育部科学技术研究重点项目(03049)；江苏省高校自然科学研究计划重点项目(02KJA360002)
作者简介：高晓雯(1977一)，女，江苏徐州人，徐州师范大学天然产物化学及药理学硕士研究生。E—mail：gxw2003@126．com
*通讯作者郑维发Tel：(0516)83403179E—mail：yyzw@xznu．edu．cn
万方数据
羟基积雪草苷对转基因肌萎缩侧索硬化小鼠的治疗作用
作者： 刘颖菊， 小林裕太， 李颂华， 高丽佳， LIU Ying-ju， KOBAYASHI Yuta， LI Song-hua
， GAO Li-jia
作者单位： 刘颖菊,LIU Ying-ju(重庆医科大学,药理教研室,重庆,400016;日本岛根大学,医学实验中心
,出云,693-8501)， 小林裕太,李颂华,KOBAYASHI Yuta,LI Song-hua(日本岛根大学,医学实
验中心,出云,693-8501)， 高丽佳,GAO Li-jia(重庆医科大学,药理教研室,重庆,400016)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(5)
被引用次数： 2次
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