全 文 ：·568- 中草祷ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
血一再灌注时高能磷酸物质生成严重不足，心肌组织
ATP水平较正常时降低了60％，TAN水平仅达到
正常组的48％，Na+，K+一ATP酶、Mg”一ATP酶、
Ca”一ATP酶活力均不同程度下降，而PL各剂量
组心肌组织ATP、TAN水平和能量负荷值(EC)
均显著高于模型组，此结果提示PL可能通过减慢
能量物质的分解，改善心肌有氧代谢而发挥抗心肌
缺血一再灌注心律失常的作用。
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雷公藤甲素对健康人外周血单个核细胞分泌TNF—O[的抑制作用
与TNF一0c基因多态性的关系
涂胜豪，陈缸渡，盛冬云，胡永红，刘沛霖
(华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合科，期北武汉430030)
摘 要r目的探讨雷公藤甲素对外周血单个核细胞(PBMC)分泌肿瘤坏死因子一a(TNF—a)的抑制作用与
TNF—n基因多态性之间的关系。方法采用等位基因特异引物PCR法对健康人TNF一“基因启动子区一308位点
基因多态性进行检测，ELISA法检钡4TNFa的量。结果TNF—a一308非G／G纯台子基因型健康志愿者PBMC经
脂多糖(LPS)刺激后TNF—n的分泌量明显较TNF—a一308G，G纯合子基因型的志愿者高}雷公藤甲京能够抑制
TNF一308G／G纯台子基因型继康志愿者PBMC分越TNF一。，而对TNF—a一308非G／G纯合子基因型健康志愿
者PBMC分泌TNF—a没有明显的抑制作用。结论雷公藤甲素抑制外周血单个核细胞分泌TNF—a的量与
TNF—a基因多态性有关。
关犍词：肿瘤坏死因于a(，INF—a)；基因多态性；雷公藤甲素；外周血单个棱细胞
中圈分类号：R285．5 文献标识码rA 文章编号：0253—2670(2006．)04—0568—04
RelationshipbetweeninhibitionoftriptolideonTNF-ocproductionfromperipheralblood
mononuclearellsinhealthyhumansandTNF—agenepolymorphism
TUShenghao，CHENong—bo，SHENGDong—yun，HUYong—hong，LIUPei—lin
(DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine．TongjiHospitalAffiliatedTongji
MedicalCo lege，ChinaCentralUniversiryofScienceandTechnology，Wuhan430030，China)
Keywords：tumornecrosisfactor—d(TNF—n)；genepolymorphism；triptolide；peripheralblood
mononuclearells(PBMC)
警鍪是冒i普鉴省絮薯学基金赞助项目。。。。。。。。。，
作者筒介：T嚣e胜l：烹譬髫；磊；；嚣；瑚』匕E武ma援il^=s’h博tu士a@t’j副h,教tjm接u’,磺ed士u,生cn导师·主要从事中西医结合治疗风湿病研究
万方数据
中草药ChineseTradiUonalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
肿瘤坏死因子一a(TNF—n)是具有广泛生物活
性的重要细胞因子，在类风湿性关节炎的发病过程
中起到重要作用。TNF—a基因组中多个位点存在基
因多态性，如308、一208、+498等o]，其中以308
位点的基因多态性可能与类风湿性关节炎的易感
性、药物疗效和预后情况之间的关系较密切o“]。雷
公藤内酯(tripmlide，TP}又称雷公藤甲素、雷公藤
内酯醇)是雷公藤的主要活性成分之一，具有较强
的抗炎和免疫抑制作用。雷公藤在临床上广泛用来
治疗类风湿关节炎，但其临床疗效存在一定的个体
差异性。本实验研究TP抑制外周血单个核细胞
(PBMC)分泌TNF—a与TNF—a基因多态性之间
的关系，以探讨TNFa基因多态性与雷公藤治疗
类风湿关节炎疗效差异性之间是否存在关联。
1材料与方法
1．1 对象：与本院体检中心协作，随机选取41名
汉族健康成年人，年龄21～50岁，平均33岁；男性
24名，女性17名，均无自身免疫性疾病病史和相关
疾病家族史。每名志愿者抽取肘静脉血8mI。，其中
2mI，用来提取DNA和进行基因亚型检测，6mL
用来进行细胞培养。
1．2 试剂：全血基因组DNA提取试剂盒(Gentra
systems)；RPMI一1640培养基(Hyclone)；脂多糖
(LPS，Sigma)；人TNFa ELISA试剂盒
(PIERCE)；PCR引物由上海生物工程技术有限公
司合成}雷公藤甲素(TP)由福建医学科学研究所
提供，质量分数98．5％以上，以二甲基亚砜
(Sigma)助溶，磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，配制成
240ng／ml，的贮存液。
1．3基因多态性的检测
1．3．1 TNF—d一308位点基因多态性检测：利用等
位基因特异引物PCR(AS—PCR)方法来检测
TNF☆308位点的基因多态性，参照Warzocha和
林经安等“’7]报道的引物序列，委托上海生物工程技
术有限公司合成，序列为F1：5-TCTCGGTTT—
CTTCl、CCATCG37{R1：57ATAGGTTTTGAG—
GGGCATGG一3’；R2：5LATAGGTTTTGAGGGG
CATGA一3’和R3：57一GAGTCTCCGGGTCAGAA—
TGA一3’，R3为内对照引物负链，Fl和R1／R3组成
检测TNFl一内对照引物对，F1和R2／R3组成检测
TNF2一内对照引物对。
1．3．2PCR反应体系及条件：在50pL的反应体
系中，含有10×缓冲液5,uL，25mmol／LMgCI2 4
I。，10mmol／I。dNTPs、5UTaq聚合酶、110
pmol／LTNFl内对照引物对或TNF2一内对照引物
对分别为5、2．5、2．5p-L，DNA模板l～2pg，置于
循环仪中，PCR反应参数为：95C、10min后，按
95C、90s，60℃、150s，72℃、60s，反复循环34
次，最后72C延伸7min，结束PCR反应。
1．3．3结果分析：取PCR产物6／*L，在2％琼脂
糖凝胶电泳，每管样本PCR产物均出现531bp的内
参照条带，以出现184bp的反应管来判断为TNFl
或TNF2纯合基因型，或者是TNFl／2杂合型。
1．4 PBMC的分离与培养：取健康人静脉血．未经
处理，直接在超净工作台中用Ficoll淋巴细胞分离
液无菌分离PBMC，重悬于RPMI一1640培养液(含
lO％小牛血清)中，制成细胞悬渡，并调整细胞终浓
度为l×10s／mI。。将细胞悬液加到96孔培养板中，
每孔150pL，置于37C、5％CO：细胞培养箱预培养
24h后，进行加药干预培养。设置LPS对照组、TP+
LPS组，LPS、TP的终质量浓度分别为4．5ng／mL
和1p-g／mL(预试验表明此为最佳剂量)，置于
37C、5％cO：细胞培养箱继续培养48h后．离心，
收集培养基上清液．保存于 70C冰箱待检。
1．5 TNF—a水平检测：利用El。ISA试剂盒来检测
上清液中TNFa，按照说明书操作，酶标测试仪在
450llm处测吸光度(A)值。
1．6统计学处理：数据利用SPSSll．0统计软件处
理进行t检验。
2实验结果
2．1 TNFn一308基因多态性检测结果：在41例健
康志愿者中，TNF—n一308位点G／G、G／A、A／A3种
基因型例数分别为34、6、1例。PCR产物电泳结果
见图l。
2．2 TNF—d基因多态性的影响：由于G／A和A／
A基因型均可使TNF—a基因表达增加．且A／A基
因在人群中出现的频率低，故将G／A基因型和A／
A基因型合并分析，结果见表1。
3讨论
类风湿性关节炎是一种与多种遗传因素相关联
的自身免疫性疾病，其发病过程涉及多种炎性细胞
因子，TNF—a则是其中重要细胞因子之一。TNF—n
主要由单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞分泌，具有广
泛的诱导炎症和免疫调节功能。编码TNF—a位于
染色体6p21．3，在MHC一Ⅲ类基因区内，与MHC
基因紧密连锁“]。在TNF—a57端基因调节区多个位
点存在基因多态性，而在这些位点中，以一308位点
基因多态性与类风湿关节炎的发病、治疗及预后有
万方数据
·570· 中草蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
M—pUCMixDNA标准分子量I、2-TNFl纯台基闲型
3、4TNF2纯合基因型5、6-TNFl／2杂音基因型
M—pUCMixDNAstandardmolecularweight1．2homogeaio
TNFI3，4homogemcTNF25t6heterogenic’FNFl／2
图1 正常淋巴细胞TNF—d一308位点的不同基因型
电泳图谱
Fig．1EleetrophoretogramofdiffeFentTNF—a一308
genetypeinnormallymphocyte
表1 TP对PBMC分泌TNF—a的影响(x-L-_s)
Table1 EffectofTPonTNF—oproducedbyPBMC“土5)
组别 一!!!：!坐!’兰：11A一((j／G)(34倒)A+(G／A，A／A)(7倒)
与I．Ps组IZ较；+I’<0．05；与A犁比较：4P
随着遗传药理学和药物基因组学的不断深人研
究．人们发现药物的疗效和不良反应存在个体差异
的潜在原因，除了与疾病的轻重，个体情况(年龄，
营养，肝肾功能)，伴发疾病等有关联外，个体基因差
异也是其中重要的原因之一。这种基因上的多态性
可能导致药物代谢酶、药物转运体、药物受体或药物
靶标产生多态性，而这些多态性的存在可能是导致
药物治疗中个体间存在疗效和不良反应差异的重要
原因：8Ⅲ。
TNF—a作为许多药物在体内的作用靶标，其基
因多态性很可能会影响到药物的临床功效。几组实
验研究发现，TNF—d一308位点的基因多态性可以导
致TNF—a转录水平的不同[1““]，从而导致体内
TNF—a水平的不同，而这种差异性的存在则可直接
影响到药物的临床疗效。BalogA等给予类风湿关
节炎病人(RA)和克罗恩病人(Crohn’disease)
抗一TNF抗体药物infliximab治疗，发现A+(G／A，
A／A)的病人对infliximab疗效评价明显低于A一
(G／G)病人o]，这表明A+(G／A，A／A)RA患者治
疗难度可能较A(G／G)RA患者高，同时提示
TNF—a一308基因多态性不仪可以作为疾病易感性
和预后性的筛选指标，也有助于个性化选择药物
治疗。
TP是从雷公藤中分离得到的二萜内酯化合
物，具有强大的抗炎和免疫抑制作用，其主要作用途
径之一就是抑制PBMC的活化与增殖。研究表明雷
公藤多苷可以降低人体血浆内TNF—a水平，雷公
藤单体T4还可以抑制经过l，PS刺激培养的
PBMC在体外产生TNF一一”]。雷公藤在临床用于治
疗类风湿关节炎已经多年，其临床疗效在不同个体
问存在一定的差异。TNF—a作为雷公藤在体内的药
物作用靶标之一，推测其基因多态性可能是导致雷
公藤治疗类风湿性关节炎疗效存在个体差异的重要
原因之一。
通过本实验发现，在脂多糖(I。PS)的刺激下，
A+(G／A，A／A)的健康人PBMC分泌TNF—n的
量明显高于A一(G／G)健康人，这与Louis等的研
究结果是一致的一”]。在给予LPS和TP联合作用
后，发现A+(G／A，A／A)细胞中TNF—a的量与
LPS单独刺激后分泌的量并没有明显差异，相反的
是，在A(G／G)细胞中，联合刺激组较单独刺激组
分泌的量有明显的降低。这说明TP对携带TNF—n一
308G／G基因型组PBMC有明显的抑制作用，而对
TNF—a308非G／G基因型组PBMC可能投有明显
的抑制作用。因此推测雷公藤治疗类风湿性关节炎
疗效个体差异与TNFa一308基因多态性之间存在
关联。由于A+(G／A)在人群中分布频率较低，尤其
是A。。(A／A)，这一结果有待于进一步在较大范围
以及RA病人中进行研究确证。
另外，本实验选择等位基因特异引物PCR
(AsPCR)方法来检测TNF—a一308位点的基因多
态性，该方法主要用于检测已知的基因位点改变。在
TNF—a一308位点的两种不同基因型的引物链序列3
末端分别采用G和A，使得TNFl中的G在TNF2
正链序列的3末端A不能退火，同样的TNF2中的
A在TNFl正链序列的3末端G不能退火，这种差
别决定了不同基因型在扩增过程的特异性，当两种
不同基因型引物PCR均阳性时，则判断为杂合型，
无需PCR后的操作。本实验结果显示：等位基因特
异引物PCR(AS—PCR)方法能有效地检测TNF—
a一308位点的基因多态性，内对照引物的同时扩增，
确保了PCR反应的可靠性。本方法较常规PCR
RFLP方法简单、节省，而且不受限制性内切酶消化
不完全的影响，造成结果的误判。
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrngs第37卷第4期2006年4月·571·
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硕苞蔷薇漆黄素对高铁引起大鼠心肌损伤的保护作用
冯星1，许东晖2，梅雪婷2，许实波2
(1．湖南师范大学医学院．湖南长沙410006l2．中山大学药学院，广东广州 510275)
摘要：目的研究从硕苞蔷薇叶醇提取物中分离得到的漆黄紊对高铁引起的大鼠心肌损伤的保护作用。方法
采用Langendorff灌流心脏为实验模型，研究羟基喹啉铁复合物(FeHQ)对心肌的损伤作用，以及漆黄索对心肌
损伤的保护作用。结果漆黄素可以抑制由高铁引起的离体大鼠心脏左室收缩压(LVSP)、左室舒张来期压
(LVEDP)的升高和冠脉流量(CBF)、心率(HR)的下降}漆黄素使冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶
(cK)释放量和心肌中的MDA水平降低。结论凄黄素对铁超载引起的大鼠心肌损伤有保护作用。
关蕾词：硕苞蔷蔽；漆黄素；铁超载
中圈分类号：R286．2 文蘸标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)04一0571一04
ProtectiveeffectoffisetinfromRosabracteataonmyocardialinjuryinducedbyhighiron
FENGXing‘，XUDonghui2，MEIXue—rin92，XUShib02
(1．MedicalCol egeofHunanNormalUniversity，Changsha410006，China；2．CollegeofPharmac uticalSciences。
SunYet—sanU iversity，Guangzhou510275，China)
Keywords：RosabracteataWendl．tfisetin；ironoverloaded
硕苞蔷薇RosabracleataWendl．为蔷薇科蔷薇
属植物。常绿灌木，广泛分布于华中和华南地区。其根
可入药，具有祛风活血、通经补肾、涩精补精之功效，
民间用于治疗疝气、梦遗滑精、子宫下垂、久褐等。从
其叶的醇提物中提取到漆黄素。本实验采用Langen—
dorff灌流心脏为实验模型，研究羟基喹啉铁复合物
基t＆盒a项BM耳：：2国。家06自06然1科8学基金谋题(3。1701。s)；，。客省科拄计划(c3。4∞)
作者简介。曩1：号：；臻了86h52男21’6湖南E长ma抄il人：fe’博ng士xin’g长O蹩整荒纛i然Lc产om物的药学研究÷
嘲
亘：
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Ⅲ
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啪
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万方数据
雷公藤甲素对健康人外周血单个核细胞分泌TNF-α的抑制作
用与TNF-α基因多态性的关系
作者： 涂胜豪， 陈红波， 盛冬云， 胡永红， 刘沛霖， TU Sheng-hao， CHEN Hong-bo，
SHENG Dong-yun， HU Yong-hong， LIU Pei-lin
作者单位： 华中科技大学同济医学院附属同济医院,中西医结合科,湖北,武汉,430030
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(4)
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引证文献(2条)
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