全 文 ：蝙蝠葛酚性碱对小鼠脑缺血-再灌注脑组织 Bax 和 Bcl-2 蛋白表达的影响
吕　青, 曲　玲,王　芳,郭莲军

(华中科技大学同济医学院 药理系, 湖北 武汉　430030)
摘　要: 目的　研究蝙蝠葛酚性碱对小鼠脑缺血-再灌注后脑组织凋亡相关蛋白表达的影响。方法　采用免疫组织
化学方法观察凋亡促进蛋白 Bax、凋亡抑制蛋白 Bcl-2 的表达。结果　皮质于缺血复灌 12 h、海马 CA 1区于缺血复
灌 24 h Bax 表达明显增多, Bcl-2 表达明显减少, 蝙蝠葛酚性碱预防给药能抑制脑组织 Bax 的表达, 并促进 Bcl-2
表达, 减少脑细胞凋亡。结论　蝙蝠葛酚性碱能抑制缺血-再灌后脑组织损伤,使凋亡细胞减少,对脑缺血有一定的
保护作用。
关键词: 蝙蝠葛; 脑缺血-再灌注; 细胞凋亡; Bax 蛋白; Bcl-2 蛋白
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 02 0185 03
Effect of phenolic alkaloids fromMenispermum dauricum on expression
of protein Bax , Bcl-2 in brain of cerebral ischemia-reperfusion mice
LU
　¨
Qing , QU Ling, WANG Fang , GU O Lian-jun
( Depar tment of Pha rmaco lo gy , T ongji Medical Colleg e of Huazhong Univ ersity
of Science and T echno lo gy , Wuhan 430030, China )
Key words : Menisp ermum dauricum DC. ; cer ebral ischem ia-r eper fusion; cell apoptosis; Bax pr otein;
Bcl-2 pro tein
　　蝙蝠葛酚性碱 ( phenolic alkaloids f rom M enis-
p ermum dauricum DC. , PAMD) 是从防己科植物
蝙蝠葛 Menisp ermum dauricum DC. 根茎中提取的
多种脂溶性生物碱的混合物, 其主要成分为蝙蝠葛
碱 ( daur icine, DAU ) 和蝙蝠葛苏林碱 ( dauriso-
line, DS)。DAU 和 DS 均属双苄基四氢异哇啉类生
物碱,具钙拮抗作用[ 1]。研究证明 PAMD 能延长小
鼠缺血缺氧存活时间, 缩小大鼠大脑中动脉栓塞的
脑梗死面积, 及抗脂质过氧化作用[ 2]。本研究采用小
鼠不完全性脑缺血-再灌注模型,研究 PAMD 对凋
亡相关基因 Bax , Bcl-2 表达的影响, 进一步研究
PAMD 对脑缺血的保护作用及其作用机制。
1　材料与方法
1. 1　药品、试剂及仪器:蝙蝠葛酚性碱 (蝙蝠葛碱
含量约 90%) , 中国科学院昆明植物研究所潘锡平
博士提供。Bax , Bcl-2免疫组化试剂盒,北京中山生
物试剂有限公司产品,抗体浓度为 1∶50。HPIAS—
1000 型彩色病理图文分析系统, 千屏影像工程
公司。
1. 2　动物:昆明种小鼠, 雄性,体重 ( 22±2) g, 华
中科技大学同济医学院动物学部提供。
1. 3　动物分组及给药方法: 昆明种小鼠 80 只, 随
机分为假手术组 ( Sham)、单纯缺血组 ( I)、缺血复
灌不同时间组 ( I-R) :又分为缺血 1 h 复灌 6, 12, 24
h 组, 缺血复灌不同时间+ PAMD 治疗组 ( I-R +
PAMD) :分为缺血 1 h 复灌 6, 12, 24 h 治疗组。
PAMD 治疗组按 30 mg / kg 于缺血前 10 m in ip 给
药,其他组以等量生理盐水代替。
1. 4　小鼠不完全性脑缺血-再灌注模型制备[ 3] : 小
鼠称重,戊巴比妥钠 30 mg / kg ip 麻醉,仰卧位固定
于恒温手术台上 (温度 37 ℃) ,颈部正中切口,分离
双侧颈总动脉并用无损伤动脉夹夹闭, 同时眼眶后
静脉丛放血每只鼠 0. 3 mL,缺血 1 h 即造成单纯不
完全性脑缺血; 缺血 1 h 后,松开动脉夹,使血流再
通,即形成再灌注。假手术组仅分离双侧颈总动脉不
结扎。达再灌时限时重新麻醉动物, 在麻醉状态下
(麻醉不宜过深) , 以 4% 多聚甲醛行心脏灌流固
定,开颅取前脑, 置 4% 多聚甲醛液, 4 ℃ 冰箱中固
定过夜。在额极后 3 mm 处沿冠状面取 1 mm 厚脑
切片,常规脱水,石蜡包埋,取连续 3 张切片,中间 1
张做 HE 染色观察细胞形态改变,相邻切片分别做
免疫组化染色检测 Bcl-2、Bax 蛋白的表达情况。
·185·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月

收稿日期: 2003-07-25作者简介:吕　青( 1975—) ,女,湖北武穴人,华中科技大学同济医学院药理系助教,医学硕士,主要研究方向为心脑血管药理。
T el: ( 027) 83691762　E-m ail : lvq21c@ yahoo. com . cn
1. 5　免疫组织化学检测:采用链霉亲合素-生物素-
过氧化物酶复合物 ( SABC) 法,各步操作严格按照
SABC 试剂盒说明进行。阳性判断标准:神经元胞浆
或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。每张切片在皮质
和海马 CA 1区各采集 10 个高倍镜视野,输入病理
图文分析系统进行测定,可分别计算 Bax、Bcl-2 的
吸光度值,由此可对相关抗原表达进行定量分析。
1. 6　统计学处理:数据均以 x±s 表示,组间比较采
用 t 检验。
2　结果
2. 1　PAMD 对小鼠不完全性脑缺血-再灌注脑组
织病理形态改变的影响:光镜下假手术组小鼠脑皮
质、海马区锥体细胞排列整齐,核膜、核仁清晰, 大小
规整,细胞外间隙较窄。单纯缺血组小鼠神经细胞胞
核着色过深, 部分出现变形固缩。缺血再灌组小鼠脑
组织发生不同程度的病理改变, 细胞除变形固缩外,
还出现胞核碎裂,胞体膨胀裂解,细胞间隙增大,细
胞数量减少。药物治疗组脑组织病变较模型组均明
显减轻,表现为细胞数目增加,形态完整规则。
2. 2　对小鼠不完全性脑缺血-再灌注皮质部 Bcl-2、
Bax 蛋白表达的影响:见表 1。假手术组、单纯缺血
组小鼠皮质区 Bcl-2 蛋白表达吸光度值较高,两组
结果比较无统计学差异; 缺血后再灌注 6, 12 和 24
h 各组 Bcl-2 蛋白表达吸光度值均明显降低, 与假
手术组、单纯缺血组比较, 结果差异显著 ( P <
0. 001)。单纯缺血组小鼠皮质区 Bax 蛋白表达吸光
表 1　小鼠缺血-再灌注后皮质部 Bcl-2 和
Bax 蛋白的表达 ( x±s, n= 10)
Table 1　Expression of Bcl-2 and Bax protein in cortex
in ischemia-reperfusion mice ( x±s, n= 10)
组　别
再灌注
时间/ h
Bcl-2 吸光度　 Bax 吸光度　
Bcl-2
/ Bax
Sham 　 - 0. 129 0±0. 004 6 0. 126 9±0. 003 9 1. 02
I 　 - 0. 129 5±0. 006 6 0. 133 6±0. 010 4 0. 97
I-R 　 6 0. 089 6±0. 003 2* * * △△△0. 218 8±0. 016 7* * * △△△ 0. 41
12 0. 078 1±0. 016 9* * * △△△0. 214 6±0. 009 1* * * △△△ 0. 36
24 0. 092 2±0. 005 3* * * △△△0. 156 5±0. 027 5* * △ 0. 59
I-R+ PAMD 6 0. 130 8±0. 021 8# # # 0. 125 8±0. 002 7# # # 1. 04
12 0. 121 1±0. 013 8# # # 0. 137 8±0. 005 9# # # 0. 88
24 0. 114 6±0. 008 0# # # 0. 123 2±0. 008 2# # 0. 93
　　与假手术组比较: * * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
　　与单纯缺血组比较: △P< 0. 05　△△△P < 0. 001
　　与缺血复灌相应时间组比较: # # P< 0. 01　# # # P < 0. 001
　　* * P< 0. 01　* * * P < 0. 001 v s Sham g rou p
　　△P < 0. 05　△△△P < 0. 001 v s group I
　　 # # P < 0. 01　# # # P < 0. 001 vs group I-R at corresponding
t ime
度值与假手术组比较有升高趋势,但结果无统计学
差异;缺血后再灌 6, 12 h 组, Bax 蛋白表达吸光度
值进一步升高,与假手术组、单纯缺血组比较, 结果
均有显著差异 ( P< 0. 001) ,缺血后再灌注 24 h 组
Bax 蛋白表达吸光度值较 6, 12 h 有所降低, 但与假
手术组、单纯缺血组比较差异显著。PAMD 30 mg /
kg 于缺血前 10 m in ip 给药后,使缺血复灌 6, 12 和
24 h 各组的 Bcl-2 蛋白表达吸光度值明显升高; 并
使 Bax 蛋白表达吸光度值明显降低,与相应缺血复
灌组比较结果差异均显著。
2. 3　对小鼠不完全性脑缺血-再灌注海马部 CA 1区
Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响:见表 2。单纯缺血组小
鼠海马 CA 1区 Bcl-2 蛋白表达吸光度值与假手术组
比较差异无统计学意义; 缺血后随再灌时间延长
Bcl-2蛋白表达进行性降低,至再灌 24 h 达到最低。
假手术组小鼠海马 CA 1区有较弱 Bax 蛋白表达, 缺
血 1 h 后, Bax 蛋白表达吸光度值开始升高, 与假手
术组比较差异显著 ( P< 0. 001)。缺血后随再灌时间
延长, Bax 蛋白表达持续升高, 至再灌 24 h 达到最
高峰,与假手术组、单纯缺血组比较, 结果均有显著
性差异。PAMD 30 mg/ kg 于缺血前 10 min ip 给药
后,使缺血复灌 12, 24 h 组的 Bcl-2 蛋白表达增加,
并使缺血复灌 12, 24 h 组 Bax 蛋白表达吸光度值
降低,与相应缺血再灌组比较结果差异均有显著性。
表 2　小鼠脑缺血-再灌注后海马 CA1区 Bcl-2
和 Bax 蛋白的表达 ( x±s, n= 10)
Table 2　Expression of Bcl-2 and Bax protein
in hippocampi CA1 area in ischemia-
reperfusion mice ( x±s, n= 10)
组　别
再灌注
时间/ h
Bcl-2 吸光度　 Bax 吸光度　 Bcl
-2
/ Bax
S ham 　 - 0. 127 2±0. 003 3 0. 092 6±0. 005 3 1. 37
I 　 - 0. 124 1±0. 009 2 0. 128 6±0. 010 5* * * 1. 04
I -R 　 6 0. 110 4±0. 018 7* 0. 133 1±0. 000 9* * * △ 0. 83
12 0. 088 8±0. 003 5* * * △△△0. 159 1±0. 007 5* * * △△△ 0. 56
24 0. 085 1±0. 012 4* * * △△△0. 174 7±0. 015 6* * △△△ 0. 49
I -R+ PAMD 6 0. 112 2±0. 010 5 0. 136 2±0. 016 7 0. 82
12 0. 114 4±0. 001 5# # # 0. 130 7±0. 006 0# # # 0. 88
24 0. 129 0±0. 006 6# # # 0. 123 6±0. 002 4# # # 1. 04
　　与假手术组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
　　与单纯缺血组比较: △P < 0. 05　△△△P< 0. 001
　　与缺血复灌相应时间组比较: # # # P < 0. 001
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P< 0. 001 v s Sh am group
　　△P < 0. 05　△△△P < 0. 001 v s group I
　　# # # P < 0. 001 v s group I-R at corresponding t ime
3　讨论
　　缺血可导致脑损伤, 再灌注可加重脑组织原有
·186· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月
的缺血性损伤,引起能量衰竭和酸中毒,产生大量自
由基、兴奋性氨基酸,一氧化氮积聚,并引起离子自
稳机制破坏, 导致细胞内钙超载,最终引起某些原癌
基因的表达, 诱导凋亡发生,细胞凋亡 [ 4, 5]。细胞凋亡
是受基因调控的,如凋亡抑制基因 Bcl-2、p53,凋亡
促进基因 Bax、c-myc、fas 等。Bax 是一种由 192个
氨基酸残基组成的,相对分子质量为 21 000 的蛋白
质,与 Bcl-2 的同源性为 21%, 但 Bax 与 Bcl-2 的
作用完全相反。在体内, Bax 单体或 Bcl-2 形成的异
二聚体促进凋亡的发生。因此, Bcl-2 与 Bax 表达的
比率决定着细胞在受到凋亡刺激信号后是生存还是
凋亡[ 6, 7]。
本实验观察到与单纯缺血组比较,小鼠不完全
性脑缺血后复灌 6, 12 h 组的皮质 Bax 表达显著增
多, Bcl-2 表达持续减少, 缺血后复灌 12 h 组 Bcl-2/
Bax 比值较低; 而缺血后复灌 24 h组的 Bax 表达较
6, 12 h 有所降低, 伴随着 Bcl-2 的表达增加, Bcl-2/
Bax 比值升高。结果提示皮质缺血后复灌损伤引起
的细胞凋亡在复灌 12 h 时达高峰,随着复灌时间的
延长,缺血区血供有所恢复,细胞损害有所减轻。本
实验亦观察了缺血及复灌后海马 CA 1区的动态变
化,单纯缺血 1 h 后, 海马 CA 1区 Bax 表达增多,
Bcl-2 表达无明显改变; 脑缺血复灌后 6, 12 至 24
h,海马 CA 1区 Bax 表达持续增多, 同时 Bcl-2 表达
持续减少, 缺血后复灌 24 h 组 Bcl-2/ Bax 比值最
低,提示此时细胞凋亡达一个高峰,这种缺血后的迟
发性神经元坏死现象与文献报道基本一致 [ 8]。本实
验观察到单纯缺血组 Bcl-2 表达并不减少,推测可
能与神经细胞自我保护机制有关, 可防止或减少缺
血所致凋亡的发生。PAMD 预防给药后,能抑制凋
亡促进因子 Bax、促进凋亡抑制因子 Bcl-2 的表达,
提高 Bcl-2/ Bax 比值, 对缺血复灌后皮质细胞的凋
亡及海马 CA 1区迟发性神经元坏死均有抑制作用。
PAMD 对凋亡基因表达的影响可能与其钙拮
抗作用有关。初步实验证明 PAMD 能抑制 Ca2+ 的
释放,其对高钾去极化引起的离体兔外周血管、脑血
管收缩有扩张作用;能抑制脑缺血-再灌过程中超氧
化物的产生, 减轻缺血-再灌损伤[ 2]。因此, PAMD
可能是通过其钙拮抗作用, 引起原癌基因表达发生
改变而起到脑保护作用的。
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