全 文 :中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·911·
加,从而抑制了根生长和次生代谢物合成,而NO。一
可以协同作用调节离子吸收,消除NH。+对细胞的
毒害作用[7]。氮源对次生代谢物合成的影响规律不
如其对不定根生长影响明显,呈折线变化。低比例的
NH。+/NO。一时丹参不定根颜色较红,丹参酮11A的
量较高,培养基颜色也较红,比例为1/4时丹参酮
ⅡA的量最高。NH。+/NO。一为1:1时原儿茶醛的
量最高,其次是1:4,因此NH。+/NO。为1:4培
养效果较好。
3.3磷源:磷是植物组织培养重要的营养因素。但
是国内外学者对磷对细胞生长的作用看法不一。
Amino等认为MS培养基中的磷(1.25mmol/L)抑
制了长春花细胞生长[8]。Katsuhiro等报道指出培养
基中磷源是长春花细胞生长的必需元素,磷源饥饿
时细胞几乎停止生长,磷源浓度加倍对细胞生长没
有太多的影响,再加大磷源浓度至4倍、8倍,细胞
吸收过量的磷以致生长严重受阻[9]。本实验结果表
明加大或减少磷源浓度均能促进不定根生长。磷源
对次生代谢物的生物合成也起非常重要的作用,不
同植物的次生代谢合成所需磷浓度不同。丹参不定
根培养中过量的磷源抑制了丹参酮ⅡA合成,可能
是由于过量的磷加速不定根内源有机酸的降解口0|,
而一些有机酸比如甲羟戊酸、法尼基二磷酸等是丹
参酮ⅡA合成途径中必需的,原儿茶醛不同的合成
机制使其受磷源浓度变化影响不大。
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不同产地何首乌的ITS序列研究
张宏意1,石祥刚2
(1.广东药学院中药学院,广东广州 510240;2.中山大学生命科学学院,广东广州510275)
摘 要:目的 研究不同产地何首乌的ITS片段遗传差异性,分析该片段在何首乌道地性的DNA分子鉴别和野生
资源品种的鉴定及种质资源研究中的意义。方法从来自不同原产地的何首乌中提取总DNA,以核基因组ITS通
用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果各样品rDNA的ITS及
5.8SrDNA完全序列,18S和26SrDNA部分序列,共约648bp,其中ITSl长度为195bp,5.8S长度为164bp,
ITS2长度为189bp。序列间共有17个变异位点。结论ITS序列可对何首乌的道地性做出鉴别,对野生资源品种
的鉴定具有较好的分辨性。
关键词:何首乌;道地性;ITS序列
中图分类号:R282.7 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2007)06—0911—04
AnalysisofrDNAITSsequencesinroottuberofPolygonummultiflorum
fromvarioushabitats
ZHANGHong—yil,SHIXiang—gan92
(1.SchoolofChineseMateriaMedica,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510240,China;
收稿日期:2006—08—12
万方数据
·912· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6,El
2·SehoolOfLifeScience,SunYat—senU iversity,Guangzhou510275,China)
Abstract:ObjectiveTostudythegeneticd versityofrDNAITSsequencesintheroottuberofPoly—
gonummultiflorumfromvarioushabitatsandtoanalyzethutilityofITSsequencesinmolecularauthenti—
catingthegenuineness,identifyingthevar et esofwildresources,andstudyingthegermplasmresources.
MethodsFirstly,totalDNAintheroottuberofP.multiflorumfromvarioushabitatswaextracted.
Secondly,theITSsequencewasamplifiedbyPCRwithuniversalprimerofITSandsequencedafterpurifi—
cation.ResultsThetotallengthofITSsequenceis648bpinthedifferentsamples,sucha 5.8S,18S,
and26SrDNA.Thelengthsofthreefragments,ITSl,5.8S,andITS2,are195bp,164bp,and189bp,
respectively.Therearesev nteenvariablesitesamongthesequences.ConclusionITSeque cecanbe
usedtoauthenticatethegenuinenessa didentifythevarietiesofwildresourcesintheroottuberofP.
multiflorum.
Keywords:theroottuberofeolygonummultiflorumThunb.;genuineness;ITSsequence
何首乌为蓼科植物何首乌Polygonummulti-
florumThunb.的干燥块根n],系广东著名道地药
材。何首乌作为中药始载于《开宝本草》;宋代的《图
经本草》引《李远附录》谓“⋯以两广所产为佳。”陈仁
山《药物出产辨》记载:“⋯以广东德庆为正。”各地药
材市场上“德庆首乌”的价格远远高于其他产地的首
乌。尽管何首乌在黄河以南各省区均有分布,但是
“德庆首乌”的优良品质已被千百年的用药实践所证
实,其道地药材的地位已为中医药传统所认可。同
时,现代研究也证实了德庆首乌的优越性:(1)有效
成分量高,德庆首乌的蒽醌类[2]、二苯乙烯苷[3]量明
显高于其他产地何首乌。(2)药材生长周期短,德庆
首乌栽培1~2年,而其他产地一般需4~5年。
PCR直接测序法是20世纪90年代迅速发展
起来的测序技术,具有快速、灵敏、准确率高等特点。
其中核糖体DNA中的内转录间隔区(internaltran—
scribedspacer,ITS)序列的进化速率较快,可用于
解决属下不同种和种内的系统发育和分类问题。近
几年,该技术在中药材的鉴别中得到一定的应
用[4~6]。为探讨不同产区何首乌分子生物学方面的
差异,笔者采集了8个不同产区何首乌样品,采用
PCR直接测序技术进行了何首乌rDNAITS区序
列的测定,分析该片段在何首乌道地性的DNA分
子鉴别和野生资源品种的鉴定及种质资源研究中的
意义。
1材料与方法
1.1材料:2004年由广东、广西、四川、贵州、河南、
湖北等地采集何首乌幼苗,经广东药学院房志坚副
教授鉴定,当年移植于广东药学院药用植物园,2005
年12月采集新鲜叶片,用于DNA提取。材料来源
见表1。
表1何首乌来源
Table1 OriginofP.multiflorum
1.2 仪器和试剂:台式高速离心机(Effendorf
5415D),涡旋混合仪(IKAWORKS),梯度PCR扩
增仪(BiometraTg dient),电泳仪(Biorad),凝胶
成像仪(KodakEDAS120),全自动测序仪(Perkin
Elmer377)。
CTAB(Gene),TaqDNA聚合酶(M92+,15
mmol/L)(TaKaRa),琼脂糖(Promega),PCR产物
纯化试剂盒(QIAGEN),10mmol/LdN‘TP
(Sangon)。
1.3 DNA提取:新鲜植物叶片,参照Rodrigues组
织培养表面消毒的[7]方法处理后各0.1g,加液氮研
磨成细粉后,使用改良的CTAB法提取总DNA:8|,
于一20℃保存备用。
1.4 PCR扩增和产物纯化:PCR扩增引物为真核
ITS扩增专用产物LH2、ITS4引物均由上海生工
生物工程有限公司合成,序列为LH2:5-GTCGA—
ATTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA一37:
ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3’。
反应液(以20肛L反应体积为例):10×PCR
buffer2肚L,10mmol/LdNTP0.5vtL,25mmol/L
M92+2.4弘L,10umol/L弓I物LH2、ITS4各1pL,
DMSO1pL,Taq(5U/uL)0.1此,DNA模板(适
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·913·
宜浓度)2肛L,灭菌三蒸水(3dH。O)10pL。PCR扩增
条件为94℃变性4rain,94℃、1min,50。C、2rain,
72℃、1rain,循环30次;72℃延伸10min,以
3dH。O代替模板DNA作空白对照。扩增产物经
1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。用QIAGENPCR
产物纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。
1.5 PCR产物ITS区序列的测定:纯化后的PCR
产物作为测序反应的模板,PCR反应的引物直接作
为测序引物,采用双脱氧终止法(Sangerdideoxy)终
端荧光标记,进行DNA序列的正向和反向测定。
1.6序列数据的处理:应用DNAStar分析软件对
测定的序列进行分析,采用ClustalV法进行8个样
品的序列比较并用Phylip3.6软件绘制ML(最大
似然法)系统树。
2结果和讨论
2.1 何首乌ITS序列的长度和变异:根据Gen—
Bank中的近缘种华蔓首乌Fallopiaforbesii
(Hance)Yonekura&H.Ohashi(Genebank
AF040072)确定rDNA内转录区ITSl和ITS2与3
个编码区18S、5.8S、26S的界限。测得何首乌8个
样品的ITS一1、5.8SrDNA和ITS一2全序列及18S
rRNA基因3’端和26SrRNA基因57端部分碱基序
列,共约648bp(图1),其中ITSl序列长度195bp,
5.8S长164bp,ITS2序列长度为189bp,共有17
个位点发生了变异,其中5个位点为碱基颠换,另外
12个位点为碱基转换。ITSl的变异位点有6个,
ITS2有11个位点,5.8S无变异位点。何首乌ITSl
的(G+C)%量在70.26%~72.31%,ITS2的(G+
C)%量在78.31%~80.95%。
2.2 ITS序列在何首乌道地性药材鉴别中的意义:
表2序列结果发现,8个样品的ITS序列具有一定
的差异性,最大的达到1.7%。广东德庆的2个何首
乌样品ITS序列完全相同。来自广西靖西的何首乌
样品ITS序列与广东德庆的2个样品同源性最高,
达到了99.8%,只有一个碱基的差异。而靖西的何
首乌样品其亲本正是来源于广东德庆。而这3个样
品ITS序列在第191个位点A取代了C,发生了颠
换,这个位点可作为鉴别德庆何首乌道地药材的
ITS的特异位点。说明用ITS序列鉴别何首乌的道
地性是可行的。
2.3 ITS序列在何首乌野生资源品种的鉴定和种
质资源研究的意义:何首乌的ITS序列差异性与其
地理分布有一定的关系,表现出一定的分子地带性
差异。广东德庆、靖西的3个样品先聚在一起。然后
与江西井冈山的样品聚在一起。而来源于河南济源
和湖北恩施的2个样品也先聚在一起,见图1。
从表3看,不同来源的何首乌遗传差异较大。在
8个样品中,其中1~3及5号样品都是野生种,其
他都是栽培种。其中野生种3号四川峨眉山的样品
共有9个位点发生了变异,ITS序列变异最大。因
此,开展何首乌种质资源的种源选择和杂交,选育出
产量高、质量好的优良种源,对何首乌的栽培、开发
和利用将有十分重要的意义。
表2不同产地何首乌ITS序列间的同源性和差异性
Table2 rDNAITSequencehomologyandivergence
ofP.multiflorum
图1何首乌8个居群的rDNAITSML系统树
Fig.1MLDendrogrambasedonrDNAITSsequences
fromeightpopulationsofP.multiflorum
表3何首乌8个居群的ITS特异性鉴别位点
Table3 IdentifyingsitesamongITSsequencesfrom
eightpopulationofP.multiflorum
鉴别位点
No.122
NO.175
No.176
No.185
NO.191
NO。206
NO.417
No.432
NO.457
No.487
NO.500
No.503
No.515
NO.548
No.579
NO.584
NO.587
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·914· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
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AgN03在铁皮石斛组织培养中抗衰老作用
李进进1,廖俊杰¨,许继勇2,麦瑜玲2
(1.广东轻工职业技术学院食品与生物工程系,广东广州 510300;2.汕头市中蔬花卉有限公司,广东汕头,515041)
摘 要:目的 解决铁皮石斛在组织培养过程中的衰老问题。方法 在原球茎增殖培养基、丛芽增殖培养基和生根
培养基中分别加入AgNO。0、1、2mg/L,测定乙烯的产生量,观察试管苗生长情况。结果AgNO。抑制乙烯的产
生,提高了原球茎的增殖速度和丛芽的分化效率,明显促进种苗的生长,提高移栽成活率2倍,表现出抗衰老功能。
结论1mg/LAgNO。可以作为铁皮石斛组织培养的抗衰老剂。
关键词:铁皮石斛;组织培养;AgNO。;抗衰老
中图分类号:R282.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2007)06—0914—04
EffectsofAgN03OHcaducity—resistantfromtissuecultureofDedrobiumofficinale
LIJin—jinl,LIAOJun—jie1,XUji—yon92,MAIYu—lin92
(1.DepartmentofFoodandBio—technolgy,GuangdongIndustryTech icalCol ege,Guangzhou510300,China;
2.ShantouZhongshuFlowerCo.,Ltd.,Shantou515041,China)
Abstract:ObjectiveTosolvethecaducityquestionofDendrobiumofficinaleduringthetissue—eul—
tureprocess.MethodsAddedthedifferentco centrationof0.1and2mg/LAgN03intothePLBprolif—
erationmedium,budsproliferationmedium,androotingmediumseparately.Thequantityof hethylene
productionwastobedeterminedandthesituationofthetubeseedlinggrowthwastobeobserved.Results
AgN03cansuppresstheproductionofthethylene,enhancethemultiplicationspeedofPLBandsplit—up
efficiencythe lumpofbud,andobviouslypromotetheseedlin97Sgrowth.Itshowedthatthesurvivalratio
oftransplantcouldenhanceasmanyastwotimesandisplaythemeritofcaducity—resistant.Conclusion
AgN03(1mg/L)canbetakenasthecaducity—resistantreageofD.officinaleduringthetissue—culture
processing.
Keywords:DendrobiumofficinaleKi uraetMigo;tissue—culture;AgN03;caducity—resistant
铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraet
Migo是一种名贵的中药材,由于野生资源的缺乏,
只能通过人工培养满足药材市场的需要。近年来对
铁皮石斛种苗组织培养技术的研究较多,然而能够
理想地运用于生产的实例却不多,关键是不能规模
生产出符合要求的试管种苗,下地移栽成活率低,种
收稿日期:2006—08—14
基金项目:广东省2005年科技资助项目[粤辩计字(2005)193号]}汕头市2005年科技资助项目[汕市财文(2005)219号]
作者简介:李进进(1964~),女,湖南湘潭人,高级农艺师,主要从事组织培养技术研究。
*通讯作者廖俊杰E—mail:juniie33@gdqy.edu.en
万方数据
不同产地何首乌的ITS序列研究
作者: 张宏意, 石祥刚, ZHANG Hong-yi, SHI Xiang-gang
作者单位: 张宏意,ZHANG Hong-yi(广东药学院中药学院,广东,广州,510240), 石祥刚,SHI Xiang-
gang(中山大学生命科学学院,广东,广州,510275)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2007,38(6)
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