全 文 ：“FENGDOU”an d authent icat ion of Dend robium f l exi caule
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不同薯蓣皂苷元的盾叶薯蓣遗传关系的 RAPD 分析
薛　焱,秦天才X , 张友德
(华中农业大学生命科学与技术学院, 湖北 武汉　430070)
摘　要:目的　从 DNA 水平分析鉴定不同薯蓣皂苷元盾叶薯蓣的遗传关系。方法　从 40 个 10 bp 随机引物中筛
选出 12 个引物 ,进行 RAPD 分析, 应用 POPGENE 1. 31 软件对扩增结果进行聚类分析。结果　共扩增出 73 条
DNA 片段,其中多态性片段 64 条, 占 87. 67% ,盾叶薯蓣类型间具有明显的多态性差异。结论　DNA 分子多样性
差异与薯蓣皂苷元量差异具有相关性, 说明盾叶薯蓣的遗传基础可能对薯蓣皂苷元的形成和积累有显著的影响。
关键词: 盾叶薯蓣; 遗传关系; RAPD
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2006) 01 0115 04
RAPD Analysis of genetic relationship among Dioscorea z ingiberensis
with different diosgenin
XUE Yan, QIN T ian-cai, ZHANG You-de
( Co lleg e of L ife Science and T echnolo gy , Huazhong Agr icult ur al Univer sity , Wuhan 430070, China)
Abstract: Objective　T o study the genetic relationship among Dioscorea z ingiberensis w ith different
diosgenin content at DNA level. Methods　DNA of all types w as amplified by 12 r andom primers fr om 40
random pr imer s, the polymorphic bands of RAPD were counted. And the results of types were analy sed by
POPGENE 1. 31 ( T ool for Population Genet ic Analysis 1. 31) so ftw are. Results　A to tal of 73 bands w as
obtained, 64 of to tal bands ( 87. 67% ) w as polymorphic. T he r esults indicated that ther e w ere apparent
and abundant g enetic variat ions in D . z ingiberensis. Conclusion　T he fo rmat ion and accumulat ion of dio s-
genin could be af fected signif icantly by the genet ic basis of D . z ingiberensis.
Key words : Dioscorea z ingiberensis C. H. Wright ; g enetic relat ionship; RAPD
　 　 盾 叶 薯 蓣 Dioscorea z ingiberensis C. H.
Wright 俗称黄姜, 为多年生缠绕草质藤本植物,隶
属于薯蓣科薯蓣属根状茎组,为我国特有种。该属植
物的根状茎中含有丰富的薯蓣皂苷元 ( diosgenin) ,
是重要的甾体激素类药源植物, 盾叶薯蓣由于其含
薯蓣皂苷元量高, 为我国主要药源植物,也是世界上
单株薯蓣皂苷元量最高的薯蓣种[ 1]。目前盾叶薯蓣
各品种薯蓣皂苷元差别很大, 各类型间除生物学特
性等差异外, 迄今在遗传背景、亲缘关系及基因组
DNA 上的差异研究报道较少。DNA 分子水平上的
多态性检测技术是进行基因组 DNA 研究的基础。
Will iams 和 Welsh 1990 年几乎同时建立的随机扩
增多态性 DNA ( r andom ampl if ied polymorphic
DNA, RAPD) 分析技术, 以其高效、快速、简便的
特点,用于药用植物研究,从方法上更显示独到的优
势, 它能够通过不同引物直接给出整个基因组的多
态性信息,避免了生长环境和发育时期不同的影响;
并从 DNA 水平上对分类群比较分析,确定药用植
物种、类型间的亲缘关系,构建树状聚类图[ 2]。本研
究利用该技术对不同薯蓣皂苷元量的盾叶薯蓣类型
·115·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 37 卷第 1 期 2006年 1月
X 收稿日期: 2005-04-25
基金项目: 国家自然科学基金资助 ( 30170098)作者简介: 薛　焱( 1974—) ,女, 内蒙人,硕士阶段从事资源植物方面的研究,现为内蒙古大学生命科学院 2005 级博士研究生,研究方向为植物发育生物学。
Tel : 13704781063　E-mail: xy xy2172@ 163. com
* 通讯作者　秦天才　T el: ( 027) 87281305　E-mail: qtc@ mail. hzau. edu. cn
的基因组 DNA 进行多态性分析、从 DNA 分子水
平上揭示各类型间遗传变异关系, 帮助探索盾叶薯
蓣中所含薯蓣皂苷元与遗传特性的关系, 以期为盾
叶薯蓣的品种鉴定及良种选育提供依据。
1　材料与方法
1. 1　材料: 本研究 14个材料选自 2002 年从湖北丹
江口、房县,陕西石泉等地区,收集的野生或半野生状
态盾叶薯蓣,并种植于华中农业大学植物教研室盾叶
薯蓣资源圃内,薯蓣皂苷元采用重量法[ 3]测得, 其主
要工艺流程:盾叶薯蓣根状茎→选择、清洗→粉碎、过
筛→发酵→酵解→滤过、洗涤→烘干滤渣→抽提→
干燥→成品, 称量薯蓣皂苷元的质量;并将另一部分
根状茎样品洗净、切碎, 80 ℃ 烘干测定其干重,最后
计算各样品薯蓣皂苷元质量分数。盾叶薯蓣各样品的
编号、原产地、薯蓣皂苷元量及生长年限见表 1。
表 1　用于 RAPD 分析的盾叶薯蓣材料
Table 1　Materials in D . zingiberensis used
in RAPD analysis
材料编号 原产地 薯蓣皂苷元/ % 生长时间/年
1 湖北丹江口 3. 198 2
2 陕西石泉 2. 400 2
3 湖北丹江口 2. 343 2
4 湖北房县 2. 332 2
5 陕西石泉 2. 308 2
6 湖北丹江口 2. 285 2
7 与小花盾叶薯
　蓣杂交种
2. 113
1
8 湖北八仙观 1. 866 2
9 湖北丹江口 1. 739 2
10 湖北丹江口 1. 672 2
11 湖北丹江口 1. 586 1
12 湖北松滋 1. 435 2
13 湖北竹山 1. 364 2
14 湖北丹江口 1. 140 2
1. 2　方法
1. 2. 1　DNA 提取:参考文献方法[ 4]并加以改进。用
蒸馏水把样品材料冲洗干净, 用吸水纸吸去材料表
面的水分。称取幼嫩叶片约 0. 1～0. 3 g,置于研钵,
加 800 LL 2×CT AB ( 2% CT AB, 100 mmol / L
Tr is-HCl, 20 mmol/ L EDTA , 14 mmol/ L NaCl,
2% B-巯基乙醇) 提取液, 充分研磨。取 1. 0～1. 5
mL 于离心管中, 65 ℃ 水浴中置 30 min, 每隔 5～
10 min 混匀 1次。加入等体积氯仿-异戊醇,轻轻摇
动 20～30 min。12 000 r / min 离心 10 min,吸上清
到一个新管中,并加入 2倍体积的 95% 乙醇,混匀,
于 - 20℃冰冻 20 min 左右。12 000 r/ min 离心,去
掉上清。加入 800 LL 75% 乙醇清洗沉淀。离心,倒
掉上清, 再次清洗。室温下吹干 DNA ,加入 100 LL
T E 缓冲液和 2 LL Rnase。置于 - 20℃ 贮存备用。
1. 2. 2　DNA 的浓度和质量的检测: ¹ 琼脂糖凝胶
电泳法:取 1 LL 提取的 DNA,加入 9 LL T E 染料,
1. 0% 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 ( EB) 染色后, 紫
外分析仪上观察;º紫外分光光度计法:用蒸馏水将
提取的 DNA 稀释 1 000倍,在 Berkman DU 640 紫
外分光光度计上测定 260 和 280 nm 处的吸光度值。
1. 2. 3　引物及来源:筛选了上海生工生物公司生产
的 RAPD 引物共 40个, 选择扩增条带丰富、信号强
的 12 个引物进行 RAPD 正式实验。正式使用的引
物序列及扩增结果见表 2。
表 2　筛选出的引物编号、序列和扩增结果
Table 2　Codes and sequences of selected primers
and amplif ication results
引物编号 寡核苷酸序列 ( 5-3) 扩增带数/条 多态性增带数/条 多态性百分数/ %
S10 CT GCTGGGAC 4 4 100. 00
S18 CCACAGCAGT 6 5 83. 33
S21 CAGGCCCTT C 9 8 88. 89
S102 TCGGACGTGA 6 6 100. 00
S118 GAATCGGCCA 8 8 100. 00
S120 GGGAGACATC 8 6 75. 00
S201 GGGCCACT CA 5 5 100. 00
S216 GGT GA ACGCT 6 5 83. 33
S301 CT GGGCACGA 5 5 100. 00
S307 GAGCGAGGCT 5 4 80. 00
S313 ACGGGAGCAA 6 4 66. 67
S319 T GGCAAGGCA 5 5 100. 00
总计 73 64 87. 67
1. 2. 4　PCR 反应: 扩增反应在 20 LL 体系中进行,
其中含 2. 0 LL 10 倍 buffer, 1. 2 mmol/ L dNT Ps,
1. 6 mmol / L MgCl2, 0. 2 Lmol/ L 的引物, 1. 0 U
T aqDN A 聚合酶, 50 ng 的模板 DNA ,用双蒸水将
体积补到 20 LL,用 25 LL 矿物油覆盖并加盖, DNA
扩增用 DNA T hermal Cycler ( PT -200) 进行 42 个
循环。扩增条件为: 94 ℃ 3 min, 94 ℃ 30 s, 32 ℃
1. 5 m in, 72℃ 1. 5 min; 6循环 94℃ 30 s, 41℃ 45
s, 72℃ 1. 5 m in; 36循环 72 ℃ 10 min; 4 ℃ 保存;
反应结束后, PCR 产物置 4 ℃ 冰箱中保存备用, 或
直接用 1. 4% 琼脂糖凝胶电泳分离,电泳缓冲液为
0. 5 倍 T BE ,在电压 100 V 下电泳, 然后用 EB 染
色, 在紫外透色仪上成像, 记录结果。每个 PCR 反
应重复 3次, M arker 用 MG0781。
1. 2. 5　数据处理与分析: 根据电泳图谱,把有带的
量化为 1, 无带的量化为 0, 数据输入计算机标准化
处理。利用 POPGENE 1. 31 ( to ol for population
genet ic analy sis 1. 31) 进行数据的遗传分析, 计算
类型间的相似系数、遗传距离。根据遗传距离采用
U PGMA ( unw eighted pair group method w ith
·116· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 37 卷第 1 期 2006年 1月
arithhmet ic mean) 构建类型间的聚类分析树状图。
2　结果与分析
2. 1　供试材料的扩增结果及多态性分析: 从 40 个
10 bp 随机引物中筛选出的 12 个引物, 对 14 个盾
叶薯蓣类型进行扩增反应, 得到良好的结果,图 1显
示引物 S21扩增反应的电泳图谱。通过分析发现 12
个引物共扩增出 DNA 片段 73 条, 扩增出的 DNA
片段分子量在 200～1 600 bp, 其中公共片段 9条,
多态性片段 64 条, 占 87. 67% ,平均每个引物扩增
6. 1条(表 2) ,表明盾叶薯蓣各类型间具有丰富的遗
传多样性。
2. 2　盾叶薯蓣品种间的遗传相似系数和聚类分析:
根据 RAPD 分析结果, 计算出不同薯蓣皂苷元盾叶
薯蓣类型间的遗传相似系数 (表 3)。从表3可见,含
不同薯蓣皂苷元的盾叶薯蓣的遗传相似系数在
0. 4795～0. 8219,表明含不同薯蓣皂苷元的盾叶
薯蓣具有较近的遗传关系, 同时其 DNA 也发生了
一定的变异。其中1与 11之间的遗传相似系数最大
( 0. 821 9) , 7与 4的遗传相似系数最小 ( 0. 479 5) ,
C-阴性对照　M-M ark er
C-n egative cont rol　M-M ark er
图 1　用随机引物 S21 对各样品进行
RAPD 扩增 (样品编号同表 1)
Fig. 1　Randomly amplif ied DNA products by Primer S21
( Materials No. is same as in Table 1)
表 3　用 RAPD 标记计算出盾叶薯蓣 14 种类型间的遗传相似系数
Table 3　Similar coef ficient and Neiøs genetic distance of 14 types of D . zingiberensis by RAPD
ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 * * * * 0. 726 0 0. 739 7 0. 712 3 0. 753 4 0. 739 7 0. 493 2 0. 643 8 0. 767 1 0. 643 8 0. 821 9 0. 657 5 0. 616 4 0. 767 1
2 0. 302 2 * * * * 0. 821 9 0. 575 3 0. 808 2 0. 712 3 0. 520 5 0. 643 8 0. 712 3 0. 698 6 0. 794 5 0. 602 7 0. 753 4 0. 684 9
3 0. 301 5 0. 196 1 * * * * 0. 561 6 0. 767 1 0. 643 8 0. 479 5 0. 602 7 0. 671 2 0. 657 5 0. 808 2 0. 589 0 0. 630 1 0. 698 5
4 0. 339 2 0. 552 8 0. 576 9 * * * * 0. 712 3 0. 671 2 0. 479 5 0. 547 9 0. 589 0 0. 547 9 0. 616 4 0. 643 8 0. 547 9 0. 589 0
5 0. 283 1 0. 212 9 0. 265 1 0. 339 2 * * * * 0. 712 3 0. 411 0 0. 534 2 0. 712 3 0. 616 4 0. 739 7 0. 575 3 0. 616 4 0. 767 1
6 0. 301 5 0. 339 2 0. 440 3 0. 398 6 0. 339 2 * * * * 0. 534 2 0. 602 7 0. 671 2 0. 630 1 0. 726 0 0. 643 8 0. 657 5 0. 643 8
7 0. 706 9 0. 652 9 0. 735 1 0. 735 1 0. 889 3 0. 626 9 * * * * 0. 630 1 0. 589 0 0. 657 5 0. 506 8 0. 561 6 0. 630 1 0. 506 8
8 0. 440 3 0. 440 3 0. 506 3 0. 601 6 0. 626 9 0. 506 3 0. 461 8 * * * * 0. 739 7 0. 726 0 0. 602 7 0. 712 3 0. 671 2 0. 520 5
9 0. 265 1 0. 339 2 0. 398 6 0. 529 3 0. 339 2 0. 398 6 0. 529 3 0. 301 5 * * * * 0. 794 5 0. 643 8 0. 671 2 0. 684 9 0. 698 6
10 0. 440 3 0. 358 6 0. 419 3 0. 601 6 0. 483 8 0. 461 8 0. 419 3 0. 320 2 0. 230 0 * * * * 0. 575 3 0. 602 7 0. 698 6 0. 575 3
11 0. 196 1 0. 230 0 0. 212 9 0. 483 8 0. 301 5 0. 320 2 0. 679 5 0. 506 3 0. 440 3 0. 552 8 * * * * 0. 643 8 0. 657 5 0. 753 4
12 0. 419 3 0. 506 3 0. 529 3 0. 440 3 0. 552 8 0. 440 3 0. 576 9 0. 339 2 0. 398 6 0. 506 3 0. 440 3 * * * * 0. 684 9 0. 534 2
13 0. 483 8 0. 283 1 0. 461 8 0. 601 6 0. 483 8 0. 419 3 0. 461 8 0. 398 6 0. 378 4 0. 358 6 0. 419 3 0. 378 4 * * * * 0. 602 7
14 0. 265 1 0. 378 4 0. 358 6 0. 529 3 0. 265 1 0. 440 3 0. 679 5 0. 652 9 0. 358 6 0. 552 8 0. 283 1 0. 626 9 0. 506 3 * * * *
　　　Nei 氏遗传特性(斜上)和遗传距离(斜下)
　　　Neiøs genetic id ent ity (above diagonal) and gen et ic dis tance ( below diagonal )
14 个品种平均遗传相似系数为 0. 649 8。
　　根据 Neiøs 遗传距离用 UPGMA 法聚类分析
得到树状分析图(图 2)。从基于 RAPD 标记建立起
的树状图来看,所有供试材料的遗传距离都大于零,
这表明不同薯蓣皂苷元量的盾叶薯蓣之间既有相同
遗传背景,但相互之间又存在一定的差异。从图2可
直观地看出, 有 4个明显的聚类, 1、2、3、4、5、6、11
为Ⅰ类群, 8、9、10、12、13 为Ⅱ类群,Ⅰ、Ⅱ两个类群
聚在一起后再与 14和 7逐级聚在聚类图上形成了
Ⅲ和Ⅳ类群。从Ⅰ类群可以看出,薯蓣皂苷元量较高
( 2. 285～3. 198) 的 1～6 及 11这 7个盾叶薯蓣品
种间遗传相似系数大, 如 1和 11、2和 3的遗传相似
系数达 0. 821 9,这些都说明 DNA 分子多样性差异
与含薯蓣皂苷元的量差异具有相关性, 所以盾叶薯
蓣的遗传基础可能对薯蓣皂苷元的形成和积累有显
著的影响。此类群中只有 11的量稍微低了些,那是
因为 11 的生长时间为 1 年, 而其他类型均为两年
生, 这可以用两年生根状茎中薯蓣皂苷元的量比一
年生的明显要高的研究结果加以解释 [ 5]。Ⅰ类群也
可以看出,大多品种来自湖北丹江口,但也有来自湖
北房县和陕西石泉的品种,如 2、4和 5,这说明不同
类型盾叶薯蓣与其原产地相关性不很明显,也显示
盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的量与其原产地相关性更不
明显,至于这是由产地之间发生过引种,而有了类型
间基因的交流造成的,还是由各类型本来的基础决
定的,还需要进一步研究。另外,从Ⅰ类群也可以看
·117·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 37 卷第 1 期 2006年 1月
图 2　聚类分析结果
Fig. 2　Dendrogram of clustering analysis
出, 1和 11的亲缘关系最近, 这是由于它们是亲代
与子代的关系,但也可看出它们也出现了一定的变
异。这可能可以用来解释盾叶薯蓣的品种退化、薯蓣
皂苷元量不稳定等问题;Ⅱ类群也是薯蓣皂苷元量
差别小的先聚在一起, 差别大的再聚在一起,如 9和
10、12和 13薯蓣皂苷元量差别很小分别聚在一起,
后又聚在一起,从这里也可以看出 9、10来自湖北丹
江口,可它们没有和Ⅰ类群聚在一起, 这与黄春洪
等[ 6]认为的居群间的遗传距离呈现明显的地域性,
居群间地理距离越近, 遗传距离越小而聚为一类的
研究结果不完全一致。Ⅰ、Ⅱ两个类群聚在一起后再
与 14形成Ⅲ类群,是由于 14薯蓣皂苷元量比较低,
仅为 1. 140,而其他品种薯蓣皂苷元量都比 14高,
所以遗传距离相对远了些。之后才与7形成Ⅳ类群,
这是由 7的遗传背景造成的, 7是盾叶薯蓣 14 与小
花盾叶薯蓣的杂交种,遗传相似系数 0. 630 1。它与
其他 13个品种有 9个扩增片断相同,该品种长势旺
盛,薯蓣皂苷元量也明显比亲本高,可对其进行进一
步的研究。
3　讨论
　　传统分类方法与分子标记法本身存在一定的差
异, 传统分类方法认为相同地理来源类型的样品应
聚为一类,而在 RAPD 标记中却发现不同地理来源
类型的样品聚为一类,相同地理来源类型的样品分
属于不同的类群。就本试验而言, 2、3分别来自陕西
石泉和湖北丹江口, 但亲缘关系近聚在一起; 9、10
虽来自湖北丹江口, 可它们没有和Ⅰ类群聚在一起。
这显示 RAPD 分子标记所构建的聚类图与传统分
类印象有一定的差距,这说明样品间遗传差异与形
态、地理来源差异没有必然的联系[ 7]。
另外,实验中筛得的 12 个 RAPD 引物的扩增
片断可能未覆盖样品基因组全长,为得出更为可信
的实验结果,本实验可以筛得更多的引物,进一步比
较和分析一些特征性基因片段,如果这些片段与盾
叶薯蓣高皂苷元形成相关,则可以进一步进行克隆、
测序及转基因等研究,这对于盾叶薯蓣优良品种的
选育具有重要的意义。
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A g ric B iot echnol , 1998, 6( 3) : 281-285.
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2001年第 32卷增刊为“第三届中中药新药研究与开发信息交流会”会议论文集, 特邀了中国
工程院院士、国内十多名专家和中青年学科带头人就加快中药现代化的进程、我国入世后中药产业
的发展新对策及西部药用植物资源的保护、开发和利用等撰写综述文章 20多篇, 另有反映近年来
中花化学、药理分析、制剂、药材及临床等方面的科研论文和综述文章 140多篇。
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·118· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 37 卷第 1 期 2006年 1月