全 文 :中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月·1017·
3讨论
各大孑L吸附树脂对肿节风总黄酮的最大吸附能
力差别不大,但各树脂在不同溶剂中的解吸性能却
有很大差异。HPD400树脂表现出较好的解吸性能,
其吸附、分离肿节风总黄酮的工艺条件为:肿节风总
黄酮上样质量浓度为10mg/mL,肿节风总黄酮最
大吸附量为9.5mg/mL,吸附体积流量为2.5mL/
min,洗脱剂为70%乙醇,洗脱剂用量为3倍柱体
积,树脂可重复使用3次。在此条件下,用HPD400
大孔吸附树脂吸附分离肿节风总黄酮,总黄酮回收
率为85%左右。
树脂对化学成分的吸附及解吸研究,目前文献
报道的有动态吸附法和静态吸附法。动态吸附法筛
选大孔吸附树脂工作量大,静态吸附法则相对工作
量小。本实验采用静态吸附法筛选适合目标分离的
大孔吸附树脂,其结果是否与动态法相一致,还有待
进一步研究。
影响树脂吸附分离中药化学成分的因素很多。
目前,大孑L吸附树脂分离纯化中药中的化学成分还
有许多问题尚未解决,如工艺条件研究的规范性方
法和技术要求等[4]。在实际应用中,只有综合考虑各
种因素,才能确定树脂的型号及最佳吸附分离条件。
本文报道的实验结果是在实验室条件下获得,可为
肿节风总黄酮的提取分离提供实验方法,为大孔吸
附树脂在大生产中的应用提供技术参数。
References:
[1]MaZS.Thestudyandapplicationofmacroporousadsor—
ptiver sinsinpharmacyEJ].ChinTraditPatMed(中成药),
1997,19(12):40—41.
E23WangBY.Theurgentspreadingh ghtechnologyofChinese
traditionpharmacyinChinaEJ].WorldSciTecht ModTradit
ChinMed(世界科学技术:中医药现代化),2000,2(2):18—
23.
[3]WangDQ.LiXC.Studiesontotalflavonoidsfromroot,
stem.andleafofGlabrousSarcandra(Sarcandraglabra)
[J].ChinTraditHerbDrugs(中草药),1996,27(6):337—
338.
[4]HouCx,TianHK.Theapplicationofmacroporousads —
rptionresinseparationandpurificationofthecompound
ChinesetraditiondrugEJ].TraditCh nDrugResClin
Pharmacol(中药新药与临床药理),2000,11(3):13l一133.
制备色谱系统从岩黄连中分离岩黄连碱
蒋伟哲,莫长林,黄兴振,凌玲
(广西医科大学第一附属医院新药研究开发中心,广西南宁 530021)
摘要:目的采用制备色谱系统从岩黄连中分离纯化其活性单体岩黄连碱,建立其纯化工艺和技术。方法用
醇一酸水一氯仿的方法从岩黄连中提取出总生物碱,然后采用制备色谱系统AKTAExplorer100从中分离出岩黄连
碱。结果产品经HPLC检测质量分数达99o//oo以上。结论该方法先进,重复性好,可用于分离纯化岩黄连碱。
关键词:岩黄连;岩黄连碱;制备色谱;AKTAExplorer100
中图分类号:R286.02 文献标识码:B 文章编号:0253—2670(2006)07—1017一03
SeparationofdehydrocavidinefromCorydalissaxicolabypreparativechromatography
JIANGWei—zhe,MOChang—lin,HUANGXing—zhen,LINGLing
(CenterofDrugResearchandDevelopment,TheFirstAffiliatedHospital,
GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)
Keywords:CorydalissaxicolaBunting;dehydrocavidine;preparativechromatography;AKTA
Explorer100
岩黄连是罂粟科紫堇属植物石生黄堇
CorydalissaxicolaBunting的全草,产于广西、贵
州、西藏、湖北、甘肃等地,具有清热、消肿、止痛等作
用。广西民间将其全草用于消肿、止痛、拨毒、治疗疥
疮肿毒,也用于治疗肝炎,肝硬化等疾病Ⅲ。岩黄连
的有效部位为总生物碱。用其总生物碱注射液对
收稿日期:2005—10—15
基金项目:广西科技厅科技攻关项目(桂科攻032204—5G) ⋯
作者简介:蒋伟哲(1968),男,广西宜州人,副主任药师,副教授,硕士生导师,1991年同济医科大学药学院毕业,从事天然药物、药物
化学研究和新药开发。现承担和参加15项国家和广西省级科研课题,获得2000年度广西壮族自治区科技进步奖三等奖1
项,2005年广西医药卫生适宜技术推广奖一等奖1项,已发表研究论文40篇。
Tel:(0771)5355725E—mail:jiangweizhe6812@yahoo.com.en
万方数据
·1018· 中摹菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月
100例肝炎病例观察,发现总的有效达76.5%[2]。其
总生物碱成分包括卡维丁、消旋岩黄连碱、岩黄连
碱、(+)四氢巴马汀等。对其单体进行的药理作用研
究表明,其主要活性成分为岩黄连碱脱氢卡维汀
(dehydrocavidine),其对金黄色葡萄球菌、乙型溶血
性链球菌、白喉杆菌有抑制作用,对耐青霉素的白色
和金黄色葡萄球菌亦有抑制作用,并有一定的镇静、
止痛作用¨]。
由于岩黄连中生物碱多为性质相近的异喹啉类
生物碱,相对分子质量相差不大,因此对于单体的分
离具有很大的难度。采用传统的分离纯化方法,难以
获得高纯度的单体,本研究运用制备色谱系统
AKTAExplorer100,根据目标产物岩黄连碱的性
质特点,优化色谱条件进行分离纯化,并采用HPLC
进行纯度测定,证实可获得高纯度的岩黄连碱,相比
其他的方法更先进、可靠,适用于工业推广。
1材料和仪器
岩黄连干燥全草由广西河丰药业有限公司提
供,经广西食品药品检验所中药室黄捷副主任药师
鉴定;岩黄连碱对照(中国药品生物制品检定所,批
号111651~200301);乙腈(色谱纯);高纯水。所有溶
剂配制后,均用超声溶解,脱气15rain,并在0.45
肛m微孔过滤器中滤过。
制备色谱系统AKTAExplorer100(安玛西亚
公司);Agilent1100液相色谱系统(德国安捷伦科
技有限公司);旋转蒸发仪(上海申生仪器厂)。
SartoriusME215S电子天平(北京赛多丽斯仪器系
统有限公司);AS5150A超声波仪器(天津奥特比赛
恩斯有限公司);oL一5000B一Ⅱ飞鸽离心机(上海
安亭科学仪器厂制造)。
2实验方法
2.1粗品的制备:将岩黄连药材洗净晒干,粉碎成
粗粉,称取岩黄连粗粉10kg,用5倍量90%乙醇浸
渍24h,回流提取,连续4次,每次1h,合并提取液,
减压回收乙醇并浓缩至相对密度为0.92~1.02(60
℃)的清膏,放冷,滤过,滤液浓缩至相对密度为
1.16~1.20(60℃)的稠膏。于稠膏中加入适量蒸
馏水,用10%盐酸溶液,调节pH值2~3,搅拌充
分,滤过,用10%盐酸溶液洗4~5次,合并酸水液,
用碳酸钠调节pH值9~10,析出棕褐色沉淀,滤过,
滤渣用5倍氯仿提取5~6次,合并氯仿液,加无水
硫酸钠脱水,滤过,回收氯仿至近干,再加少量乙醇,
减压回收溶剂,干燥,即得岩黄连总碱粗品。
2.2样品预处理:称岩黄连总碱粗品约4g,用流动
相溶解并定容至100mL,超声20min,超速离心5
min(5000r/min),取上清液,用0.45肛m微孔滤膜
滤过,所得的粗品用于分离纯化使用。
2.3 岩黄连碱的分离和纯化:色谱条件:色谱柱
(600mm×16mm,以安玛西亚的SoURCE30
RPC为柱填充料),流动相为0.2mol/LNa2HPO。
(pH8.5)一乙腈,梯度洗脱(前40rain乙腈比例由
lo%升至40%,40rain之后为50%),体积流量为3
mL/min,紫外检测波长为347nm。
进样方式:样品泵P一960自动进样,样品环定
量;收集器:Prac一900自动收集器;上样量:2mL。
收集方式:运用Prac一900进行峰收集。方式为
UVSlope,UVStartslope100mAu/min,UVEnd
slope75mAu/min。MininumPeakWidth1.0
min。分离的图谱见图1。
I 收集峰,、
\
f、
\
\~J
50 6030 40
,/mln
图1岩黄连总碱租品的分离图谱
Fig.1PreparativeHPLCchromatogramofcrude
pruductofC.saxicolat talkaloids
2.4样品的去盐处理:把所收集的样品浓缩以后再
次过柱,通过PharmadexG一20的色谱柱,上样量为
2mL,然后以3mL/min的水为流动相冲柱子约3
个柱体积以除去混在样品中的盐,然后用甲醇把样
品洗脱下来并进行收集。经旋转蒸发仪浓缩,浓缩液
冷冻干燥后,可以得到淡黄色粉末。
3岩黄连碱薄层色谱定性鉴别
取20cm×5am的玻璃板,硅胶G(加以0.5%
的羧甲基纤维素钠为黏合剂)制板活化备用,展开剂
为醋酸乙脂一氯仿一甲醇一浓氨(10:2:2:2),点样
量约为2弘L,展开,取出晾干,置紫外灯(365nm)下
检视,得薄层色谱图,见图2。可以看出:在这个收集
峰样品和对照品相应位置上,显相同颜色荧光斑点,
说明所收集峰的样品里面含有岩黄连碱,初步判断
此收集峰为目标峰。
4 HPLC法对制备的样品进行纯度测定
4.1 色谱条件:色谱柱为日本HiQSilC。。柱(250
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月·1019·
l一对照品
2一收集峰样品
3一总碱
l-xeferencesubstance
2-elutionpeaksample
3一totalkoloids
图2薄层色谱图
Fig.2TLChromatogram
mm×4.6mm,5pm);流动相为乙腈一水(50:50,
含0.34%磷酸二氢钾和0.17%十二烷基硫酸钠);
体积流量为1mL/min;紫外检测波长347nm;柱温
20℃,进样量为20弘L。理论板数按岩黄连碱峰计
算,应不低于6000。
4.2待测液的制备:把制备所得样品,用流动相定
容于100mL量瓶中,超声溶解15min,在0.45弘m
微孔过滤器中滤过,作为待测液。
4.3测定:用外标法测定相应样品纯度,平行测定
5次并取平均值,结果岩黄碱的保留时间为11.968
min,理论塔板数为21055,质量分数为99.17%,见
图3。可以看出,通过对制备色谱系统AKTA
Explorer100的色谱条件优化,从岩黄连粗品中可
分离出岩黄连碱,HPLC纯度测定结果表明其质量
分数达到了99%以上,该方法适用于分离纯化岩黄
连碱单体,为工业生产提供了有利的依据。
0 2 4 68 101214 0 5 10 15 20 02 468 101214
f/min
*一岩黄连碱
*一dehydrocavidine
图3对照品(A)、粗品(B)和纯化品(C)的HPLC色谱图
Fig.3HPLCChromatogramsfreference
substance(A),crudeproduct(B),
andpurifiedsamples(C)
5讨论
本实验的探索所用的技术是依托于制备色谱系
统AKTAExplorer100,采用的是SOURCE
30RPC为填充剂,即反向技术。分离生物碱一般都
使用的阳离子交换树脂,但是运用阳离子交换树脂
进行分离的时候,因为岩黄连中生物碱多为性质相
近的异喹啉类生物碱,而且均为季胺类的生物碱,极
性很大,也很接近,较难洗脱下来,而且其梯度洗脱
操作较为麻烦,不利于工业生产。而本法具有简便、
快捷、周期短、自动化程度高、收集全面等优点,而且
样品纯度高,适合工业的推广。
在实验条件的探索中发现当体积流量增大的时
候,岩黄连碱的保留时间会降低,但是分离度也随之
降低,而且压力很大;减小体积流量后虽然分得开但
是峰变宽保留时间变长,因此选择了3mL/min的
体积流量既使保留时间缩短又能达到良好的分离
度。同样在上样量一定的情况下,上样体积的增加使
分辨率逐渐降低,峰扩散;当上样体积大于2mL
后,峰就开始不对称了,所以上样体积定在2mL。
对于梯度洗脱,根据制备色谱系统AKTA
Explorer100本身具有的条件优化功能,经过多次
实验的优化,决定采用前40min乙腈比例由10%
升至40%,40min之后为50%,是由于岩黄连碱在
流动相的pH条件下的极性较小,考虑到系统的平
衡时间所以采取较为缓和的梯度。当梯度拉得太快
的时候分离度也随之减小。而且在除盐的选择上采
用的是葡聚糖凝胶的方法,比离子交换法除盐更为
简便。AKTAExplorer100先进的柱切换技术使之
更容易操作。用安玛西亚的制备色谱系统AKTA
Explorer100进行中药的分离和纯化,具有简便、快
捷、周期短、自动化程度高、收集全面等优点。除此之
外还可以连接网络,进行远程的控制,对于科研和生
产都具有重要的意义。
References:
[1]HuangFN,LiuGX,ZhangXD.Preliminaryobse vations
onanti—inflammatoryanalgesicactivitiesandcholagogicaction
ofCorydalissaxicolaBuntingtotalkaloidsFJ].ActaAcad
MedZunyi(遵义医学院学报),1981,4(2):22—25.
[2]KeMM,ZhangXD,WuLZ,eta1.Studiesonactive
principlesofCorydalissaxicolaBuntingFJ].ActaBotSin(植
物学报),1982,24(3):289—291.
[3]HuangXN,LiuGx,ZhangY.Tranquillizingeffectsof otal
alkaloidsfromCorydalissaxicola[J].ActaPharmSin(中国
药理学报),198l,Z(3):156—159.
止
万方数据
制备色谱系统从岩黄连中分离岩黄连碱
作者: 蒋伟哲, 莫长林, 黄兴振, 凌玲, JIANG Wei-zhe, MO Chang-lin, HUANG Xing-zhen
, LING Ling
作者单位: 广西医科大学第一附属医院,新药研究开发中心,广西,南宁,530021
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2006,37(7)
被引用次数: 2次
参考文献(3条)
1.Huang F N;Liu G X;Zhang X D Preliminary observations on anti-inflammatory analgesic activities and
cholagogic action of Corydalis saxicola Bunting total alkaloids 1981(02)
2.Ke M M;Zhang X D;Wu L Z Studies on active principles of Corydalis saxicola Bunting 1982(03)
3.Huang X N;Liu G X;Zhang Y Tranquillizing effects of total alkaloids from Corydalis saxicola
1981(03)
本文读者也读过(10条)
1. 汪维云.焦晴晴 制备色谱纯化何首乌活性成分二苯乙烯苷[会议论文]-2009
2. 黄其春.涂文升.龙俊青.蒋满州.王耿.Huang Qichun.Tu Wensheng.Long Junqing.Jiang Manzhou.Wang Geng 广
西各地岩黄连药材中脱氢卡维丁含量考察[期刊论文]-中国药业2009,18(23)
3. 李斐.王晓娟.孙晓莉.黄永刚.王荣.常晓亮 高效液相色谱分离纯化九节龙皂苷I[期刊论文]-中草药2008,39(8)
4. 郭子媛.张振宾.章伟光.林然.陈雷奇.王越奎.章慧.夏海平 高效液相制备色谱对钌苯-半胱氨酸异构体的分离
[会议论文]-2009
5. 王静.陆兔林.毛春芹.胡芳.黄玮.WANG Jing.LU Tu-lin.MAO Chun-qin.HU Fang.HUANG Wei 岩黄连药材的提取
工艺研究[期刊论文]-医药导报2010,29(3)
6. 王传金.魏运洋.吕晶.杜杨艳.WANG Chuan-jin.WEI Yun-yang.L(U) Jing.DU Yang-yan 制备型高效液相色谱法
分离冬凌草中冬凌草甲素[期刊论文]-精细化工2007,24(7)
7. 张世东.王建建.王霞.高丽娟.Zhang Shidong.Wang Jianjian.Wang Xia.Gao Lijuan 玉米须单体成分纯化及类
别鉴定[期刊论文]-福建分析测试2007,16(3)
8. 马雁鸣.赵芸.吴韬.斯拉甫.廖立新.阿吉艾克拜尔·艾萨.MA Yan-ming.ZHAO Yun.WU Tao.Sirapil.LIAO Li-xin
.Haji Akbar Aisha 高效液相制备色谱制备一枝蒿酮酸对照品[期刊论文]-中草药2005,36(7)
9. 王瑜.薛敏.孟子晖.张维冰 莽草酸分子印迹聚合物的制备及其低压制备色谱研究[会议论文]-2010
10. 刘建福.李素芬.陈占洲.陈庆森.王璋.LIU Jian-fu.LI Su-fen.CHEN Zhan-zhou.CHEN Qing-sen.WANG Zhang
中压液相色谱快速分离纯化Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶[期刊论文]-食品与生物技术学报
2007,26(1)
引证文献(2条)
1.黄茂春.谢丽莎.李娉 岩黄连化学成分分析及临床应用研究进展[期刊论文]-中国民族民间医药 2010(9)
2.于京.王晶.刘春明.刘志强 山竹果皮中两种杂氧蒽酮化学成分的分析研究[期刊论文]-分析测试学报 2012(1)
本文链接:http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200607022.aspx