全 文 ：黑龙江省不同产地满山红遗传多样性
的 RAPD分析
王谦博1，2，张维君3，刘丽芳1* ，仲昭庆2，王振月3
(1．中国药科大学，江苏 南京 210009;2．黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150001;
3．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:分析不同产地满山红遗传背景与遗传关系，建立中药满山红的 RAPD 分析方法。方法:
CTAB法提取不同产地满山红的基因组 DNA;琼脂糖凝胶电泳法检测 PCR 扩增产物，SPSS17． 0 软件进
行聚类分析，NTSYS2． 10e软件进行遗传距离计算。结论:从 100 条随机引物中筛选出 10 个随机引物，
其扩增产物谱带多，特征好，共扩增出 806 条条带，多态性条带数 710 条，多态性比例为 88． 1%。结论:
不同产地间的满山红存在丰富的遗传多样性，RAPD分析技术可用于鉴定满山红。
关键词:满山红;CTAB法;RAPD;遗传关系
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2392(2012)02 － 0070 － 05
收稿日期:2011 － 12 － 22 修回日期:2012 － 01 － 09
作者简介:王谦博(1982 －) ，女，主管药师，硕士研究生，主要从事中药
质量分析工作。
* 通讯作者:刘丽芳(1969 －) ，女，教授，主要研究方向:中药分析。E －
mail:liulifang69@ hotmail． com
满山红(Rhododendri daurici Folium)又名达子香，
它为杜鹃花科植物兴安杜鹃的干燥叶，是一种传统的
药用植物，具有镇咳、祛痰、平喘等作用，主治急、慢性
支气管炎，副作用小，资源丰富，主要分布于黑龙江、吉
林、内蒙古等地，为黑龙江省的常用药。近期有学者运
用高效液相色谱法、薄层色谱法、纤维薄层层析法、质
谱等分析方法对满山红的总黄酮、杜鹃素、槲皮素、满
山红油及其他挥发油类成分等有效成分进行了分析探
讨，并对满山红药材质量评价做了一些工作，同时还有
学者采用显微切片法鉴定满山红药材的真伪［1 － 4］。就
传统方法而言，植物体内有效化学物质的含量和个体
之间显微鉴定以及亲缘关系是综合考虑其真伪的主要
标准，但这些方法易受到环境以及个人操作过程的影
响，因此其结果的可靠性一直存在一些争议，90 年代
以来，人们普遍认为 DNA水平上的多态性信息对于评
判作为药材的质量标准建立的遗传多样性来说是可靠
的。目前已有学者在杜鹃属植物的 DNA 条形码序列
的筛选、杜鹃属基因组 DNA 的提取、杜鹃属植物基因
组 DNA的 RAPD检定及分类等方面有一定的研究，但
是至今尚未有学者在分子水平上建立其药材质量评价
标准的评价体系，本实验拟采用 CTAB 法对不同产地
的满山红基因组 DNA进行提取，并用 RAPD法对其进
行分子标记，考察其不同产地的遗传多样性并将满山
红的研究提升到分子水平且为其质量标准的建立提供
更有利的证据。
1 材料与方法
1． 1 仪器与试药
K － S24 型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有
限公司) ;TGL － 16C 型台式离心机(上海安亭科学仪
器厂) ;DYY 11B型三恒电泳仪(北京市六一仪器厂) ;
DYCP －31A型电泳槽(北京市六一仪器厂) ;WFH －
201BJ紫外可见透射反射仪(上海精科实业有限公
司) ;BS － 124S 电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)
有限公司) ;PCR 仪(德国产) ;10 个引物及 Taq DNA
聚合酶(生工生物工程(上海)有限公司) ;加强型
DNA分子量标准(北京康润诚业生物科技有限公司) ;
DNA提取缓冲液;TE缓冲液;1 × TAE电泳缓冲液。
1． 2 材料
不同产地的满山红干燥叶片(见表 1)。
1． 3 DNA的提取
取少量满山红干燥叶片用液氮研磨成粉状，将粉
末转入 2mL离心管中，加入 1000μL的 2% CTAB 抽提
缓冲液，65℃水浴 45min，每隔 10min 轻轻颠倒，离心
取上清液加入等体积氯仿 /异戊醇(24 ∶ 1) ，颠倒成乳
浊状，12000rpm 离心 5min，取上清液，同法再抽提 1
次，加入 2 /3 体积的异丙醇，－ 20℃过夜沉淀 DNA，
4℃12000rpm离心 2min后取沉淀，用 75%的酒精洗涤
2 次，离心，DNA 沉淀溶于 50μLTE，置于 － 20℃保存、
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备用［5，6］。
1． 4 满山红基因组 DNA的电泳检测
从提取的样品中取出 5μL上样于 0. 8%琼脂糖凝
胶(EB 浓度为 0. 5μL /mL) ，于 100V 电场中电泳
40min，紫外灯下观察并拍照。
2 RAPD反应
2． 1 基因组 DNA的 RAPD － PCR扩增反应的体系及
程序
2． 1． 1 基因组 DNA的 RAPD － PCR扩增反应的体系
经 Mg2 +浓度、引物浓度、模板浓度等单因素摸索
实验［7 － 9］得基因组 DNA 的 RAPD － PCR 扩增反应的
20μL 体 系 为:MgCl2 (25mmol /L)1. 5μL，dNTP
(10mmol /L)0． 2μL，Taq DNA聚合酶(5U /μL)0． 2μL，
PCR缓冲液 2． 0μL，模板 1． 0μL，引物 1． 0μL，ddH2O
12． 3μL。筛选出的 10 个引物，见表 2。
表 1 试验用满山红的基本情况
Table． 1 Basic situation of Rhododendri daurici Folium
编号 采集地点 采集时间 样本数 采集纬度 N 采集经度 E 海拔 m
1 帽儿山 2010． 09． 15 5 45°18． 524 ～ 45°18． 525 127°33． 677 ～ 127°33． 678 563 ～ 566
2 清河 2010． 09． 05 5 46°17． 396 ～ 46°17． 398 129°11． 686 ～ 129°11． 687 209 ～ 219
3 通河凤山镇 2010． 09． 04 5 46°16． 206 ～ 46°16． 210 128°32． 054 ～ 128°32． 057 245 ～ 249
4 高楞 2010． 09． 06 5 45°56． 483 ～ 45°56． 499 129°20． 430 ～ 129°20． 451 324 ～ 330
5 南岔 2010． 08． 31 5 47°08． 796 ～ 47°08． 799＇ 129°15． 702 ～ 129°15． 714 221 ～ 230
6 乌伊岭 2010． 08． 28 5 48°35． 993 ～ 48°36． 004 129°26． 445 ～ 129°26． 464 448 ～ 451
7 红星大平台 2010． 08． 29 5 48°46． 927 ～ 48°46． 928 128°43． 753 ～ 128°43． 806 410 ～ 416
8 阿木尔 2010． 08． 15 5 52°51． 789 ～ 52°51． 802 123°09． 164 ～ 123°09． 178 541 ～ 542
9 新林 2010． 08． 20 5 51°40． 145 ～ 51°40． 147 124°25． 184 ～ 124°25． 194 502 ～ 511
10 韩家园 2010． 08． 17 5 52°04． 047 ～ 52°04． 052 125°43． 500 ～ 123°43． 546 291 ～ 294
11 向阳镇 2010． 09． 12 5 44°37． 074 ～ 44°37． 079 127°30． 078 ～ 127°30． 082 537 ～ 546
12 苇河镇 2010． 09． 11 5 44°58． 392 ～ 44°58． 394 128°23． 521 ～ 128°23． 522 357 ～ 375
13 长汀镇 2010． 09． 10 5 44°27． 318 ～ 44°27． 319 128°55． 698 ～ 128°55． 700 473 ～ 473
14 牡丹江北山 2010． 09． 09 5 44°36． 870 ～ 44°36． 871 129°34． 379 ～ 129°34． 385 381 ～ 396
15 美溪 2010． 08． 30 5 47°37． 574 ～ 47°37． 582 129°06． 499 ～ 129°06． 519 226 ～ 229
16 上甘岭 2010． 08． 29 5 47°56． 781 ～ 47°56． 786 128°54． 388 ～ 128°54． 389 260 ～ 261
表 2 随机引物序列
Table． 2 The sequence of random primer
编号 序列 编号 序列
45 TGAGCGGACA 344 CCGAACACGG
166 AAGGCGGCAG 372 TGGCCCTCAC
281 GTGGCATCTC 506 GTCTACGGCA
305 CCTTTCCCTC 1387 CTACGCTCAC
307 GAGCGAGGCT 1402 GGAAACCCCT
2． 1． 2 基因组 DNA的 RAPD － PCR扩增反应的程序
反应程序为:94℃预变性 3min，94℃变性 1min，
36℃退火 1min，72℃延伸 2min，共 35 个循环，最后
72℃延伸 7min，－ 20℃保存［10 － 12］。
2． 2 基因组 DNA的 RAPD －PCR扩增反应的结果检测
1． 5%的琼脂糖凝胶，电压 90V，电泳 25min，紫外
灯下观察并拍照，检测结果。
3 结果与分析
3． 1 DNA提取
DNA是遗传的物质基础，分离纯化是研究基因结
构与功能的首要前提。在提取植物基因组 DNA 过程
中，必须将其中的蛋白质除去，同时要尽可能的保证
DNA分子的完整性。植物基因组提取方法常用的是
CTAB法和 SDS法。本实验采用 CTAB 法提取的满山
红基因组 DNA片段大小基本一致，说明此方法能提取
较为完整的满山红基因组 DNA，提取结果见图 1。
图 1 不同产地满山红样品基因组总 DNA电泳图谱
Fig1 The detection of Rhododendri daurici Folium genomic DNA using agarose gel
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3． 2 满山红 RAPD产物的电泳图谱
不同产地满山红的 RAPD 扩增产物条带数目不
等，既有相同条带，又有差异条带。见图 2 ～图 11。
图 2 S45 对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig2 RAPD patterns produced by primer 45
图 3 S166 对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig3 RAPD patterns produced by primer 166
图 4 S281 对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig4 RAPD patterns produced by primer 281
图 5 S305 对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig5 RAPD patterns produced by primer 305
图 6 S307 对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig6 RAPD patterns produced by primer 307
图 7 S344 对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig7 RAPD patterns produced by primer 344
图 8 S372 对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig8 RAPD patterns produced by primer 372
图 9 S506 对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig9 RAPD patterns produced by primer 506
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图 10 S1387对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig10 RAPD patterns produced by primer 1387
图 11 S1402对不同产地满山红的 RAPD扩增电泳图谱
Fig11 RAPD patterns produced by primer 1402
4 满山红基因组 DNA的 RAPD产物的多态性分析
用筛选出的 10 个随机引物分别对 16 个不同产地
的满山红基因组 DNA进行 PCR扩增，共扩增处 806
条条带，每个引物的条带数目在 2 ～ 9 条之间，平均每
个引物扩增出 5． 04 条带，多态性条带为 710 条，多态
性比例为 88． 1%，见表 3。
表 3 不同产地满山红 RAPD标记的扩增情况
Table． 3 The amplification of Rhododendri daurici Folium based
on RAPD markers analyzed
Iterm Data
多态性引物 10
多态性引物扩增出的条带数 806
平均每条引物扩增出的条带数 5． 04
检测出的多态性条带的总数 710
多态性条带占总带数的百分率(%) 88． 1
本研究对满山红遗传变异的分析表明，RAPD 分
析技术可以用于鉴定满山红，不同产地的满山红供试
样品在 DNA水平上也表现出丰富的多态性，说明满山
红种质中存在丰富的变异类型。各产地满山红的遗传
多样性表现不尽相同，这可能与各地区的种质来源、生
长环境有一定的关系。
根据 DNA的扩增结果，用 NTSYS2． 10e 软件计算
不同产地满山红供试样品的遗传距离(见表 4) ;利用
SPSS17． 0 对其进行聚类分析(见图 12)。
表 4 不同产地满山红遗传距离
Table． 4 Gnetic distance of Rhododendri daurici Folium by ntsys2． 10e software(珋x ± s)
帽儿山 清河 凤山 高楞 南岔 乌伊岭 红星 阿木尔 新林 韩家园 向阳 苇河 长汀 牡丹江北山 美溪 上甘岭
帽儿山 1． 0000
清河 0． 7624 1． 0000
凤山 0． 7129 0． 7723 1． 0000
高楞 0． 5743 0． 6535 0． 6238 1． 0000
南岔 0． 5941 0． 5941 0． 6040 0． 6832 1． 0000
乌伊岭 0． 6139 0． 6139 0． 6832 0． 7228 0． 7030 1． 0000
红星 0． 6139 0． 5743 0． 6238 0． 7030 0． 6238 0． 7624 1． 0000
阿木尔 0． 5248 0． 5248 0． 5347 0． 6931 0． 7129 0． 7525 0． 6535 1． 0000
新林 0． 5446 0． 5842 0． 6337 0． 6931 0． 6733 0． 7525 0． 6535 0． 7624 1． 0000
韩家园 0． 5941 0． 5545 0． 6040 0． 6832 0． 6238 0． 7228 0． 7426 0． 7129 0． 8119 1． 0000
向阳 0． 5545 0． 5743 0． 6436 0． 6634 0． 6436 0． 7030 0． 7624 0． 6733 0． 6931 0． 8020 1． 0000
苇河 0． 5842 ． 5842 0． 6337 0． 6535 0． 6337 0． 5941 0． 6733 0． 6436 0． 6436 0． 7525 0． 8317 1． 0000
长汀 0． 5248 0． 5446 0． 5743 0． 6139 0． 5545 0． 5941 0． 6535 0． 5842 0． 5644 0． 6337 0． 6733 0． 7030 1． 0000
牡丹江北山 0． 5149 0． 5545 0． 6238 0． 6436 0． 6436 0． 6238 0． 6436 0． 6139 0． 5347 0． 6238 0． 7030 0． 7129 0． 8119 1． 0000
美溪 0． 5644 0． 5446 0． 5743 0． 5941 0． 5941 0． 6733 0． 7129 0． 6634 0． 6238 0． 6931 0． 6931 0． 6832 0． 7030 0． 7723 1． 0000
上甘岭 0． 5644 0． 5248 0． 6139 0． 6139 0． 5149 0． 6139 0． 6337 0． 5644 0． 5842 0． 6733 0． 6733 0． 7228 0． 6832 0． 7129 0． 8020 1． 0000
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图 12 不同产地满山红的聚类树状图
Fig12 Dendrogram of Rhododendri daurici Folium based on
RAPD markers analyzed by SPSS17． 0 software
遗传相似系数与遗传距离之间的关系是 GD =
1 － GS，从表 4 中遗传距离结构可以看出，不同产地满
山红供试样品之间的 GD 值在 0． 5149 ～ 0． 8317 之间。
其中帽儿山、南岔两个产地与其它产地之间的遗传相
似系数较低，在 0． 5149 ～ 0． 7219;帽儿山与牡丹江北
山之间的 GD值最低(0． 5149) ，表现出相对较小的遗
传差异;向阳与苇河之间的 GD值最高(0． 8317) ，表现
出相对较大的遗传差异，而新林与韩家园、韩家园与向
阳、长汀与牡丹江北山、美溪与上甘岭之间的 GD 值都
在 0． 8 以上，说明这些材料之间的遗传差异性较大，遗
传背景相差较远。
从遗传聚类结果可以看出，16 个产地的满山红供
试样品可以分为两个大类:A类和 B类，A类又分为两
个小类(a类和 b类) :帽儿山、清河和通河凤山镇可以
归为 a类，高楞、南岔、乌伊岭和红星大平台可以归为
b类;B类也分为两个小类(c 类和 d 类) :阿木尔、新
林、韩家园、向阳和苇河可以归为 c类，长汀、牡丹江北
山、美溪和上甘岭可以归为 d类。
由表 1 可看出阿木尔、新林、帽儿山、向阳海拔高
度均在 500m以上;乌伊岭、红星大平台、牡丹江北山、
长汀海拔高度均在 400m以上;高楞、苇河海拔高度均
在 300m 以上;韩家园、上甘岭、美溪、南岔、通河凤山
镇、清河海拔高度均在 200m以上。
5 结论
以上研究结果揭示出不同产地的满山红的种质类
型都有所不同，并具有相对较为明显的差异。其种质
之间的差异与地理分布无明显直接的联系，这表明种
质可能在各产区药材品质的差异中起到了重要作用，
同时此种方法的建立也为中药满山红质量标准的研究
提供了非常简便、可靠的依据。
RAPD技术在中药材质量标准方面的应用已经非
常广泛，该技术具有较高的重复性，并且简单、便捷。
本实验所建立的满山红 RAPD反应体系及其鉴定结果
为满山红质量标准的建立提供了尤为可靠的依据，同
时在我们今后发展满山红药材生产过程中，也可作为
有力的参考，以使满山红药材的种质资源得到更加科
学的发展和利用。
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Analysis of Genetic Diversity of Rhododendri Daurici Folium Based on
Different Producing Areas of Heilongjiang Province
WANG Qian － bo1，2，ZHANG Wei － jun3，LIU Li － fang1，ZHONG Zhao － qing2，WANG Zhen － yue3
(1． China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;
2． Heilongjiang Institute for Food and Drug Coutrol，Harbin 150001，China;
3． Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:Objective:To study the genetic diversity of Rhododendri daurici Folium，a random amplified polymorphism
DNA(RAPD)method for Rhododendri daurici Folium was established． Methods:The genome DNAs of Rhododendri dau-
rici Folium from different producing areas were extracted by CTAB． Amplification products were detected by agarose gel
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electrophoresis． The results were analyzed by SPSS 17． 0 and NTSYS2． 10e． Results:Ten RAPD primers were screened
out from 100 RAPD primers for PCR amplification of the 16 different producing areas gourd DNA and genome amplified．
From the 10 RAPD Primers，806 bands were amplified ，the bands and percentage of polymorphic fragment were 710 and
88． 1% ． The results revealed that Rhododendri daurici Folium from different producing areas had abundant genetic diver-
sities． Conclusion :RAPD assay technique is a useful tool to identify Rhododendri daurici Folium，which provides a theo-
retical basis for Rhododendri daurici Folium breeding fine varieties，germplasm，and Rhododendri daurici Folium re-
source protection．
Key words:Rhododendri daurici Folium;CTAB;RAPD;
檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼
Genetic ralationship
参连养心胶囊质量标准研究
张婷婷1，姚琳2，张妍妍2*
(1．哈药集团中药二厂，黑龙江 哈尔滨 150078;2．黑龙江省中医研究院，黑龙江 哈尔滨 150036)
摘 要:目的:建立参连养心胶囊的质量标准。方法:采用 TLC 法对处方中黄连、五味子、酸枣仁、远志
进行了定性鉴别研究;采用 HPLC法测定丹酚酸 B的含量，选用 Dikma ODS C18(4. 6mm ×250mm，5μm)
色谱柱，甲醇 －乙腈 －甲酸 －水(30∶ 10∶ 0. 5∶ 59. 5)为流动相，流速 1. 0mL·min －1。结果:TLC 法可鉴别
出黄连、五味子、酸枣仁、远志的特征斑点，且专属性强，分离度好;丹酚酸 B 浓度在 0. 015 2 ～ 0． 076mg·
mL －1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r = 0. 999 5) ，平均回收率为 97. 68%，RSD =1. 78%。结论:该
方法简便可行，可用于参连养心胶囊的质量控制。
关键词:TLC;HPLC;丹酚酸 B;盐酸小檗碱;五味子甲素;五味子乙素
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2392(2012)02 － 0075 － 04
收稿日期:2012 － 01 － 05 修回日期:2012 － 03 － 10
作者简介:张婷婷(1980 －) ，女，工程师，黑龙江中医药大学 2009 级在
职硕士研究生，主要从事中药粉针制剂工艺的研究工作。
* 通讯作者:张妍妍(1983 －) ，女，硕士，主要从事中药药剂研究工作。
E － mail:zhangyanyan － mao@ 163． com。
参连养心胶囊由丹参、黄连、五味子、麦冬、酸枣仁、
熟地黄等中药组成，具有滋阴养血，养心安神的功效，主
要用于各种原因引起的心律失常、心功能不全、神经官
能综合症及更年期综合症等属心悸阴虚血虚症的治疗。
1 仪器与试药
1． 1 仪器
SCL － 10A 岛津高效 液 相 色 谱 仪;Sartorius
Bp211D型十万分之一分析天平(德国赛多利斯) ;
SK250H超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公
司) ;DK －98 － 1 型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪
器有限公司)。
1． 2 试药
盐酸小檗碱 (0713 － 9906) ;远志对照药材
(120989 － 200304) ;五味子甲素(0764 一 200107) ，五
味子乙素 (110765 － 200205) ;酸枣仁对照药材
(121517 － 200301) ;丹酚酸 B(11562 － 201009) ，均购
自中国药品生物制品检定所。甲醇，乙腈为色谱纯，其
他试剂均为分析纯;水为自制纯净水;参连养心胶囊
自制。
2 方法与结果
2． 1 定性鉴别
2． 1． 1 黄连的鉴别［1］
取本品内容物 5g，加乙醇 30mL，搅拌均匀后，加
热回流 25min，冷却，滤过，滤液蒸干，残渣加盐酸
(1mol /L)20mL 使溶解，滤过，滤液置于分液漏斗中，
加三氯甲烷提取 3 次，每次 20mL，合并三氯甲烷液，挥
干后残渣加乙醇 2mL使溶解，作为供试品溶液。另取
盐酸小檗碱对照品(0713 － 9906) ，加乙醇制成每 1mL
含 1mg的溶液，作为对照品溶液。再取除黄连外的其
他药材，按制备工艺制成阴性样品，并同法制成阴性样
品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010 年版一部附
录 VI B)试验，吸取上述供试品溶液各 5μL，分别点于
同一硅胶 GF254薄层板上，以正丁醇 － 冰醋酸 － 水
(4∶ 1∶ 5)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外
(365nm)下检视，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干
扰。见图 1。
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2012 年第 40 卷第 2 期
Vol. 40，No. 2，2012
中 医 药 学 报
Acta Chinese Medicine and Pharmacology