全 文 :中草药ChineseTraditionalandHerbalDrags第37卷第2期2006年2月·229·
表4四物汤、单双糖混合液和部位C2—1、C2对辐射小鼠
骨髓造血祖细胞增殖的影响(工士s,一一3)
Table4 EffectsofSi-Wu-Tang,monosaccharideand
disaccharidemixture,fractionsC2一landC2
onbonemarrowprogenitorcellproliferation
inirradiatedmice(;士s,露一3)
造血祖细胞集落数/(个·10_5骨髓造血祖细胞)组别——
CFU—GMCFU—E BFU—E CFU—MIX
与模型组比较:。P
作用,而部位C1作用不显著;部位C2和C3均以
单、双糖为主要成分,部位C1含有种类丰富的成分
而糖类极少,部位C1和C2均含有芍药苷;芍药苷
单体具有促进骨髓造血祖细胞增殖的作用,为四物
汤促进造血功能的活性成分之一。本研究用大孔吸
附树脂将部位C2分离为水洗脱部分(部位C2—1,
以糖类为主)和80%乙醇洗脱部分(部位C2—2,以
脂溶性相对较高的苷类等为主),结果表明,两个部
位均有一定促进辐射小鼠造血功能的作用,提示糖
类可能具有活性。为了进一步确证,按照部位C2中
主要糖类物质的组成和质量分数,将D一果糖、D一葡
萄糖和蔗糖混合,结果显示仍具有一定的促进辐射
小鼠骨髓造血祖细胞增殖的作用,表明单、双糖类对
四物汤促进造血功能的作用确有一定的贡献。虽然
单、双糖类是植物中常见的成分,其改善小鼠造血功
能的机制不排除可能与提供营养有关,但此结果在
一定意义上提示了中药作用机制的特殊性和复杂
性,有待进一步研究。
3.2从活性考察结果还可看出,部位C2—1提高辐
射小鼠外周血白细胞和促进骨髓造血祖细胞增殖的
作用均显著,而混合糖仅促进骨髓造血祖细胞增殖
的作用显著。这可能与大孔吸附树脂仅能实现粗分
离,部位C2—1中还含有微量的单、双糖以外的其他
活性物质,因而作用更强有关。
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三七皂苷Rg。对大鼠脑缺血一再灌注损伤的保护作用及机制探讨
吴兰鸥,詹合琴,闫俊岭,蔡文锋,吴进平,杨克红
(昆明医学院药理学教研室,云南昆明 650031)
摘要:目的探讨三七皂苷Rg。对局灶性脑缺血一再灌注损伤大鼠大脑皮质中脑源性神经营养因子(BDNF)阳
性蛋白的水平和阳性神经元数目是否具有上调作用。方法选取成年雄性SD大鼠60只,随机分为脑缺血一再灌注
模型组、三七皂苷Rg。高、中、低剂量(200、100、50mg/kg)组和阳性对照(尼莫地乎,1mg/kg)组,采用线栓法制
作大鼠局灶性脑缺血一再灌注模型,各组ig给药并分别于给药后1、3、7d随机取4只大鼠,以灌注法取脑组织,冰
冻法切片,免疫组织化学ABC法染色,用高清晰度彩色病理图文报告分析系统测量、分析各组大鼠大脑皮质中
BDNF阳性蛋白的水平和阳性神经元数目的变化,并观察大鼠脑缺血一再灌注后的神经功能缺失症状。结果与模
型组相比,三七皂苷Rg。高、中、低剂量均能明显改善脑缺血一再灌注的神经功能缺失症状,并能上调大鼠脑缺血一再
灌注损伤的大脑皮质中BDNF阳性蛋白的水平和阳性神经元数量(.P
收稿日期:2005—05—09
基金项目:云南省自然科学基金项目(2002C0051m)
作者简介:吴兰鸥(1959一),女,浙江湖州人,药理学硕士,教授,硕士生导师,现为昆明医学院基础医学院药理学教研室主任,主要从事
心脑血管药物药理及毒理学研究。Tel:(0871)5338954E—mail:lanouwu@126.corn
万方数据
·230· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2,El
用,从而发挥其对脑缺血的治疗作用。
关键词:三七皂苷Rg。;脑缺血一再灌注;脑源性神经营养因子(BDNF)
中图分类号:R286.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)02—0229—05
Protectionandmechanismofnotoginsenoside-R91nfocalcerebral
ischemia..reperfusionrats
WULan—OU,ZHANHe—qin,YANJun—ling,CAIWen—feng,WUJin—ping,YANGKe—hong
(DepartmentofPharmacology,KunmingMedicalCollege,Kunming650031,China)
Abstract:ObjectiveToexploreth ffectsofnotoginsenoside—Rglonbrain—derivedneurotrophicfac—
tor(BDNF)proteinincerebrumcortexofMCAO/Rinjury,aswellastoinvestigatewhethernotogin—
senoside—R91CaD_up—regulatetheproteinco tentofBDNFofthepositiveneuronsrtheamountofthepo—
sitiven urons.MethodsAdultmaleSDrats(60)wererandomlydividedintomodelgroup,notogin—
senoside—R91high,middle,andowdose(200,100,50mg/kg)groups,andthepositivecontrol(Ni—
modipine,1mg/kg)group.Alldrugsweregiveno cea daybyiptillthemousewaskilled.Thefocal
cerebralischemia—reperfusionmodelwasmadewiththread—occludedmethod.Theirfrozenb aintissue
wereslicedintosectionof12弘mthickness.ThefourratswererandomlytakenfromeachgroupstObe
treatedasspecimensaftersurgicalh ndlein1,3,and7 .Thesliceswereaccordingtotheimmunohis—
tochemicalABCtechniques.Theproteinco tentofBDNFofthepositiveneuronsa dtheamountof he
positiveneuronsi cerebrumcortexofratwereobservedandcountedbyHPIAS一1000analyticsystem,
andthenervousdeficitsymptomsafterthecerebralischemiawereobserved.ResultsComparingw ththe
modelgroup,annotoginsenoside—R91treatedgroupsobviouslyimprovedsomenervousdeficitsymptomsof
cerebralischemia—reperfusionrats,andi creasedthproteinco tentofBDNFandtheamountoftheposi—
tiveneuronsi thecerebrumcortexofmodelrats(P<0.05).Indifferentgroups,theeffectofnotogin—
senoside—R91wasuperiortOthatofNimodipineorequatedOit.ConclusionNotoginsenoside—R91could
up—regulatethexpressionofBDNFandincreasethamountofpositiveneuronsi cerebrumcortex.It
treatedc rebralischemiabyt protectionofBDNFonneuronsi juryinthefocalcerebralischemia—reper—
fusion,whichcanbeoneofthemechanismoftheprotectionofn toginsenoside—R91onfocalcerebral
ischemiareperfusioninjury。
Keywords:notoginsenoside—Rgl;cerebralischemia—reperfusion;brain—derivedneurotrophicfactor
(BDNF)
随着人口老龄化程度的加剧,脑血管疾病已成
为一个备受社会关注的问题。据世界卫生组织调查
表明,脑血管意外引起的死亡率占所调查的57个国
家死亡总人数的11.3%,仅次于癌症和心肌梗死。
脑缺血是脑血管疾病最主要的病种,在我国,其死亡
率仅次于恶性肿瘤,严重危害人类的健康[1]。现代药
理研究证实,三七总皂苷对多种动物脑缺血及再灌
注损伤有良好的保护作用,其作用机制与钙离子拮
抗及抗自由基等作用有关,同时三七总皂苷还具有
降低血黏度、抑制血小板聚集、扩张血管、降低血脂、
改善学习和记忆功能以及改善微循环和抗炎等作
用[2’3]。此外,研究还发现,三七皂苷Rg,能增加脑内
蛋白质的合成[4],但有关三七皂苷Rg。对脑缺血保
护的机制研究,特别是在细胞及分子水平上探讨三
七皂苷Rg。对脑缺血的保护机制尚未见相关文献报
道。本实验从三七皂苷Rg。对脑缺血一再灌注损伤大
鼠大脑皮质中脑源性神经营养因子(brain—derived
neurotrophicfactor,BDNF)阳性蛋白的量及其阳
性神经元数目的影响方面,研究三七皂苷Rg,对脑
缺血保护的作用机制,旨在为三七系列产品治疗中
枢神经系统疾患,特别是脑缺血疾病提供科学的实
验依据。
1材料与方法
1.1药品及主要试剂:三七皂苷Rg。由昆明制药厂
提供,为白色粉末状(质量分数>95%)。尼莫地平
注射液为山东新华制药股份有限公司生产,批号
0204019,规格2mg/10mL。BDNF多克隆抗体(效
价1:500);ABC试剂盒;浓缩型DAB试剂盒均购
自ZLI一9033北京中山试剂公司。
1.2仪器:血管栓塞线为日本1.5号鱼线;America
AO连续恒冷切片机;Sanyo(---20℃,一60℃)冰
箱;HPIAS一1000高清晰度彩色病理图文分析报告
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月·231·
系统。
1.3实验动物与分组:成年雄性SD大鼠60只,体
重280320g,由昆明医学院动物科提供(合格证:
滇实动证字2001035号)。缺血2h,造模成功动物
随机分为缺血一再灌注模型组(生理盐水,5mL/
kg)、缺血一再灌注三七皂苷Rg。高、中、低剂量
(200、100、50mg/kg)组和缺血一再灌注阳性对照组
(尼莫地平,1mg/kg)。
1.4 大脑中动脉脑缺血(MCAO)模型的制作和
术后处理:参考ZeaLonga等[5]报道的方法,加以改
进,大鼠以10%水合氯醛(300mg/kg)ip麻醉,制
成右侧MCAO模型。大鼠在手术后约0.5h清醒,
观察其神经功能缺失症状,并进行评分。以动物清醒
后爬行时向左转圈(追尾现象),严重时向左跌倒,提
尾时左前肢内收屈曲为造模成功标准。缺血2h后
再灌注,各组经ip给药,每天1次,分别于给药1、
3、7d后每组随机取4只大鼠进行下列实验。
1.5神经功能缺失症状评分方法:采用徐淑云等[63
的评分标准,双盲法进行评分。
1.6脑组织处理及切片:将选取的大鼠用10%水
合氯醛(300mg/kg)ip麻醉后,仰卧固定,经心内
插管至主动脉处,先用500mL生理盐水冲洗15
rain,再用4%多聚甲醛饱和苦味酸心内灌注固定
0.5h,开颅取出脑组织,然后放入4℃冰箱固定
8~12h,入20%蔗糖PBS过夜,使组织块下沉。在
脑组织的前囟及前囟后4mm处依冠状方向切成3
部分,取中间一部分制备冰冻切片。组织块经液氮处
理1rain,用恒冷切片机进行连续冠状切片,片厚12
肚m,每组每例间隔取4张切片,贴片后保存于
一20℃冰箱内备用。
1.7 BDNF免疫组织化学染色:采用ABC法[7]进
行BDNF的免疫组织化学染色,并设立3种对照实
验。阳性对照实验:以已知阳性组织切片做阳性对
照;空白对照实验:用0.05mol/LPBS代替一抗,
其余步骤不变;置换实验:用正常羊血清代替一抗同
样进行免疫组织化学染色。
1.8 图像分析与统计学处理:用HPIAS--1000高
清晰度彩色病理图文报告分析系统进行摄像、分析,
测量各组阳性神经元中BDNF蛋白的灰度值并对
阳性神经元进行计数统计。在每一张脑片的右侧缺
血区皮质部位随机取5个点。实验结果均用,27±s表
示。采用SPSS软件包,进行组间多个样本均数比较
的方差分析和g检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 BDNF阳性蛋白在光镜下的定位:BDNF阳性
蛋白主要定位于细胞浆和细胞膜附近区域,BDNF
免疫阳性细胞主要分布在大脑皮层Ⅲ~V层,胞体
形似棱锥。在光镜下观察到的阳性神经元的胞浆和
突起被染成棕黄色,主干树突和近细胞膜的胞浆处
染色较深,而细胞核周围染色较浅。BDNF阳性蛋白
的量用灰度值表示,即在一个视野内,BDNF阳性蛋
白的灰度与整个视野灰度的比值。灰度值越低,表明
BDNF阳性蛋白水平越高。BDNF阳性神经元数目
越多,BDNF阳性蛋白的量越高。
2.2三七皂苷Rg。对脑缺血一再灌注大鼠神经功能
缺失症状的影响:结果见表1。用药3和7d时,三
七皂苷Rg,高、中、低剂量组与模型组比较差异均有
显著性(P<0.05),阳性对照组与模型组比较差异
显著(P
组与高剂量组相比差异显著(P
0.05),Rg。中、低剂量组给药7d与3d比较差异显
著(P
大鼠脑缺血一再灌注损伤所致的神经功能缺失症状,
且三七皂苷Rg。(中、低剂量)的作用优于尼莫地平
的作用。三七皂苷Rg,的用药时间越长,对大鼠脑缺
血一再灌注损伤所致的神经功能缺失症状的改善越
明显,并且三七皂苷Rg。中、低剂量的改善效果
较佳。
表1三七皂苷Rg。对脑缺血一再灌注大鼠神经功能
缺失症状的影响(;±s,一一4)
Table1 EffectofnotOginsenOside—Rglonnervous
functiondeficitsymptomsincerebral
ischemia—reperfusionrats(;士s,n=4)
组别
扣1tt/ 神经功能缺失症状评分
(mg·kg一1).1d 3d 7d
与模型组比较:‘P<0.05;与尼莫地平组比较:△P<0.05;
Rgl各组问比较:Ap<0.05;各组给药7、3d与1d比较:4P<
0.05,各组给药7d与3d比较:Op<0.05;下表同
’P<0.05wmodelgroup;aP<0.05wNimodipinegroup‘
▲P<0.05oneRglgroupwanotherRglgroup;4P<0.05treated
for3and7dofeachgroupwtreatedfor1dof achgroup;Ip<
0.05treatedfor7dofeachgroup口5treatedfor3dofeachgroup;
followingtablesaresame
万方数据
·232· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月
2.3 三七皂苷Rg。对脑缺血一再灌注大鼠大脑皮质
中BDNF蛋白水平的影响:结果见表2。用药1、3、7
d时,Rg。高、中、低剂量组与模型组和阳性对照组比
较差异均显著(P
时,Rg。中、低剂量组与高剂量组比较差异显著
(P
三七皂苷Rg。低剂量的效果较佳,随着用药时间的
延长,三七皂苷Rg。中剂量的上调作用也逐渐强于
三七皂苷Rg。高剂量,而同一剂量的三七皂苷Rg。
的上调作用在用药时间上没有明显差异。但尼莫地
平不能上调大鼠大脑皮质中BDNF蛋白水平。
表2三七皂苷Rg。对脑缺血一再灌注大鼠大脑皮质中
BDNF蛋白水平的影响(;土s,辟一4)
Table2 EffectofnOtoginsenOside—Rglonproteinco tent
0fBDNFincerebrumcortexofcerebral
ischemia—reperfusionrats(;士s,露一4)
组别
剂量/ BDNF蛋白的灰度值(比值)
(mg·kg一1)1d 3d 7d
2.4三七皂苷Rg。对脑缺血一再灌注大鼠大脑皮质
BDNF阳性神经元数目的影响:结果见表3。用药1
d时,Rg。中剂量组与模型组比较差异显著(P<
0.05);用药3、7d时,Rg,高、中、低剂量组与模型组
比较差异均显著(P
显著(P
7d时,阳性对照组与模型组比较差异显著(P<
表3三七皂苷Rg。对脑缺血一再灌注大鼠大脑皮质中
BDNF阳性神经元数目的影响o±s,矗一4)
Table3 EffectofnOtoginsenoside—Rglonpositiveneurons
amountofBDNFincerebrumcortexofcerebral
ischemia—reperfusionrats(;土s,一一4)
组别
剂量/ BDNF阳性神经元数目/(个·视野-1)
(mg·kg一1)1d 3d 7d
0.05)。结果提示:三七皂苷Rg。高、中、低剂量和尼
莫地平均能上调脑缺血一再灌注大鼠大脑皮质中
BDNF阳性神经元数目,且三七皂苷Rg。和尼莫地
平的上调作用没有差异。从上调结果来看,以三七皂
苷Rg。中剂量的效果较佳,随着用药时间的延长,三
七皂苷Rg。低剂量的上调作用逐渐增强。
3讨论
BDNF主要由脑组织合成,广泛存在于脑内各
组织,以大脑皮质、海马、纹状体分布最为丰富。众多
研究表明,BDNF参与了脑缺血损伤的保护过
程[8~10]。脑缺血损伤后,BDNF及其受体TrkB的表
达水平明显上升,而且BDNF的释放可上调TrkB
受体[1¨。BDNF表达水平高且反应强的区域病理改
变轻,有利于损伤神经元的修复。脑缺血损伤时,
BDNF与其特异性受体TrkB相结合,产生相应的
效应分子而对缺血神经元起保护作用,主要通过以
下机制:①拮抗兴奋性氨基酸毒性,稳定细胞内
Ca2+浓度。BDNF可防止细胞外钙离子的入胞和细
胞内钙的释放,并且可能通过诱导钙结合蛋白的表
达而稳定细胞Ca2+的浓度,减少兴奋性氨基酸及钙
超载引起的损伤[1幻;②拮抗NO介导的细胞毒性,
增强抗氧化酶活性,减轻自由基损伤[1引,从而使神
经元免受损伤;③抑制细胞凋亡、坏死的发生。BD—
NF能通过阻止caspase一3的活性而抑制细胞凋
亡[14|,并通过调节Bcl、Bax蛋白的表达而抑制细胞
凋亡;④阻断NMDA所致的蛋白激酶C(PKC)失
活;⑤修复受损神经元,并促进受损神经元再生。
BDNF是一种作用广泛而有效的神经生长因
子,对多种中枢神经系统损伤及退行性疾病具有较
为理想的治疗潜能,脑缺血后BDNF蛋白表达增加
的脑缺血保护机制,为脑缺血的治疗提供了新途径。
由于血脑屏障的阻碍作用使中枢神经系统疾病的治
疗有别于其他系统疾病的治疗。对于脑神经保护剂
来说,它们能否通过血脑屏障而发挥作用是基础和
临床应用的关键问题。因此,BDNF在过渡到临床应
用之前,要求解决好给药途径和安全给药的问题。
BDNF为蛋白质类物质,不能通过消化道给药。其
次,BDNF为大分子亲水物质,难以透过血脑屏障,
即使鞘内给药,许多营养因子向脑实质内弥散也有
限。这也就是说给予外源性神经营养因子存在着转
运困难的问题。实验中发现,BDNF脑室给药会带来
体重减轻、饮水减少、活动过度等不良反应[1引。
三七是传统名贵中药之一,它除了治疗跌打损
伤的特殊功效外,还有滋补强壮的作用,从而被人们
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月·233·
称为“南方的人参”。研究发现,三七总皂苷及其主要
成分Rg。、Rb。等对脑缺血有一定的保护作用[16|。李
麟仙等[163采用树嗣局部脑缺血模型,研究发现脑缺
血时,大脑皮层顶颞部位钙离子水平明显增加,分别
给予三七皂苷Rb,和Rg。后钙离子水平均减少,其
作用与钙离子拮抗剂尼莫地平相似;三七皂苷Rg。
能巩固长记忆,并且有明显的促进记忆作用,张均田
等Ez6]研究发现三七皂苷Rg。对M一胆碱受体缺乏亲
和力,但给动物ip三七皂苷Rg。连续5d,发现三七
皂苷Rg,能促进中枢M一胆碱受体密度显著增高,还
能明显增加脑内蛋白质合成。这说明了三七的药理
作用是通过对机体功能、代谢乃至分子水平上的调
节而发挥作用的。此外,三七皂苷Rg,能使脑内蛋白
质合成显著增加,这有助于解释它在易化记忆过程
的作用,并为脑缺血的治疗提供了新思路。三七皂苷
Rg。iv给药后,能广泛分布于大鼠各组织,并能透过
血脑屏障,也能进入眼球内。使这些小分子抗脑细胞
凋亡药物具有广阔的应用前景。
本实验结果显示:与模型组比较,三七皂苷Rg。
高、中、低剂量均能明显改善脑缺血所致的神经功能
缺失症状,并能上调大鼠脑缺血一再灌注脑损伤时大
脑皮质的BDNF蛋白水平和阳性神经元数目,以
中、低剂量效果较佳;随着用药时间的延长,其对脑
缺血的保护作用逐渐增强。与阳性对照组比较,在改
善脑缺血的神经功能缺失症状方面,三七皂苷Rg。
中、低剂量的作用优于尼莫地平;在上调大脑皮质的
BDNF蛋白水平方面,作用亦强于尼莫地平,在上调
大脑皮质的BDNF阳性神经元数目方面,作用与尼
莫地平相当。
本研究发现三七皂苷Rg。高、中、低剂量均能显
著增加脑缺血一再灌注后BDNF阳性蛋白的表达和
阳性神经元数目,并通过BDNF对脑缺血一再灌注
神经元损伤所起的保护作用,从而发挥其对脑缺血
的治疗作用,这可能是三七皂苷Rg,对脑缺血保护
作用的机制之一。
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作者: 吴兰鸥, 詹合琴, 闫俊岭, 蔡文锋, 吴进平, 杨克红, WU La-nou, ZHAN He-qin,
YAN Jun-ling, CAI Wen-feng, WU Jin-ping, YANG Ke-hong
作者单位: 昆明医学院药理学教研室,云南,昆明,650031
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
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本文读者也读过(10条)
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引证文献(15条)
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Components in Shuxiong Tablet and Its Possible Formulary Rationality[期刊论文]-中草药(英文版)
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