全 文 ：·1416· 中革蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第9期2007年9月
HPLC法测定不同年龄人参DNA的甲基化水平
董亚娟1，程舟2，孛珊2，周铜水1，陈家宽1，万树文3，顾敏3，张文驹”
(1．复旦大学生命科学学院生物多样性研究所生物多样性与生态工程教育部重点实验室，上海200433’2．同济大
学生命科学与技术学院，上海200092}3．上海冒允上药业有限公司，上拇200002)
甲基化是指由DNA甲基转移酶介导，在胞嘧
啶或腺嘌呤碱基上的第5位碳原子上加上一个甲基
的化学修饰过程，这种甲基化现象广泛存在于各种
有机体中。DNA甲基化参与植物基因表达的调控，
在植物的生长发育中起着非常重要的作用o。]，可以
用来作为一个反应基因组表达的指标。近年来的研
究表明，DNA的甲基化水平与植物年龄密切相
关o“]。因而，对不同生长年龄的植物基因组甲基化
水平的研究将有助于更深入地认识不同年龄植物的
基因的活动状况。
人参PanaxginsengC．A．Meyer系五加科多
年生植物，索有“百药之王”的美誉。人参的生长年龄
被认为是影响和判断人参品质最为重要的因素之
一，已有研究表明高年龄的人参确实比低年龄的人
参含有更多的有效物质【“。其中，不同年龄人参
DNA的甲摹化水平可能扮演了重要的作用。本研究
采用反相高效液相色谱法，对不同年龄人参的甲基
化水平进行研究，建立了稳定有效的人参DNA甲
基化水平的测定方法，对不同生长年龄的人参的甲
基化水平进行了初步研究。
1材科、仪器与试药
5年栽培参(编号：XR一2，XR一6、XR一7)2004年
8月采自辽宁省新宾满族自治县红升乡张家村，完
全在人工栽培的条件下生长；8年移山参(编号：
HR5—15、HR5—20、HR5—29)和12年移山参(编号：
HR6—8、HR6-20、HR6—30)2005年8月均采自辽宁
省桓仁满族自治县四平乡巨户沟村，移山参样品是
人工将形态好的参苗移到近自然的环境中生长而
成，生长过程中不用农药和肥料。样品自然风干后在
4℃下保存。
Aglient1i00Series高效液相色谱仪，VWD检
测器，柱温箱，紫外分光光度计(Eppendorf)，微量天
平(瑞士梅特勒托莱多公司)等。对照品A(腺嘌呤，
Sigma，批号094K0055，质量分数为99％)，对照品T
(胸腺嘧啶，Sigma，批号114K0757，质量分数为
99％)，对照品G(鸟嘌呤，ALDRICH，批号S04899—
195，质量分数为98％)、对照品C(胞嘧啶，Sigma，批
号114K1088，质量分数为99％)和对照品5-mC(5一
甲基胞嘧啶，Sigma，批号034K1231，质量分数为
99％)；甲醇(色谱纯，Sigma)，磷酸二氢钾(分析纯，
汕头四陇化工厂)，高氯酸(分析纯，上海试剂四厂)，
氢氧化钾(／9-析纯，上海试剂四厂)，SDS(上海生工)，
苯酚一氯仿一异戊醇(25t 24：1，上海生工)，超纯水。
2方法与结果
2．1 DNA提取、水解：采用改良后的SDS法提取
人参DNA[6]。DNA的水解参照Demeulemeester
等03的方法并进行优化。在100pL(舍DNA约25
愕)的DNA溶液加入70蛎的高氯酸50pL，在95
℃下水解50rain，然后用浓度为ltool／I．KOH调
节pH3～5，12000r／rain离心5min，取上清滤过，
注入HPLC中进行检测。
2．2色谱条件：色谱柱为Zorbox×ODS柱子(250
mmx4．6mm，5．am)；流动相：8％甲醇、92％水、
50mmol／L磷酸二氢钾(pH5．8)}体积流量：0．4
mL／min；柱温：30℃}检测波长：285nm}灵敏度：
0．1；进样量：20pL。
’
2．3对照品溶液的制备：精确称取0．4444mg对照
品c和0．05145mg对照品5-mC，分别溶解于10
mL0．1％的高氧酸中，配成浓度为4×102．amol／L
的对照品C母液和208mol／L的对照品5-mC母液。
2．4线性关系考察：将C母液分别稀释至1．25、
2．5、5、10、20．amol／L，分别进样20皿，检测，以浓度
为横坐标，积分面积为纵坐标绘制标准曲线，曲线的
线性方程：y一83．824X+0．404(r=0．9999，=
5)，说明C在1．25～20Fzmol／L有良好的线性关系。
将5-mC母液分别稀释至0．125、0．25、0．5、1、2
收稿日期：3006—11—20
基金项目：上海市科学技术委员会资助项目(04DZl9834)
作者筒介：董姬娟(1982一)，女，云南宜威人，硕士．从事人参年静鉴定和种质资源的研究工作．Tel，(OZl)61442950(021)65642809
E—mail：042023104@fudan．edu．cn
*通讯作者张文驹E—mailiwjzhang@iudan．edu．cn
万方数据
中革焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第9期2007年9月·1417·
／umol／L，分别进样20止检测，以浓度为横坐标，积
分面积为纵坐标绘制标准曲线，曲线的线性方程：
Y=129．37X一0．0458(r=0．9999，n=5)说明
5-mC在0．125～2pmol／L有非常好的线性关系。
2．5精密度试验：选取浓度为5／tmol／L的对照品
溶液5-mC，平行进样5次，计算得到5-mC的峰面
积RSD值为0．68％，说明仪器精密度非常好。
2．6重现性试验：将5年人参样品XR一6，平行制备
5次，上样检测，计算得到5-mC的峰面积的RSD值
为0．50％，C的峰面积的RSD值为1．8“，说明实
验重现性良好。
z．7稳定性试验：将制备的5年人参样品XR一6每
隔2h测定1次，结果5-mC的峰面积的RsD值为
0．84％，C的峰面积的RsD值为1．9％(n=6)，表
明在10h内仪器的稳定性良好。
2．8人参甲基化水平的测定：以C和5-mC对照品
作对照，对照品和供试品的色谱图见图1，C和5一mC
的保留时间分别为7．2、12．7rain。通过公式；
5-mC(％)=C。．“，／(C。一mc+cj)X100％，计算出
5-mC的量，5-mC的量即代表DNA的甲基化水
平口]，见表1。
5-mC
A 。 8
6C f＼
△ jL
—————r————币————1r
—
O
，
5
，，min
lO 15
圈1对照品C、5一mC(A)和人参DNA样品(B)的
HPLC圈
Fig．1HPLCChromtogramsofCand5-mC
lreterl．-Bcesubstance(A)．船well_s
DNAspec量mensofP．毋^印^譬(B)
结果显示，5年栽培参的甲基化水平分别为
10．02％、9．46％、9．47％，平均值为9．65％；8年移山
参的甲基化水平分别为17．oz％、17．27％，17．18％，
裹1不同年龄人参样品的甲基化水平恤=3)
Table1 MathylatlonlevelInP一譬inseng
-t atdiffereBtages佃=3)
平均值为17．16％；12年移山参的甲基化水平分别
为8．11％、11．23％、10．00％，平均值为9．78％。8年
移山参的甲基化水平显著高于5年栽培参和12年
移山参O检验，P<0．05)，但5年栽培参和12年移
山参的甲基化水平十分接近。另外，结果还显示5年
栽培参和8年移山参的同龄个体之间甲基化水平相
差很小，平均差异分别为均值3．32“和0．75％，但
12年移山参的3个个体间平均差异则为16．05％。
3讨论
3．1 人参总基因组DNA甲基化的检测方法：目
前，基因组DNA甲基化检测方法主要有SssI甲基
转移酶法／甲基化酶温育法、氯乙醛反应法、免疫学
法、高效液相法，”等。相比较而言，HPLC法是目前
测定基因组DNA中5-mC总量最标准的方法，其原
理是用核酸酶将总DNA降解为单个核苷酸后再用
HPLC方法定量分析，从而能够从总体上测定出基
因组中胞嘧啶的甲基化程度，用HPLC法测得的数
值准确，而且实验对人体伤害不大，所以本实验便选
择了HPLC进行检测。
3．2 DNA的水解和检测条件探讨：现有关于DNA
的水解，多采用70％的高氯酸在100℃下水解1
h[3]。但在实验过程中发现，在高热条件下5-mC极
易发生脱氨基作用，从而在对照品5-mC的保留时
间处不能检测到，这可能与人参DNA的质量有关。
根据水解时间和水解温度的梯度实验，认为95℃、
55min是人参DNA的最佳水解条件。在检测波长
选择上260、273、275、285nm等均有报道[318。]，通
过5-mC的紫外吸收扫描，5-mC在285nm处有最
大的吸收波长，所以选用285ilm作为人参甲基化
的检测波长。
3．3人参甲基化与年龄的关系：结果显示人参总基
因组DNA的甲基化水平并不随着年龄的增加而线
性减少，5年的栽培参甲基化水平反而最低；在移山
参中 8年人参的平均甲基化水平显著高于12年人
万方数据
·1418· 中单焉ch虹哪TraditionalandHerbalD邝弘第38卷第9期2007年9月
参，随着衰老程度的增加，甲基化水平是降低的，这
和以往在人和老鼠上的实验结果是一致的““11】。这
一结果表明不仅是生长年龄，生长条件也可能显著
地影响人参总基因组DNA的甲基化水平。这似乎
意味着栽培参的衰老和穆山参的衰老并非同步，而
是远远的早于移山参。
8和12年人参虽然同属于移山参，但是8年人
参个体间的甲基化水平变化较小，12年人参个体问
的甲基化水平变化相对较大，推测可能因为移山参
生长的环境比较开放多变，受外界环境因子的干扰
法，线性关系好，精密度、重现性及稳定性均符合要
求。并测得人参总DNA的甲基化水平，为进一步研
究人参生长年份与DNA甲基化水平之间的关系，
及建立人参生长年份的精确鉴定方法奠定了基础。
鉴于本实验初步测定的人参总DNA的甲基化
水平的变化比较复杂，特别在不同年龄的个体之间
存在明显差异且幅度较大，人参生长环境、生长年份
都可能影响人参总DNA的甲基化水平。因此有必
要关注和分析一些特定的基因的甲基化水平随人参
生长年份的变化规律。
12年人参个体的甲基化水平影响较大。除此之外， [11㈣三忌村D．N2Ao06．Me‘3h01lyia‘i67_onlin22．phn协口3。哳T印
由于DNA的甲基化水平和植物生长发育期和生长 ‘2|devHou。10pLP⋯,L。i[MJ]?‘蛊温惴7船、麓留警霹黼紫
DNA的甲基化的水平都会有差异．所以不同人参个 ‘“DDee。m。eul詈；叛凳盒意．：3墨裂昌一，c皇Z2‘0妊
体的生长状态可能也会影响人参个体问的甲基化水 b右。‘盐：％o{嚣?“’”⋯8⋯蒯‘“1i”伽·’““＆2’
平。由于本研究所用材料年龄段和生境类型不多，因 ‘““Vi。n：ea，tt，t。i量。■。。愁。乞；署：。；‘龄了‘未麓!!；】銮●i搿：
此甲基化水平与生长年龄以及生长环境的关系还有 [5]：器Y1)J：，9294h6。-。9995w1’J，(：；henJK，“吐Ad。。。fmdi档
ER，RUNX3、MLHl等阻}3基因的甲基化水平都和[6]W‘中an草g药Qh．c20hoe7n；蛩3z)b：a4n697-L47，o≥4fDi8tingui8hingwild
植物年龄密切相关，其中ER、MLHI的甲基化水平 。P。ap¨nax‰g。。inIonsen。gfllenL-oi“。嚣警盟毒：翟：f：鬣57篙掣器
都随年龄的增加而增长，而且ER成线性增加。不同 [7]知0宅”‰}焉昱李学an学d报detl“,20⋯04,ft43h(6。’：I-：：：品怒。of
基因的甲基化状态是会随着不同的生理状态发生不；燃黑矗心P”4埘‘现代预防医学’’2”5’”‘9’‘
同的变化·而总基因组的甲基化水平反映的是所有 [83翟蜜誊：。k器互赫鉴豫品羔韪。詈翟瓣：患
基因甲基化程度的综合反应，变化比较复杂。如能在 ：哆n、on⋯-neo⋯plas‘“gastricE州heh[J]·c—”蹦，2003,
人参的DNA中找到一些恰当的基因，研究他们的 ‘⋯hHyidperew。aktihj；tbG。er。afrdtheJ5急意等nMuLalHEli三一Ag。el-。re山latmed。
甲基化水平变化规竺，或许会有助于确定甲基化与 ⋯muc。os，ad。is。al。ss。o。cia。t。ed[Jw]．i‘邕絮麓Z11蔷?篙?1；。嚣蠕掣
有效成分积累的关系。 [103LlJ，PanXrL--，．Pan⋯ZM．Agingandmethylationo DNA
·结语 [，。]器三乡Z象盎‘笋要专皇眷l慧’墨躲0骝。,1啦34-t[J]36．．
本实验建立的人参DNA甲基化水平的测定方 F(Ior)。MIe3d．黝。G”如妒‘国外医学’老年医学分册’’1992’13
《中国新药杂志》征订信息
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万方数据
HPLC法测定不同年龄人参DNA的甲基化水平
作者： 董亚娟， 程舟， 李珊， 周铜水， 陈家宽， 万树文， 顾敏， 张文驹
作者单位： 董亚娟,周铜水,陈家宽,张文驹(复旦大学生命科学学院生物多样性研究所,生物多样性与生
态工程教育部重点实验室,上海,200433)， 程舟,李珊(同济大学生命科学与技术学院,上海
,200092)， 万树文,顾敏(上海雷允上药业有限公司,上海,200002)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(9)
被引用次数： 4次

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