全 文 ：蝙蝠葛酚性碱对大鼠局灶性脑缺血-再灌注继发炎性损伤的保护作用
张晓娟＊＊ , 郭莲军＊ , 曲　玲 , 吕　青
(华中科技大学 同济医学院 药理学系 , 湖北 武汉 430030)
摘要:目的　研究蝙蝠葛酚性碱对大鼠局灶性脑缺血-再灌注继发炎性损伤的保护作用及其机制。方法　用线
栓法制作大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型 , 缺血 2 h后 , 将线抽出实行再灌注 , 观察蝙蝠葛酚性碱对粘附分子(ICAM-1)
表达 、白细胞的粘附与浸润 、髓过氧化物酶(MPO)活性和一氧化氮(NO)含量的影响。结果　蝙蝠葛酚性碱可明显抑
制 ICAM-1 的表达 ,减轻白细胞的粘附与浸润 ,降低缺血侧大脑皮层和海马组织中的MPO活性和 NO 含量。结论　蝙
蝠葛酚性碱对大鼠局灶性脑缺血-再灌注后的炎性损伤有明显保护作用 ,其机制可能与抑制 ICAM-1 表达 , 减轻白细
胞的粘附与浸润 ,减少 NO产生有关。
关键词:蝙蝠葛酚性碱;脑缺血-再灌注损伤;细胞间粘附分子;髓过氧化物酶;一氧化氮
中图分类号:R282.71;R965　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2004)08-0661-05
Protective effects of phenolic alkaloids from Menispermum dauricum on
inflammatory injury following focal cerebral ischemia-reperfusion in rats
ZHANG Xiao-juan＊＊ , GUO Lian-jun＊ , QU Ling , L Qing
(Department of Pharmacology , Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430030 , China)
Abstract:Aim 　To study the protective effects of phenolic alkaloids from Menispermum dauricum
(PAMd)on inflammatory injury following focal cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods　The right
middle cerebral artery of the rat was occluded by inserting a nylon suture through the internal carotid artery for 2
h , followed by reperfusion by withdrawing the suture.The expression of intercellular adhesion molecule-1
(ICAM-1)was observed by immunohistochemistry staining.The adhesiveness and infiltration of leucocytes were
observed by HE staining.The activity of myeloperoxidase (MPO)and the content of nitric oxide (NO)in the
cortex and hippocampus were measured.Results　PAMd was shown to markedly inhibit ICAM-I expression ,
alleviate the adhesiveness and infiltration of leucocytes , and decrease the MPO activity and the NO content in
ischemic cortex and hippocampus.Conclusion　PAMd has protective effects on inflammatory injury following
focal cerebral ischemia-reperfusion by inhibiting ICAM-I expression , alleviating the adhesiveness and infiltration
of leucocytes and decreasing the generation of NO.
Key words:phenolic alkaloids from Menispermum dauricum ;focal cerebral ischemia-reperfusion;
intercellular adhesion molecule-1;myeloperoxidase;nitric oxide
收稿日期:2003-10-15.
＊通讯作者　Tel:86-27-83691763 ,
E-mail:gljyl@yahoo.com.cn
＊＊现址:广东省人民医院药学部(邮编 510080)
　 　 蝙 蝠 葛 酚 性 碱 (phenolic alkaloids from
Menispermum dauricum ,PAMd)是从防己科植物蝙蝠
葛(Menispermum dauricum DC.)根茎中提取的多种脂
溶性生物碱的混合物。其主要成分为蝙蝠葛碱
(dauricine , Dau)和蝙蝠葛苏林碱(daurisoline , DS)。
Dau和 DS 均为双苄基异喹啉类生物碱 ,脂溶性高 ,
易通过血脑屏障 ,在脑组织中有较高的浓度分布。
已有研究证明 Dau 能够抑制血小板活化因子生
成[ 1 , 2] ,DS 有钙拮抗作用[ 35] 和抗 NO毒性损伤的作
用[ 6 , 7] 。蝙蝠葛生药中PAMd 的含量比 Dau和 DS等
·661·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2004 , 39(8):661-665
DOI :10.16438/j.0513-4870.2004.08.019
单体高 ,且提取工艺简单 、成本低 ,因此有更大的开
发应用前景。经研究证明 PAMd 对家兔心脑缺血-
再灌注损伤具有保护作用[ 8] ,本文研究 PAMd 对大
鼠脑缺血-再灌注继发的炎症反应的抑制作用 ,并对
其可能的机制进行初步探讨。
材料与方法
动物及试剂　Wistar大鼠 , ♀♂兼用 ,体重 200-
250g ,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提
供。蝙蝠葛酚性碱(蝙蝠葛碱含量约 80%,蝙蝠葛
苏林碱含量约 15%),中国科学院昆明植物研究所
潘锡平博士提供 ,配制方法:用 1 mol·L-1HCl 溶解
后 ,再用 1 mol·L-1NaOH 调 pH 值至 6.4;尼莫地平 ,
德国 Bayer公司;4%多聚甲醛 ,天津市化学试剂研
究所产品;CD54小鼠抗大鼠细胞间粘附分子多克隆
抗体 ,武汉博士德生物工程公司产品;SABC 免疫组
化试剂盒 ,北京中山生物技术有限公司提供;髓过氧
化物酶(MPO)试剂盒和一氧化氮(NO)试剂盒 ,南京
建成生物工程研究所产品 。
大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型的制备　参照
Nagasawa法[ 9] 制作右侧大脑中动脉栓塞(middle
cerebral artery occlusion , MCAO)模型 , 并加以改进 。
缺血 2 h 后 ,将尼龙线轻轻拔出 ,即为再灌注模型 。
再灌前按 Longa 5分制标准进行评分:0分 ,无明显
神经病学症状;1分 ,不能完全伸展左前肢;2分 ,向
左侧旋转;3分 ,行走时向左侧倾倒;4分 ,不能自行
行走。评分为 13分者为模型成功者 ,余者剔除 ,成
功率为98%。
大鼠随机分为 9组。(1)Sham组:除了不插尼
龙线外 ,其他操作与模型组相同;(2)I-R 3 h组:缺
血2 h再灌 3 h;(3)I-R 6 h组:缺血2 h再灌6 h;(4)
I-R 12 h组:缺血2 h再灌 12 h;(5)I-R 24 h组:缺血
2 h再灌 24 h;(6)PAMd-L 组:缺血2 h再灌24 h ,再
灌后立即 ip PAMd 5 mg·kg-1;(7)PAMd-M组:缺血
2 h再灌 24 h ,再灌后立即 ip PAMd 10 mg·kg-1;(8)
PAMd-H 组:缺血 2 h 再灌 24 h , 再灌后立即 ip
PAMd 20 mg·kg-1;(9)Nim 组:缺血 2 h 再灌 24 h ,
再灌后立即 ip尼莫地平 0.7 mg·kg-1 。
细胞间粘附分子(ICAM-1)表达的检测　大鼠
再灌结束后 ,用 4%多聚甲醛液灌流固定。断头取
脑 ,在额极后 5 mm 处取 1 mm 厚冠状切片 ,常规脱
水 、石蜡包埋 ,连续切成 3 μm厚石蜡切片 , 4 ℃冰箱
保存备用。
切片采用 SABC 法进行免疫组织化学染色后 ,
在 Olympus双目显微镜下放大 200倍 ,每组切片随
机选取 6个脑微血管并通过全自动图象分析仪(北
京航空航天大学研制的病理图象分析软件)分析各
组脑血管细胞间粘附分子(ICAM-1)染色的平均吸收
度 。其中 ICAM-1阳性表达呈棕黄色 。
组织学检查　石蜡切片 HE染色后 ,光镜下观
察脑血管周围白细胞的粘附与渗出。
MPO活性和 NO含量的测定　大鼠再灌 24 h
后断头取脑 ,剔除嗅脑 、小脑和低位脑干 ,在冰上分
离左右两侧的大脑皮层和海马 ,用 4 ℃的冷生理盐
水漂洗 ,除去血液 ,滤纸拭干 ,称重 ,制成 10%的脑
组织匀浆 。匀浆中的 MPO 活性按照文献[ 10] 的方法
测定;NO含量按试剂盒说明书测定 ,应用硝酸还原
酶特异性地将 NO-3 还原为 NO -2 ,722型分光光度计
在 550 nm 处比色 。蛋白含量用考马斯亮蓝 G-250
法测定 。
统计学处理　实验数据以 x±s表示 , t 检验进
行组间差异比较。
结果
1　PAMd对脑缺血-再灌注大鼠 ICAM-1表达的影响
各组 ICAM-1 染色的平均吸收度值见表 1 ,
ICAM-1表达的变化见图 1。
Sham组大鼠脑血管内皮仅见微量 ICAM-1 表
达 。MCAO 2 h后再灌 3 h , ICAM-1表达开始明显增
加 ,且具有时间依赖性 ,至 12 h时 ICAM-1表达基本
达到高峰 ,一直持续到 24 h。PAMd-M组 ICAM-1的
表达明显受到抑制 ,其平均吸收度值也明显降低 ,与
Sham组无显著性差异。
Table 1　Average A value alteration of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)expression in the brain
of ischemia-reperfusion rats at different time and effect of PAMd on ICAM-1 expression after ischemia 2 h
and reperfusion 24 h
Group Sham I-R 3 h I-R 6 h I-R 12 h I-R 24 h PAMd(10 mg·kg -1)
A 0.075±0.006 0.103±0.009＊＊ 0.225±0.007＊＊ 0.368±0.021＊＊ 0.37±0.04＊＊ 0.076±0.006
n=8 , x±s.＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs Sham group.PAMd:Phenolic alkaloids from Menispermum dauricum
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A:Sham group;B:I-R 24 h group;C:PAMd(10 mg·kg-1)group
Figure 1 　Immunohistochemistry in brain sections of rats.ICAM-1 expression increased after ischemia 2 h and
reperfusion 24 h.PAMd (10 mg·kg-1 , ip)significantly inhibited ICAM-1 expression.Positive expression of ICAM-1:
brown stain in microvessel endothelium.Magnification , ×200
2　PAMd 对大鼠脑缺血-再灌注后脑组织中白细胞
粘附和渗出的影响
Sham组大鼠脑组织切片HE染色表明血管内皮
未见白细胞粘附 ,周围组织中也无白细胞渗出 。缺
血2 h再灌 24 h ,大鼠缺血区脑组织中白细胞与血
管壁的粘附及其在脑实质内的浸润数量明显增多 。
给予 PAMd 治疗后 ,与血管壁粘附的白细胞和浸润
到脑实质内的白细胞数量均明显减少(图2)。
3　PAMd 对大鼠脑缺血-再灌注后大脑皮层和海马
中MPO活性的影响
大鼠脑缺血-再灌注后 ,其非缺血侧(左侧)和缺
血侧(右侧)大脑皮层和海马中 MPO的活性见表2 。
I-R 24 h组缺血侧大脑皮层和海马中MPO的活
性均显著升高。PAMd-L 组对 MPO活性无明显影
响 ,PAMd-M组 、PAMd-H 组和 Nim 组可明显降低缺
血侧MPO的活性 ,且PAMd 作用具有剂量依赖性。
I-R 24 h组缺血侧与非缺血侧比较 ,大脑皮层
和海马中的MPO活性均显著升高 。PAMd-L 组缺血
侧大脑皮层的 MPO 活性与非缺血侧相比仍明显升
高 ,但缺血侧海马与非缺血侧海马的 MPO活性无显
著差异 。PAMd-M 组和 PAMd-H组缺血侧与非缺血
侧的皮层和海马中 , MPO 活性均无显著性差异。
Nim组不仅缺血侧皮层与非缺血侧皮层的 MPO 活
性无显著差异 ,而且缺血侧海马的MPO活性比非缺
血侧还明显降低。
A:Sham group;B:I-R 24 h group;C:PAMd(10 mg·kg-1)group
Figure 2　HE staining in brain sections of rats show obvious leucocytes adhesiveness and infiltration around brain vessels
induced by ischemia-reperfusion.PAMd (10 mg·kg-1 , ip)alleviated the adhesiveness and infiltration of leucocytes.
Magnification , ×200
Table 2　Effects of PAMd on myeloperoxidase(MPO)activity(NU·g-1 tissue)in the cortex and
hippocampus of ischemia-reperfusion rats
Group Dosage mg·kg-1 Left cortex Right cortex　 Left hippocampus Right hippocampus　
Sham 0.072±0.019 0.073±0.018　 0.069±0.015 0.066±0.013　　
I-R 24 h 0.073±0.018 0.100±0.012＊△ 0.070±0.017 0.101±0.017＊△
PAMd-L 5 0.070±0.007 0.087±0.013△ 0.073±0.012 0.086±0.026
PAMd-M 10 0.071±0.011 0.070±0.013■ 0.068±0.008 0.066±0.010■
PAMd-H 20 0.074±0.020 0.069±0.011■■ 0.066±0.022 0.060±0.012■■
Nim 0.7 0.080±0.010 0.071±0.008■■ 0.080±0.008 0.065±0.006■■△
n=8 , x±s.＊P <0.05 vs right cortex or hippocampus of Sham group;■P<0.05 , ■■P<0.01 vs right cortex or hippocampus of
I-R 24 h group;△P<0.05 vs left cortex or hippocampus of the same group
·663·张晓娟等:蝙蝠葛酚性碱对大鼠局灶性脑缺血-再灌注继发炎性损伤的保护作用
4 PAMd 对大鼠脑缺血-再灌注后大脑皮层和海马
中 NO含量的影响
大鼠脑缺血-再灌注后 ,各组非缺血侧的大脑皮
层和海马中NO的含量与 Sham组相比 ,均无显著性
差异 。
I-R 24 h 组缺血侧 NO 的含量明显增多 ,PAMd
组和Nim组可明显减少缺血侧大脑皮层和海马中
NO的含量 ,而且随 PAMd 剂量加大 ,NO含量递减 。
PAMd-M组 、PAMd-H 组以及 Nim 组大脑皮层中NO
的含量 ,与 PAMd-L 组同侧大脑皮层相比也有显著
性差异。
I-R 24 h 组缺血侧皮层和海马与非缺血侧相
比 ,NO 含量明显增多。PAMd-M 组 、PAMd-H 组以
及Nim组两侧的 NO 含量无明显差异 。PAMd-L 组
缺血侧大脑皮层中 NO的含量 ,与非缺血侧相比也
有显著性差异。结果见表 3。
讨论
炎症反应在脑缺血-再灌注损伤中起着重要作
用。Barone[ 11] 研究脑缺血-再灌注损伤时发现再灌
注损伤与中性粒细胞的作用密切相关 ,再灌注时中
性粒细胞在缺血区血管内聚集 ,同时伴有血管内皮
肿胀 、血小板淤积阻塞微血管形成无复流现象
(noreflowphenominon),且中性粒细胞被激活产生炎
症介质 、细胞因子 ,激活 iNOS mRNA产生大量NO参
与神经损伤 , 并激活黄嘌呤氧化酶系统产生大量
O2
-自由基。同时白细胞与血管内皮粘附后 ,启动
粘附分子表达 ,促进炎症细胞进一步粘附并透过内
皮细胞膜进入脑组织 ,引起细胞骨架重新排列 ,使细
胞间隙增大 ,血脑屏障破坏[ 12] 。Akopow 等[ 13] 研究
发现白细胞浸润程度与脑缺血的预后密切相关 ,轻
度白细胞浸润者脑梗死体积小 、神经功能恢复好 ,而
重度白细胞浸润者脑梗死体积大 、预后差 。因而白
细胞在缺血侧脑组织的浸润是参与脑缺血-再灌注
损伤的重要机制 ,而粘附分子的表达是白细胞发挥
细胞毒作用的重要条件和基础。髓过氧化物酶
(MPO)主要存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中 ,研究
证明MPO可作为中性粒细胞的标记物[ 11] ,因此测定
MPO活性成为研究白细胞浸润的常用方法。
本实验应用免疫组织化学技术对脑缺血-再灌
注损伤时 ICAM-1的表达进行了定性和半定量研究 。
结果显示 ,缺血 2 h后再灌 3 h ICAM-1的表达开始
明显增加 ,12 h达高峰 ,持续至 24 h ,提示在缺血-再
灌注后 3 h 缺血侧脑组织已经有了明显的炎症反
应 ,炎症反应在再灌注 1224 h达高峰。同时本实验
采用生化方法测定可反映中性粒细胞数量的 MPO
活性 ,并通过病理检查观察脑组织中白细胞浸润程
度 。研究发现缺血 2 h再灌 24 h缺血侧大脑皮层和
海马中的MPO活性显著升高 ,缺血区脑组织中白细
胞与血管内皮细胞的粘附及其在脑实质内的浸润明
显增多。用 PAMd 治疗后 , ICAM-1的表达明显受到
抑制 , 白细胞与内皮细胞的粘附明显减少 , 表明
PAMd 可通过抑制 ICAM-1 表达的增加来抑制脑缺
血-再灌注后炎症反应的发生 ,减轻白细胞浸润和组
织损伤 。同时本实验研究发现缺血 2 h再灌 24 h缺
血侧大脑皮层和海马中的 NO 含量显著升高 ,说明
再灌注后期炎症细胞表达 iNOS ,从而产生大量 NO ,
发挥细胞毒性作用 ,引起迟发性脑损伤[ 14] 。PAMd
能显著降低缺血侧大脑皮层和海马中的 MPO活性
和 NO含量 ,减轻脑组织缺血-再灌注损伤。
综上所述 ,PAMd 对脑缺血-再灌注引起的炎症
反应具有明显的抑制作用 , 其机制可能与抑制
ICAM-1表达增加 、降低缺血区NO含量有关。
Table 3 　Effects of PAMd on NO content [ mol·g-1(Pro)] in the cortex and
hippocampus of ischemia-reperfusion rats
Group Dosage mg·kg-1 Left cortex Right cortex Left hippocampus Right hippocampus
Sham 15±7 12±6 20.0±1.9 19.9±1.9
I-R 24 h 14±4 27±3＊＊＄＄ 21±10 37±5＊＊＄
PAMd-L 5 13.8±1.4 19.6±2.3■＄＄ 21±7 26±5■
PAMd-M 10 15±3 15±3■■△ 23±4 24±4■■
PAMd-H 20 14.3±1.4 13.7±1.2■■△△ 20±5 19±4■■
Nim 0.7 15±3 14±4■■△ 20.2±1.6 20±4■■
n=8 , x±s.＊＊P<0.01 vs right cortex or hippocampus of Sham group;■P <0.05 , ■■P <0.01 vs right cortex or
hippocampus of I-R 24 h group;△P <0.05 , △△P <0.01 vs right cortex or hippocampus of PAMd-L group;＄P <
0.05 , ＄＄P<0.01 vs left cortex or hippocampus of the same group
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