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ISSR Analysis on medicinal plants of Caragana Fabr. in Ordos Plateau

鄂尔多斯高原锦鸡儿属药用植物的ISSR分析



全 文 :·1562· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
鄂尔多斯高原锦鸡儿属药用植物的ISSR分析
杨九艳h2,杨 劫1,杨明博1,鞠爱华2,渠弼2
(1.内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特010021;2.内蒙古医学院药学院,内蒙古呼和浩特010059)
摘要:目的 分析鄂尔多斯高原分布的8种锦鸡儿的遗传多样性。方法 采用1SSR技术进行研究。结果8种
锦鸡儿总的多态位点百分率(PPB)很高,达100%,表明它们的遗传多样性很丰富。但是在种间的分布是不均匀的,
藏锦鸡儿、柠条锦鸡儿、狭叶锦鸡儿、荒漠锦鸡儿和中间锦鸡儿的遗传多样性较高,甘蒙锦鸡儿和秦晋锦鸡儿较低,
短脚锦鸡儿最低。此结果与Nei’S基因多样度和Shannon信息指数的遗传多样性分析结果一致。根据非加全算术
平均聚类法以及ISSR特征图谱可以将不同种区分开来。结论ISSR分子标记可很好地用于锦鸡儿物种的分子鉴
定和遗传背景研究,其结果为制定有效的保护策略和措施提供了科学依据。
关键词:锦鸡儿属;鄂尔多斯高原;遗传多样性;ISSR .
中图分类号:R282.7 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)10—1562—05
ISSRAnalysisonmedicinalplantsofCaragana.Fabr.inOr.dosPlateau
YANGJiu—yanl’2,YANGJiel,YANGMing—b01,juAi—huA2,QuBi
2
(1.CollegeofLifeScience,InnerMo goliaUniversity,Huhhot010021,China;2.School
ofPharmacy,InnerMo goliaMedicalCo lege’Huhhot010059,China)
Abstract:ObjectiveToanalyzethgeneticd versityofeightspeciesofCaraganaFabr.inOrdos
Plateau.MethodsTostudythegeneticd versityoftheightspecieswithISSRmethod.ResultsThetO..
talpercentageofpolymorphicbands(PPB)oft.he ightspecieswauptO100%,whichWasextremelyhigh
andshowedanabundantge eticd versity.However,theg n ticd versityofdifferentspecieswasnothe
same.Thegeneticd versityofC.tibetica,C.korshinskii,C.stenophylla,C.roborovskyi,andC.interme—
diawashigher,whilet atofC.opulensandC.purdomi]waslower,andthatofC.brachypodawasthe
lowest.TheanalyticresultsoftheNei7SgenediversitiesandtheShannon7Sinformationindexweresimi一

lar.Differentspeciescouldbedifferentiated.throughUPGMAmet odancharacteristicband ngpatternof
ISSR.ConclusionISSRM lecularmarkercouldbeusedinmolecularauthenticationandhereditaryback—
groundstudyofthespeciesofCaraganaFabr.Theser ultsprovideth scientificbasisofdeveloping
effectiveprotectionmeasuresforthesepecies.
Keywords:CaraganaF br.;OrdosPlateau;geneticdiv rsity;IS.SR
锦鸡儿为豆科落叶灌木,全革、根、花和种子入
药,味甘,微辛,性平。具有滋阴养血,清热解毒,利
尿,益气安神,通经下乳,祛痰止咳及祛风湿止痹痛
等功效。主要用于治疗妇科疾病,头晕头痛,心慌气
短,咳嗽多痰,风湿痹痛等症[1]。锦鸡儿不仅具有药
用价值,而且抗逆性强,可防风固沙保持水土,在生
态建设中发挥着重要的作用。锦鸡儿目前尚属未被
大量开发利用的药材。为防止滥采引起生态问题,应
以保护先行的思想对其进行研究。本实验选取分布
于鄂尔多斯高原的8种锦鸡JLc2]为研究对象,结合
不同的生境,采用简单重复间序列(inter—simplese—
quencerepeat,ISSR)标记,从分子水平分析其遗传
多样性,揭示它们种问的亲缘关系,为锦鸡儿的保
护、引种驯化、繁育栽培和分子鉴定提供理论依据。
1实验材料.
8种锦鸡儿采自鄂尔多斯高原。每种随机选
取20株,采集幼叶,分别用变色硅胶进行快速干
燥,一20℃保存备用。材料及采样地点概况见表1,
实验材料由内蒙古大学赵一之教授鉴定。
2 方法
收稿日期:2006一01—25
基金项目:内蒙古自治区教育厅科学研究项目(NJ03136)
作者简介:杨九艳(1963一),女,副教授,硕士生导师,从事药用植物的教学、科研工作,现在内蒙古大学生命科学学院攻读博士学位。
Tel:(0471)6636293E—mail:yangiyll22@163.corn
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1563·
表1材料及采样地点
Table1 Materialsandsitesofsamples
种 名(代号) 采集地 东经/(。) 北纬/(。) 海拔/m 年降水量/ram平均气温/C
秦晋锦鸡儿(QJ)Caraganapurdomii
甘蒙锦鸡儿(GM)C.opulens
中间锦鸡儿(zJ)C.intermedia
柠条锦鸡儿(NT)C.korshinskii
荒漠锦鸡儿(HM)C.roborovskyi
狭叶锦鸡儿(XY)C.Menophylla
藏锦鸡儿(Z)C.tibetica
短脚锦鸡儿(DJ)C.brachypoda
准格尔旗
准格尔旗
乌审旗
鄂托克旗
鄂托克前旗
鄂托克旗
鄂托克前旗
鄂托克旗
110.41
111.05
108.42
106.45
107.16
108.02
107.16
106.45
39.28
39.45
38.36
39.58
38.08
39.14
38.08
39.58
2.1 总DNA的提取:采用CTAB法[3]并略作修
改。称取80mg经硅胶干燥后的样品置于研钵中,
加入50mgPVP粉,在液氮中迅速研磨至粉状,然
后加入到700弘L预热到65℃的CTAB提取液中,
并在65℃水浴下温浴60min,期间不断颠倒混匀,
使其抽提完全;加入等体积(700弘L)的氯仿一异戊醇
(24:1),颠倒混匀,10000Xg离心10min,取上清
液转入另一1.5mL离心管中,用700pL氯仿一异戊
醇重复抽提1次(可重复至白色界面消失),记录,取
出上清液的体积;加入2/3体积的一20℃异丙醇,
混匀后置于一20℃、30rain以上,100 0×g离心
10min,弃上清液,风干沉淀。用700弘L70%冷乙醇
溶液洗涤沉淀两次,10000×g离心5rain,风干沉
淀;加入20扯LTE缓冲液融解DNA。0.7%琼脂糖
凝胶电泳检测各模板有无降解,并估计DNA大致
的量,结合DU—T型紫外分光光度计测定的吸光
度A:。。和A。。。,计算其质量浓度和纯度,配平所有模
。板浓度,每种优选出1l株的DNA用于扩增。
2.2引物筛选:选用羽状叶的中间锦鸡儿和假掌状
叶的狭叶锦鸡儿进行预试验,采用由上海生物工程
公司(Sangon)生产的随机引物进行筛选,选出14
个扩增良好、带型清晰、稳定且具有多态性的引物用
于样品的扩增。
2.3 ISSR反应体系及扩增程序:反应体系为总体
积25肛L,其中模板DNA1 pL(20ng),5mm01/L
MgCl2 2.0pL,10×PCRbuffer2.5tLL,10mmol/L
dNTP0.4弘L,Taq酶(5U/t1L)0.2pL,弓I物(10
tzmol/L)1肛L,无菌双蒸水17.9弘L,上述药品购自
上海生物工程公司(Sangon)。扩增反应在美国MJ
ResearchInc.生产的PTC一100TM型PCR热循
环仪上进行。扩增程序为:94℃预变性5min,94℃
变性45S,54℃退火1min,72℃延伸1.5min,进
行45个循环,最后72℃延伸5min,4℃保温。
2.4扩增产物的检测:扩增产物在2.0%的琼脂糖
凝胶中电泳分离,JY600C型电泳仪稳压80V2.5
h,溴化乙锭染色,用100bp的DANladder作为相
对分子质量标记,TanonGIS一2008紫外凝胶成像
系统成像拍照。
2.5 数据统计分析:同一引物的扩增产物中,属于
同一位点的条带按有或无记录,清晰可见的强带或
反复出现的弱带记为“有”,赋值l,无带计为“无”,
赋值0,建立二元数据矩阵。重现性不好的弱带不予
统计。利用Popgen32软件计算基因频率,多态位点
数及百分率(尸),Shannon多样性指数(J。),Nei基
因多样度指数(H),遗传一致度(J)和遗传距离
(D);并用非加全算术平均聚类法(UPGMA)进行
系统聚类分析,构建树状图。
3结果与分析
3.1 遗传多态性分析:本研究PCR反应扩增的
DNA片断大小一般在300~200bp(图1),引物
序列及扩增结果见表2。14个ISSR引物共扩增出
355条带,即355个位点,平均每个引物扩增带数为
25.36条,多态位点为355个,总的多态性条带比率
(PPB)达100%,揭示了锦鸡儿基因组具有丰富的
多态性。
表2引物序列及扩增结果
Table2 Sequenceofprin.ersandamplificationresults
3
3
7
2
4
4
4
2
7
7
6
8
6
6
6
8
6
6
4
4
6
4
6
4埘埘|罨至|ⅢⅢⅢ量|
O
5
8
6
8
5
8
6加弘∞蛆盯船∞
;i
1
1
万方数据
·1564· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
图l 引物AW64751对8种锦鸡儿不同个体的扩增结果
Fig.1ISSRAmplifiedpro uctsgeneratedbyPrimer
AW64751todifferentsamplesof ight
。speciesofCaraganaFabr.
3.2遗传多样性分析:由表3可知,8种锦鸡儿多
态位点百分率的大小顺序为:藏锦鸡儿>柠条锦鸡
JL>狭叶锦鸡JL>荒漠锦鸡JL>中间锦鸡儿>秦晋
锦鸡JL>甘蒙锦鸡JD>短脚锦鸡儿;根据Nei基因
多样度分析,由高到低为:柠条锦鸡JL>藏锦鸡JL>
荒漠锦鸡儿>狭叶锦鸡儿>中间锦鸡JL>甘蒙锦鸡
JL>秦晋锦鸡JL>短脚锦鸡儿;由Shannon信息指
数分析结果为:柠条锦鸡JL>藏锦鸡JL>狭叶锦鸡
儿>荒漠锦鸡儿>中间锦鸡JL>秦晋锦鸡儿>甘蒙
锦鸡JL>短脚锦鸡儿。3种分析的结果基本一致,藏
锦鸡儿和柠条锦鸡儿的遗传多样性最高,狭叶锦鸡
儿和荒漠锦鸡儿次之,中间锦鸡儿较高,甘蒙锦鸡儿
和秦晋锦鸡儿较低,短脚锦鸡儿最低。
3.3遗传一致度和遗传距离:表4是8种锦鸡儿间
的遗传一致度和遗传距离。其中藏锦鸡儿与狭叶锦鸡
儿、藏锦鸡儿与柠条锦鸡儿、柠条锦鸡儿与中间锦鸡
儿的遗传一致度均很高,分别达0.8917、0.8847、
0.8817,遗传距离很小,分别为0.1146、0.1225、
0.1259;秦晋锦鸡儿与甘蒙锦鸡儿的遗传一致度较
低,为0.7939,遗传距离较大,为0.2307;短脚锦鸡
儿与其他种间的遗传一致度最低,为0.7034~
0.7591,遗传距离最大,为0.2756~0.3518。
3.4 聚类分析:根据种间的遗传距离,采用UPG一
表3 8种锦鸡儿的遗传多样性比较
Table3 Comparisonofgeneticd versityamongeight
speciesofCaraganaFabr
表4 8种锦鸡儿的遗传一致度与遗传距离
Table4 Geneticide.ntity.andgeneticd stance
amongei litspeciesofCaraganaFabr.
品种代号QJ GM ZJ NT HM XY Z DJ
q ****0.7939 0.8474 0.8407 0.8393 0.8449 0.8376 0.7034
GM 0.2307****0.8107 0.8 56 0.816O 0.8179 O.8464 0.7221
ZJ 0.1656 0.2009****6.8817 0.8274 0.8560 0.8573 0.73l8
NT 0.1604 0.2038 0.1259****0.8398 0.8532 0.8847 0.7282
HM 0.1755 0.2034 0.1894 0.1746****0.8405 0.8572 0.724l
XY 0.1685 0.2010 0.1555 0.1587 0.1738****0.8917 0.7591
Z 0.1772 0.1667 0.1540 0.1225 0.15410.1146****0.7443
DJ 0.3518 0.3256 0.3122 0.3172 0.3228 0.2756 0.2953***+
Nei’S遗传一致度(对角线以上数据)与遗传距离(对角线以下
数据)
Nei’Sgeneticidentity(abovediagonal)andgeneticd stance
(belowdiagonal)
MA法进行聚类分析,结果见图2。由树状图可以看
出,当取值水平D一0.1146时,狭叶锦鸡儿和藏锦
鸡儿聚到一起成为第1类群;D一0.1259时,中间
锦鸡儿和柠条锦鸡儿聚到一起成为第2类群;然后
这两类聚到一起成为第3类群;以后逐级与秦晋锦
鸡儿聚成第4类群,与荒漠锦鸡儿聚成第5类群,与
甘蒙锦鸡儿聚成第6类群;而短脚锦鸡儿自成一支。
此结果揭示了狭叶锦鸡儿和藏锦鸡儿遗传基础相
近、,中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿的亲缘关系最近;短脚
锦鸡儿与其他种的亲缘关系较远,甘蒙锦鸡儿次之。
3.5 8种锦鸡儿的特有带:特有带为某种所特有出
现,而其他种没有出现的ISSR条带,8种锦鸡儿各
自的扩增带及特有带数见表5。14个引物在8种锦
鸡儿中只产生10条特有带,占总带数的2.82%。各
种的特有带均很少或无。这说明他们之间的亲缘关
系密切。
3.6 ISSR特征图谱:将每种的11株个体的DNA
等量混和,进行扩增。引物Aw64751、AW64750、
AW77934、AW77939的扩增结果见图3。8个种具
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1565·
!+..4+⋯⋯20
1 1 +.~2
+一31+一⋯.一XY
+~l
+一Zf+⋯⋯~一⋯一⋯·HM
一7 +——⋯——————————.“M
+—.⋯..⋯⋯——..⋯一⋯....⋯⋯⋯⋯——⋯——【)J
0.30 0.20 0.10 0.00
图2 8种锦鸡儿的Nei’s遗传距离聚类图
Fig.2DendrogramofUPGMAbasedonNei7sgenetic
distanceofeightspeciesofCaraganaFabr.
表5 8种锦鸡儿ISSR特有带
Table5 ISSRPeculiarb ndsofeightspecies
ofCaraganaFabr
有不同的特异性条带,呈现出清晰的谱带特征,利用
这些引物获得的ISSR特征图谱可以将不同的锦鸡
儿种区分开来。
4讨论
从聚类图上可以看出,不同种的锦鸡儿属植物
得到了明显的区分,表明ISSR分子标记可以做为
其种的分子鉴定依据。在聚类图中,藏锦鸡儿和狭叶
锦鸡儿首先聚在了一起,说明它们有相近的遗传基
础。藏锦鸡儿和狭叶锦鸡儿的适应性均很强,都是半
荒漠地带的建群植物,相似的遗传特征是它们的基
础。柠条锦鸡儿和中间锦鸡儿是地理替代种[4],两个
种之间存在明显而强大的基因流[5],削弱了种间的
遗传差异,两种的亲缘关系很近。
在扩增带中,秦晋锦鸡儿、中间锦鸡儿、荒漠锦
鸡儿、狭叶锦鸡儿和藏锦鸡儿均有特有带存在,将不
同种的特有带进行克隆测序,转化为SCAR标记,
可对不同种进行DNA分子鉴定,并在一定程度上
区分其道地性L6J。
ISSR技术可以比RFLP、SSR、RAPD等技.术
更多地揭示基因组中的多态性,是一种很好的DNA
图3 8种锦鸡儿的ISSR图谱[引物AW64751(A)、
AW64750(B)、AW77934(C)和AW77939(D)]
Fig.3BandingpatternofISSRofeightspecies
ofCaraganaFabr.[PrimerAW64751(A),
AW64750(B),AW77934(C),and
AW77939(D)]
分子标记,因此,该技术在种质资源方面显示出比其
他方法更高的优越性,在植物种质资源鉴别中发挥
越来越大的作用[7],此法在锦鸡儿的鉴别中得到了
很好的运用。
在分子标记中PPB值的大小代表了遗传多样
性的高低c6‘。从扩增结果看出,8种锦鸡儿属植物总
的PPB很高,达100%,表明该属植物遗传多样性很
丰富,但在种间的分布是不均匀的。藏锦鸡儿、柠条
锦鸡儿、狭叶锦鸡儿、荒漠锦鸡儿和中间锦鸡儿的遗
传多样性较高,甘蒙锦鸡儿和秦晋锦鸡儿较低,短脚
锦鸡儿最低。多态位点百分率对遗传多样性只是一
个粗略的估计,虽然能反映所测位点中不同等位基
因的位点有多少,但是它并不能反映每个位点的等
位基因的丰富程度。而基于条带表型频率的Shan—
non信息指数和基于Hardv~Weinberg假设的Nei
基因多样性指数则可以得到更为可信的衡量指
标[8]。对8种锦鸡儿的遗传多样性进行分析时,这两
者的结果与PPB的结果基本一致。从遗传学的角度
来看,丰富的遗传多样性意味着比较高的适应能力,
蕴涵着比较大的进化潜能及比较丰富的育种和遗传
改良能力[9]。藏锦鸡儿、柠条锦鸡儿、狭叶锦鸡儿、荒
漠锦鸡儿和中间锦鸡儿均具有很强的适应力,分布
于极干旱的半荒漠地区,且为该地区的优势植
物[1引,丰富的遗传多样性是它们的内在基础,具有
广阔的利用前景。秦晋锦鸡儿和甘蒙锦鸡儿的遗传
多样性相对较低,在鄂尔多斯高原的储量也较少,应
注意保护利用。短脚锦鸡儿的遗传多样性最低,而且
万方数据
·1566· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
与其他种的遗传相似度低、遗传距离大,加强对该种
的保护显得尤为重要。
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鹿源类中药材DNA序列分析及马鹿和梅花鹿的PCR鉴定
白根本1,张林源2,刘春生1,程伟1,陈代贤3
(1.北京中医药大学,北京 100102;2.北京麋鹿生态实验中心,北京100076;3.大连市药品检验所,辽宁大连221100)
摘 要:目的 采用特异引物PCR扩增鉴定马鹿和梅花鹿源中药材。方法从马鹿、梅花鹿等国内11种鹿的鹿血
和鹿茸中提取DNA,用通用引物L1091和H1478调取细胞线粒体12SrRNA基因片段,在该片段核苷酸序列比对
的基础上,设计马鹿和梅花鹿高特异性PCR鉴定引物对,并进行PCR特异性鉴定。结果12SrRNA基因片段能
较好地在种的水平上将不同的种区分开来;特异引物对(EP一1/H1478和EP一2/H1478)PCR可准确地鉴定出马鹿
和梅花鹿等。结论特异引物PCR适宜马鹿、梅花鹿等珍贵中药材的鉴定。
关键词:鹿:DNA序列;PCR鉴定
中图分类号:R282.7 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)10—1566—04
AnalysisofDNAsequenceofChinesemedicinalmaterialsdeersandPCRidentification
ofCervuselaphusandC.nippon
BAIGan—benl,ZHANGLin—yuan2,LIUChun—shen91,CHENGWeil,CHENDai—xian3
(1.BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100102,China;2.BeijingMiluEcologicalResearch
Center,Beijing100001,China;3.DalianInstituteforDrugControl,Dalian221100,China)
Abstract:ObjectiveToidentifytheanimaldrugofCervuselaphsandC.nipponfromoriginofdeers.
MethodsToextractDNAfromdeerbloodandhairyantlerof11 speciesofdeerssuchasC.elapbus,C.
nipponandsoon,andtogainthemitochondriat12S RNAgenefragmentusingthegeneralprimersof
L1091andH1478.Basedonthesequencemuhialinementof11speciesd ersaboveg nefragments,design—
ingthecouplesofspecialdifferenceprimersandidentifyingC.elaphsandC.nippon.Results12SrRNA
Genefragmentscandistinguishdifferentdeerswell.Thecoupleofprimers(EP一1/H1478andEP一2/
H1478)PCRcaneffectivelyd ntifyC.elaphusandC.nippon.ConclusionSpecialprimerPCRissuitable
fortheidentificationofvaluableChinesemedicinalmaterials,suchasC.elaphusandC.nippon.
Keywords:deer;DNAsequence;PCRidentification
收稿日期:2005-12-26
基金项目:北京中医药大学21I工程项目资助
作者简介:白根本(1958一),教授,博士后,长期从事遗传学、生物技术的教学与科研工作,主持完成2项国家自然科学基金等,发表论文
40余篇。Tel:(010)64219516E—mail:baigb@263.net
万方数据
鄂尔多斯高原锦鸡儿属药用植物的ISSR分析
作者: 杨九艳, 杨劼, 杨明博, 鞠爱华, 渠弼, YANG Jiu-yan, YANG Jie, YANG Ming-bo
, JU Ai-hua, QU Bi
作者单位: 杨九艳,YANG Jiu-yan(内蒙古大学生命科学学院,内蒙古,呼和浩特,010021;内蒙古医学院药
学院,内蒙古,呼和浩特,010059), 杨劼,杨明博,YANG Jie,YANG Ming-bo(内蒙古大学生命
科学学院,内蒙古,呼和浩特,010021), 鞠爱华,渠弼,JU Ai-hua,QU Bi(内蒙古医学院药学
院,内蒙古,呼和浩特,010059)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2006,37(10)
被引用次数: 3次

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10.Li B 内蒙古鄂尔多斯高原自然资源与环境研究 1990

引证文献(3条)
1.唐铖.张铁军.刘昌孝 基于PCR技术的中药指纹图谱研究[期刊论文]-天津中医药大学学报 2007(3)
2.刘萍.马宏玮.王掌军 我国药用植物种质资源遗传多样性及其研究进展[期刊论文]-农业科学研究 2008(3)
3.XIAO Xue-feng.HU Jing.XU Hai-yu.GAO Wen-yuan.ZHANG Tie-jun.LIU Chang-xiao Key Techniques and
Application Progress of Molecular Pharmacognosy[期刊论文]-中草药(英文版) 2011(2)


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