全 文 ：收稿日期:2007-12-08;　修订日期:2008-09-25
作者简介:耿红梅(1968-),女(汉族),河北景县人 ,现任衡水学院应用化
学系副主任医师 ,博士学位 ,主要从事新药开发与研究工作.
欧亚旋覆花总黄酮对大鼠局灶性
脑缺血 -再灌注损伤保护作用的实验研究
耿红梅 1 , 祁金龙 2
(1.衡水学院 , 河北 衡水　053000;　2.河北医科大学 ,河北 石家庄　050017)
摘要:目的 观察欧亚旋覆花总黄酮(totalflavonesextractedfromInulabritannicaL, TFIB)对大鼠局灶性脑缺血 -再灌注
脑组织损伤的保护作用 , 并进一步探讨其作用机制。方法 采用大脑中动脉栓塞法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模
型 , 缺血 2h,再灌注 22h后 , 以盐酸 2, 3, 5-三苯基四氮唑(TTC)染色法测定脑梗塞面积 ,比色法测定脑组织匀浆中超氧
化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量 , 采用 “ 5分法”进行神经症状评分。结果 TFIB(25, 50, 100 mg· kg-1 , ip)
能明显改善脑缺血 -再灌注后大鼠神经症状 ,明显减小梗塞面积与全脑面积之比 ,提高缺血脑组织 SOD活性 ,降低 MDA
含量。结论 TFIB对大鼠缺血 -再灌注损伤大脑具有显著的保护作用 , 其作用机制可能与 TFIB抗氧化作用有关。
关键词:欧亚旋覆花总黄酮;　脑缺血-再灌注;　抗氧化
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)12-3050-02
ProtectiveEffectsofTotalFlavonesExtractedfromInulabritannicaL.onCerebralIs-
chemia-reperfusionInjuryinRats
GENGHong-mei1 , QIJin-long2
(1.HengshuiColege, Hengshui, 053000, China;2.HebeiMedicalUniversity, Shjiazhuang050017, China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheprotectiveefectsoftotalflavonesextractedfromInulabritannicaL.(TFIB)oncerebral
ischemia-reperfusioninjuryinratsanditsmechanism.MethodsThemodeloffocalreperfusioninjuryaftercerebralischemiain
ratswasmadebymiddlecerebralarteryocclusion.For2h, folowedby22hreperfusion.Theinfarctionareaofbrainwasassessed
inbrainslicesstainedwith2% solutionof2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchloride.Spectrophotometricassaywasusedtodeter-
minetheactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andthecontentofmalondialdehyde(MDA)inbraintissue.Neurologicaldefi-
citwasevaluatedbyusinga5-pointneurologicalfunctionscoringsystem.ResultsTFIB(25, 50, 100 mg· kg-1 , ip)signifi-
cantlydecreasedneurologicaldeficitscoresandreducedthepercentageofinfarctionintheipsilateralhemispherecomparedwith
themodelgroup.TFIBsignificantlyincreasedSODactivityanddecreasedMDAcontent.ConclusionTFIBprovidessignificant
protectionagainstcerebralischemia-reperfusioninjuryinrats.
Keywords:TotalflavonesextractedfromInulabritannicaL.;　Cerebralischemia-reperfusion;　Antioxidantaction
　　缺血性脑损伤是以微循环下降为特征的神经系统疾病。临
床上脑缺血发生后 , 大部分患者还有血流再灌注现象发生 , 当
血流再灌注时会产生大量的自由基 , 导致体内脂质过氧化反应 ,
形成一系列的脂质自由基及其降解产物。这些脂质自由基将进
一步引起膜的流动性降低 、通透性增高 、线粒体肿胀 、溶酶体损坏
及释放。因此 , 自由基损伤比单纯脑缺血损伤更加严重 [ 1] 。现
有的许多钙拮抗剂只能治疗单纯脑缺血损伤 ,而对再灌注损伤无
很好地治疗作用。研究证明自由基清除剂和抗氧化药物可以减
轻缺血性脑损伤 , 产生神经保护作用 [ 2 , 3] 。黄酮类化合物具有清
除自由基和抗应激反应的能力 。欧亚旋覆花含有槲皮素 、木犀草
素 、槲皮苷等多种黄酮类化合物 , 具有抗氧化活性 [ 4 , 5] 。然而有
关欧亚旋覆花总黄酮(totalflavonesextractedfromInulaBritannica
L., TFIB)对脑缺血 -再灌注损伤的作用 , 目前尚无报道。本实
验采用大鼠大脑中动脉梗塞 (middlecerebralarteryocclusion,
MCAO)模型 ,观察 TFIB对大鼠局灶性脑缺血 -再灌注损伤大脑
的保护作用。
1　材料
1.1　药品与试剂 欧亚旋覆花总黄酮提取物(自制);SOD及
MDA试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所);2, 3, 5 -三苯基
四氮唑(2, 3, 5-triphenyltet2razoliumchloride, TTC), 其他试
剂为进口或国产分析纯。
1.2　动物 健康雌性 SD大鼠 , 体重 230 ～ 270 g,由河北医科大学
实验动物中心提供 , 清洁 II级 , 动物合格证号:冀医动字第
06057号。
2　方法
2.1　欧亚旋覆花总黄酮的制备 取欧亚旋覆花适量加 10倍量
水 , 回流提取 3次 , 1h/次 , 合并提取液浓缩;然后用 AB-8大孔
吸附树脂柱富集 ,提取物上样浓度为 0.2 g/ml, 用 70%乙醇进行
洗脱 , 冷冻干燥 , 测得总黄酮含量为 89.5%。
2.2　MCAO模型的制备 [ 6 ～ 9] SD大鼠以 10%水合氯醛腹腔注射
麻醉(0.35ml/100 g体重),沿正中纵向剪开颈前皮肤 , 游离右侧
颈总动脉(commoncarotidartery, CCA)、颈外动脉(externalca-
rotidartery, ECA)及颈内动脉(internalcarotidartery, ICA), 将尼
龙线(外涂硅胶 ,头端直径为 0.26 ～ 0.30 mm)沿 ECA插入 ICA
约 18mm(从 ECA, ICA分叉处算起)堵住大脑中动脉头端。缺血
1.5 h后 , 抽出尼龙线进行再灌注 22 h。
进行行为评分参考 ZeaLonga的 5分制评分标准:① 0分:正
常 , 无神经损伤症状;② 1分:对侧前爪部分屈曲或完全屈曲;③
2分 , 向偏瘫侧转圈;④ 3分 ,向偏瘫侧倾倒;⑤ 4分 , 不能自发行
走 , 意识丧失。
2.3　分组与给药 将造模成功的动物随机分为 5组 , 即假手术
组 、模型组和 TFIB不同剂量组(25, 50, 100 mg· kg-1)。假手术
组 、模型组在 MCAO前 1.5 h通过腹腔注射(ip)给予溶剂 , 不
同浓度的 TFIB均在 MCAO前 1.5 h给予(ip)。
2.4　神经症状评分及大脑梗塞面积的测定 模型组在 MCAO前
1.5 h通过腹腔注射(ip)给予溶剂。不同浓度的 TFIB均在
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.12　
MCAO前 1.5 h给予(ip)。存活大鼠再灌注 6, 12, 22 h后观察
大鼠行为变化 , 按 “ 5分法 ”进行神经症状评分 , 然后立即断头取
脑 , 去除小脑及脑干 , 将大脑沿冠状面切成 2 mm厚的脑片 , 于
2%TTC溶液中染色 ,用 ImageJ(美国 NIH)分析软件计算梗塞面
积与全脑面积之比。
2.5　丙二醛(MDA)含量的测定 MCAO模型制备如前。大鼠断
头后 , 于冰浴中迅速分离脑组织 ,去除小脑及脑干 ,取缺血半脑组
织及相应对侧半脑组织分别称重 , 按 1:10比例(每克组织加 10
ml生理盐水)加入冰冷生理盐水 , 用内切式组织匀浆机分别制成
10%组织匀浆 , 离心 10 min(3 000 r· min-1), 并用生理盐水将
上清液稀释成 1%组织匀浆 , 测定按试剂盒使用说明操作 , 于 532
nm处测 OD值 ,按 MDA测试盒计算方法计算 MDA含量 , 比较各
组有无显著性差异。
2.6　脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 MCAO模型制
备如前。大鼠断头后 ,于冰浴中迅速分离脑组织 ,去除小脑及脑
干 , 取缺血半脑组织及相应对侧半脑组织分别称重 ,按 1∶10比
例(每克组织加 10 ml生理盐水)加入冰冷生理盐水 , 用内切式组
织匀浆机分别 制成 10%组织匀浆 , 离 心 10 min(3 000
r· min-1),并用生理盐水将上清液稀释成 1%组织匀浆 , 测定按
试剂盒使用说明操作 ,于 550nm处测 OD值 , 按 SOD测试盒计算
方法计算 SOD含量 , 比较各组有无显著性差异。
2.7　统计学处理 实验数据以 x±s表示 , 多组数据间比较采用
单因素方差分析(ANOVA), DunnetT两两比较 , SPSS10.0数理
统计软件处理。
3　结果
3.1　神经功能评定 模型组 MCAO大鼠神经症状评分明显高于
假手术组。与模型组相比 , TFIB(25, 50, 100 mg· kg-1 , ip)能
明显降低神经症状评分 ,并呈浓度依赖性。见表 1。
表 1　TFIB对脑缺血 1.5 h,再灌 22h后大鼠神经症状评分的影响( x±s)
组别 剂量 行为评分
假手术 10ml· kg-1 0＊
模型 10ml· kg-1 7.5±0.5
TFIB(低) 25mg· kg-1 6.4±0.4＊
TFIB(中) 50mg· kg-1 6.1±0.8＊
TFIB(高) 100mg· kg-1 3.0±0.7＊
　　与模型组比较 , ＊P<0.05;n=6
3.2　TFIB对脑梗塞面积的影响 模型组 MCAO大鼠脑梗塞面积
明显高于假手术组。 与模型组相比 , 经 TFIB(25, 50, 100 mg·
kg-1 , ip)预处理的大鼠脑缺血 -再灌注后 , 其脑梗塞面积较模型
组明显缩小 , 且 TFIB减小梗塞面积的作用呈剂量依赖性。结果
见表 2。
表 2　大鼠脑缺血再灌注后脑梗塞面积比较( x±s)
组别 剂量 行为评分
假手术 10ml· kg-1 0＊
模型 10ml· kg-1 37.5±3.5
TFIB(低) 25mg· kg-1 26.4±1.4＊
TFIB(中) 50mg· kg-1 25.1±0.8＊
TFIB(高) 100mg· kg-1 19.8±1.7＊
　　与模型组比较 , ＊P<0.05;n=6
3.3　TFIB对脑组织 MDA含量的影响 与模型组相比 , TFIB(25,
50, 100 mg· kg-1 )均能明显抑制 MDA含量的升高。 结果
见表 3。
4　讨论
缺血性脑中风是临床常见病 、多发病 , 死亡率及致残率极高 ,
研究开发此类疾病的保护性药物具有重要的临床意义。本研究
采用 MCAO模型观察 TFIB对大鼠缺血 -再灌注大脑的影响。
结果表明 , TFIB能明显改善脑缺血 -再灌注后大鼠的神经功能
症状 , 明显减小脑梗塞面积 , 提示 TFIB对大鼠缺血 -再灌注损伤
大脑具有保护作用。
表 3　TFIB对脑缺血-再灌注大鼠脑组织 MDA含量的影响( x±s)
组别 剂量 MDA含量 C/nmol· ml-1
假手术 10ml· kg-1 20.1±0.3＊
模型 10ml· kg-1 39.9±0.3
TFIB(低) 25mg· kg-1 32.2±0.5＊
TFIB(中) 50mg· kg-1 30.1±0.4＊
TFIB(高) 100mg· kg-1 23.9±0.4＊
　　与模型组相比 , ＊P﹤ 0.01;n=6
3.4　TFIB对脑组织 SOD活性的影响 与模型组相比 , TFIB(25,
50, 100 mg· kg-1)均能明显抑制 SOD活性的降低。结果见表 4。
表 4　TFIB对脑缺血 -再灌注大鼠脑组织 SOD活性的影响( x±s)
组别 剂量 SOD活性 C/U· m1-1
假手术 10ml· kg-1 506.19±2.47＊
模型 10ml· kg-1 274.73±2.89
TFIB(低) 25mg· kg-1 346.98±3.93＊
TFIB(中) 50mg· kg-1 415.97±1.43＊
TFIB(高) 100mg· kg-1 430.75±3.19＊
　　与模型组相比 , ＊P﹤ 0.01;n=6
脑缺血再灌注损伤的发生机制很多 ,如兴奋性氨基酸增多 、
细胞内钙离子超载 、氧自由基损伤等 , 其中氧自由基损伤在脑血
管疾病的发生过程中起着重要作用。脑组织缺血缺氧时 ,会产生
大量的自由基 , 由于脑组织富含多不饱和脂肪酸 , 缺血缺氧产生
的自由基攻击多不饱和脂肪酸 ,导致体内脂质过氧化水平增高 ,
引起神经细胞膜 、亚细胞膜的结构破坏。 MDA是脂质过氧化反
应的产物 , 其含量的高低反映了脑内自由基引起脂质过氧化的水
平 , 因而 ,测定 MDA含量可间接地反映出细胞受损的程度。机体
抗氧化防御酶系统包括超氧化物歧化酶 、谷胱甘肽过氧化物酶 、
过氧化氢酶等。当体内自由基大量产生时 , 使体内抗氧化酶如
SOD过量消耗而导致 SOD活性下降。本实验研究结果表明 , 大
鼠缺血 -再灌注后 , SOD活性显著下降 , MDA含量显著升高 , 表
明缺血再灌注过程中产生大量自由基损伤机体。 TFIB可以降低
脑组织中的 MDA含量 ,提高 SOD活性 ,提示 TFIB有较强的清除
自由基和抗氧化活性。
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