全 文 ：TLC生物自显影技术在药物筛选中的应用
曲建博, 娄红祥* ,范培红X
(山东大学药学院,山东 济南　250012)
摘　要: TLC生物自显影是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法, 具有操作简单、耗费低、
灵敏度和专属性高等优点, 是一种快速测定生物活性的方法。可用于对具有抗菌/真菌, 抑制胆碱酯酶以及清除自
由基和抗氧化等活性的天然产物的筛选, 可实现活性指导的提取分离。利用 TLC生物自显影,可测定单体活性化
合物的最小抑制浓度( MID) ,通过与对照品的MID值比较, 能够推测该化合物活性的强弱。此外,利用 TLC生物自
显影定性及定量的特征, 还可对食物、水样及动物组织中抗生素残留量进行监测。现综述 TLC生物自显影技术及
其在天然产物筛选中的应用, 同时对其优点及不足也进行了总结。
关键词: T LC生物自显影;抗细菌;抗真菌;胆碱酯酶抑制活性;自由基;抗氧化作用
中图分类号: R285. 51　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2005) 01 0132 06
Applicat ion of TLC-bioautography t o drug scr eening
QU Jian-bo, LOU Hong-xiang, FAN Pei-hong
(School of Parmacy, Shandong Universit y, Jinan 250012, China)
Key wor ds : TLC-bioautography; ant ibacterial act ivity; ant ifungal act ivity; cholinesterase inhibit ion;
fr ee r adical; ant ioxidat ion
　　从天然产物中得到的成分往往要进行生物活性测定。传
统的活性测定方法需在整个动物或某个器官上进行,这要求
被测化合物首先被分离出来,并且要有足够大的量, 许多从
天然产物中得到的成分不能满足这一要求[ 1]。目前常用的微
量生物活性测定方法, 如微生物抑制法 ( STOP、LAST、
CAST、FAST、BR-Test、Delvotest P )、酶法( Penzyme)、免疫
测定法 [ enzyme -liked immunosorbent assay (ELISA)、Cite
Probe ]和放射性免疫测定法( Charm) ,可对微量化合物进行
较准确的活性测定, 但是这些方法在使用过程中有一定的局
限性。例如, 微生物抑制法虽然操作简单、耗费低,但是其专
属性和灵敏度不高,易出现假阳性结果;酶法和放射性免疫
测定法虽然灵敏度高, 但其花费相当昂贵, 一般不适用于未
经分离的天然药物筛选[ 2]。而 TLC 生物自显影法可弥补以
上不足,其操作简单、耗费低、灵敏度和专属性高, 是一种快
速测定生物活性的方法[ 2～4] , 尤其适用于对具有抗菌/真菌,
抑制胆碱酯酶以及清除自由基和抗氧化等活性成分的筛选。
笔者就 TLC 生物自显影技术在药物筛选中的应用作一
综述。
1　TLC生物自显影对抗菌/真菌化合物的筛选
1. 1　T LC生物自显影: T LC 生物自显影是一种将薄层色谱
分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法。利用薄层板将
混合物(如植物提取物)在薄层板上展开后, 将薄层板与接种
了病原微生物(人体致病菌或植物致病菌)的培养基相接触,
通过一定的培养, 非活性部位会被生长出的病原微生物所覆
盖而呈现背景色,活性部位因抑制了病原微生物的生长而呈
现抑制斑点,这样就可从混合物中筛选出活性成分[5]。TLC
生物自显影通常有 3 种方法:琼脂扩散法 ( agar diffusion)、
直接 T LC 生物自显影检测法 ( dir ect TLC bioautography
detection)和琼脂覆盖法( agar over lay)。
1. 1. 1　琼脂扩散法:较早被使用的一种方法, 以接种了病原
微生物的培养基为载体,将吸附了待测化合物的薄层板与培
养基表面相接触, 在 0～4 ℃的条件下培养过夜(HPT LC板
所需时间短) , 利用化合物的扩散性质,将吸附在薄层板上的
化合物转移到培养基表面,取走薄层板, 培养基在 37 ℃左右
的条件下培养过夜以进行生物自显影。一般情况下, 在培养
基中加入一定量的四唑盐 (如 MTT、INT 等) , 会使结果更
易观察[3]。(因为MTT、INT 等四唑盐本身颜色较浅,且易被
细菌的代谢产物转化为颜色较深的甲 类化合物, 从而形成
背景色)。由于硅胶与琼脂之间的吸附作用,琼脂易黏附在硅
胶上,取走薄层板时, 易使琼脂层受到破坏,从而影响抑菌斑
点的观测,在薄层板与琼脂层之间加一张润湿的滤纸可减小
这种危险。
1. 1. 2　直接 TLC生物自显影检测法:与琼脂扩散法不同,
以薄层板为载体,将用特定营养液配成一定浓度的病原微生
物的悬浮液直接喷洒到点样并展开的薄层板上, 在潮湿避光
的环境下培养一段时间即可直接或通过四唑盐溶液显色的
方法观察到实验结果[5～7]。该方法适用于可直接在薄层板上
生长的真菌孢子和某些细菌, 最常用的为瓜疮痂枝孢霉菌
·132· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 36 卷第 1 期 2005年 1月
X 收稿日期: 2004-04-04作者简介:曲建博( 1980—) ,男,山东大学药学院在读硕博连续研究生,研究方向为苔藓植物中联苄类化合物抗真菌活性及其作用机制。
T el: ( 0531) 8382012　E-mail: qujianbo198@sohu. com
* 通讯作者　Tel/ Fax: ( 0531) 8382019　E-mai l: louhongxian g@sdu. edu. cn
Cladospor ium cucumerinum Ell. ex Ar th.。并且, 使用直接
TLC 生物自显影检测法测定,化合物作用持续时间一般较
长, 相对与其他 2 种方法,该法更利于结果的保存。实验中,
营养液可为葡萄糖-无机盐溶液[ 8]或营养素肉汤[ 6] , 细菌/真
菌悬浮液浓度一般为每毫升 105～1010个孢子[6, 9] , 所用体积
一般为 5～6 mL( 20 cm×20 cm) ,过多或过少均会影响抑制
斑点的观测。为使细菌或者真菌均匀分布在薄层板上, 可用
喷瓶或滚柱装置涂布细菌或真菌悬浮液 ,后者可最大限度地
减少空中飘浮的微生物含量。细菌或真菌的培养温度和培养
时间随所用菌种的不同而不同,培养温度一般略高于室温,
培养时间为 2～3 d [6, 8, 10] , 也可在 30 ℃左右培养过夜[ 11] ;有
时需光照[ 6, 12] , 以使细菌/真菌进入稳定增长期为最佳。此
外, 由于该方法以薄层板作为生物自显影的载体, 因此, 薄层
板以及展开剂的选择应值得注意。Hambuger 等比较了硅胶
薄层板、中性 Al2O3薄层板和聚酰胺薄层板生物自显影的效
果, 结果硅胶薄层板生物自显影效果最佳,同时认为,薄层板
所用的展开剂应选用易发挥的试剂, 尽管避免使用酸、碱等
不易发挥的试剂, 试剂的残留会对细菌或真菌的生长产生较
大影响。
1. 1. 3　琼脂覆盖法:是前 2 种方法的杂合, 将接种了细菌或
真菌的熔融麦芽汁琼脂培养基均匀涂布在点样并展开后的
薄层板上, 待琼脂凝固后,将薄层板在 30 ℃左右的条件下培
养过夜[10, 13] , 用四唑盐染色后, 即可观测到实验结果。这种
方法适用于广谱微生物, 尤其适用于酵母菌和细菌等[ 13]。值
得注意的,某些化合物在培养基上很容易扩散,使用琼脂覆
盖法有时不易观察到抑菌斑点。
1. 2　HPTLC 及 2D-TLC 生物自显影法: HPT LC生物自显
影法与 T LC 生物自显影相比, 具有以下几点优势[ 3] :较普通
薄层板对化合物的分离效果要好, 并且对某些化合物 (如
CAP、ERY)的灵敏度要比 TLC 生物自显影高;较普通薄层
板的展开时间要短,且展开剂的使用量也较少,从环境保护
角度看, 更具优势;所需点样量及细菌培养液的量均小于
TLC生物自显影法。
对于成分较多的天然提取物, 往往要耗费大量试剂对其
进行极性分离, 2D-T LC 直接生物自显影方法能很好的解决
这个问题。Wedge等[ 9]先用极性展开剂将 TLC板展开, 调转
90°后再用非极性展开剂第 2 次展开, 这样在一块薄层板上
就同时展开了极性和非极性成分。2D-TLC生物自显影, 非
常适合于对含有脂溶性成分且一次展开不容易分离的提取
物的生物活性测定。该方法无需使用众多的展开系统及薄层
板, 减少了废液处理量, 进而缩短了鉴定活性化合物所需的
时间。
1. 3　TLC生物自显影的应用:该法在天然药物化学中的一
个主要用途是指导分离天然提取物中具有抗菌/真菌活性的
化合物。根据T LC生物自显影的结果,可对天然提取物不同
部位的生物活性进行评估, 进而有目的的进行下一步的提取
分离。另外, 对于单体活性化合物,可利用 TLC生物自显影
测定出化合物的最小抑菌浓度 (minimum inhibitory dose,
M ID) , 将该值与对照品的MID 相比较, 从而能够推测出该
化合物的活性大小[11, 14]。部分利用 TLC生物自显影筛选天
然产物中抗菌/真菌活性化合物的应用情况见表 1。
T LC生物自显影的另一个用途是对抗生素残留量的监
测。Baradat 等 报道 了对 牛奶 中抗 生素 Glycopeptide
Actaplanin 残留量的测定过程,使用的生物活性测定方法为
琼脂覆盖法。Balinova 利用T LC生物自显影技术,对 4 种农
作物及水样中各 5 种杀(真)菌剂的残留量进行了测定, 并且
对实验条件进行了优化, 指出绿色木霉 T r ichod erma viride
Pers. 对多种抗生素具有敏感性, 为最理想的探测剂。
Ramirez等[ 3]和 Choma[ 5]利用 T LC 生物自显影技术对牛奶
中的残留抗生素进行了定性及定量测定,指出该方法的突出
优点是可免去对待测牛奶繁琐的预处理过程。
2　TLC 生物自显影对胆碱酯酶抑制剂的筛选
利用 TLC生物自显影可对具有胆碱酶抑制活性的化合
物进行筛选。根据 Ellman 等报道, 乙酰胆碱酯酶抑制剂的生
物活性测定原理如下[4] :以硫代乙酰胆碱( acetylthiocholine )
为底物 , DTNB[ 5, 5′- dit hiobis- ( 2-nit robenzoic acid) ] 为染
料。将底物、染料及酶依次涂布在吸附了待测化合物的薄层
板上, 底物在乙酰胆碱酯酶的存在下发生水解反应, 水解产
生的硫代胆碱( thiocholine) , 其与染料 DTNB进一步发生反
应, 形成黄色化合物 5-巯基- 2-硝基苯甲酸盐 ( 5-thio-2-
nitrobenzoat e)。在薄层板上, 有活性化合物存在的部分由于
活性化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用,以上化学反应无法
进行而呈现白色, 其他部分由于乙酰胆碱酯酶的作用生成
5-巯基 -2-硝基苯甲酸盐而显黄色。该反应现象一般应在 15
m in 以内观察完毕, 因为 20～30 min 以后, 结果会自动消
失[4]。Kiely 等利用 Ellman 法首次在 TLC板上对具有乙酰
胆碱酯酶抑制活性的化合物进行了定性测定, 他们将待测物
在 TLC 板上点样后并没有展开,只是对它的抑制活性进行
了评估。Rhee等[ 4]为在石蒜植物中发现除加兰他敏以外的
乙酰胆碱酯酶抑制剂,将 15 种石蒜提取物在 T LC 板上展开
后再进行生物活性测定,并以加兰他敏作为对照, 薄层板上
其他抑制斑点即显示为非加兰他敏乙酰胆碱酯酶抑制剂。利
用该方法指导提取分离可大大节省活性化合物的分离时间,
此外,该方法比 UV 及 Dragendor ff试剂检测法更加灵敏,并
且实验所需乙酰胆碱酯酶抑制剂的最小检测量比微量盘测
定法小得多。
除乙酰胆碱酯酶抑制剂外, Marston 等[ 15]利用 T LC生
物自显影还对植物中具有丁酰胆碱酯酶抑制活性的化合物
进行了筛选。他们用乙酸萘酯和 Fast Blue B 盐来检测酶的
活性,薄层板上胆碱酯酶非抑制区域会由于乙酸萘酯和 Fast
Blue B 盐分别转化为萘酚和一种重氮类化合物而呈现紫色
的背景色,而活性区域仍呈现白色。
3　TLC 自显影对自由基清除剂及抗氧化剂的筛选
T LC自显影可对天然提取物中具有自由基清除及抗氧
化活性的化合物进行筛选。在展开的薄层板上喷洒 0. 2%的
DPPH甲醇溶液, 30min后活性部位显黄色 , 而薄层板其余
·133·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 36 卷第 1 期 2005年 1月
表 1　TLC生物自显影对具有抗菌和抗真菌活性的天然产物的筛选应用[ 7,8, 10～13]
Table 1　Antibacter ial and antifungal compounds in na tur al products identif ied by TLC bioautography[ 7, 8,10～13]
来　源 提取溶剂 受试生物体 方法 活性成分 MID/ Lg 对照品 MID/ Lg
大萼金丝桃
　Hypericum
　caly cinum
石油醚 Cl adosp or ium
cucumerinum
直接 TLC 生
物自显影
检测法
1 -( 4-( 3-methylbut -
2-enyloxy ) -2, 6-
dihydroxy-3-
methyl - p hen yl ) -3-
methyl -butan-1-one
0. 7
绵三七
　E riosema
　tuberosum
二氯甲烷 C . cucumerium/
Cand id a
albicans
直接 TLC 生
物自显影
检测法/琼
脂覆盖法
千斤拔素D
鸡头薯酮 A*
鸡头薯酮 B*
鸡头薯酮 C*
鸡头薯酮 D*
5/ 1
10/ 1
5/ 5
5/ 1
5/ 1
Propiconzole/
咪康唑
0. 001/ 0. 01
巴西金丝桃
　Hypericum
　brasili ense
汽油 Bacil lus subtil is 琼脂覆盖法 地耳草素 A湿生金丝桃素 A
isoul iginosin B
巴西金丝桃酚 A*
0. 5
0. 2
0. 16
0. 32
氨苄西林
氯霉素
0. 01
0. 001
灌 状 韦 氏 木
West ring ia
f rut icosa、柳
枝 韦 氏 木
West ring ia
viminal is
氯仿、80%
乙醇水溶
液
C . cucumer inum 直接 TLC 生
物自显影
检测法
6 -O-[ Z] -4-methoxy-
cinnamoyl -catalp-
ol*
6 -O-( [ E ] -3, 4-dime-
th oxy-cinn amoyl ) -
catalpol
10
25
松生拟层孔菌
F omitopsis
p inicola
二氯甲烷 B . subt il is 直接 TLC 生
物自显影
检测法
polyporenic acid C
3A-acetyloxylanosta-8,
　24-dien -21-oic acid
polyporencc acid A
trametenol ic acid
拟层孔菌酸*
1
0. 01
0. 2
2. 5
0. 1
氯霉素 0. 01
雅致香茶菜
P lect ranthus
elegans
氯仿 C . cucumerinum 直接 TLC 生
物自显影
检测法
11 -hydroxy-12-oxo-
7, 9 ( 11 ), 13-
abietat riene*
7 A, 11-dihydroxy-12-
methoxy-8, 11, 13-
abietat riene*
1
1
两性霉素 < 0. 5
裸 麦 H or deum
vulgare
二氯甲烷 C . cucumerinum 直接 TLC 生
物自显影
检测法
alkylresorcinols —
膨大胡椒 P ip er
d ilatatum
二氯甲烷 C . cucumer inum 直接 TLC 生
物自显影
检测法
t aboganic acid*
meth ytaboganate
2, 2-dimethyl-6-carbo
xychr onman -4-one
methyl ester
2 , 2-dimethyl-6-carbo
xychr onman merhyl
es ter
5
5
3
1
咪康唑 1
抱萼獐牙菜
Swert ia
caly cina
二氯甲烷 C .
cucumerinum/
Cand id a
albicans
直接 TLC 生
物自显影
检测法/琼
脂覆盖法
2 -methoxhy-1, 4-n ap
hthoquinone*
0. 1/ 0. 4 Propiconazole 0. 1/ 0. 001
好望角姜饼树
P arinar i
cap ensis
二氯甲烷 C . cucumer inum 直接 TLC 生
物自显影
检测法
( 4 R, 9R ) -10-
hydroxy-9-methyl-
15-oxo-20-norkaur-
16-en -18-oic acid C-
lactone*
( 4 R, 9R ) -10-
hydroxy-13-
methoxy -15-oxo-
20-norkaur-16-
en-18-oic acid C-
lactone
—
—
墨绿藤黄
Gar cinia
at rovir id is
正丁醇 C . herbarum 直接 TLC 生
物自显影
检测法
1′, 1″-dibutyl methyl
hydroxycitrate*
2 -( b utox y-carbongm
ethyl ) -3-butoxycar
bonyl-2-hyd roxy-3-
propan ol ide*
0. 4
0. 8
环己亚胺 0. 5
短穗黄芪
Astrag alu s
brachy stachy s
丙酮 B . subt il is 直接 TLC 生
物自显影
检测法
南欧丹参醇
14R-epoxysclareol*
6B-hydr ox ysclareol*
20/ 14a
20/ 13a
20/ 8a
五氯酚 1/ 15a
枯草杆菌
Bacil lus
subt il is 168
丁醇 Stap hylococcus
aureus 209P
琼脂覆盖法 bacilysocin —
·134· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 36 卷第 1 期 2005年 1月
　　续表 1
来　源 提取溶剂 受试生物体 方法 活性成分 MID/ Lg 对照品 MID/Lg
微凹土密树
Brid elia
retusa
二氯甲烷、
醋酸乙酯、
15%甲醇
醋酸乙酯
溶液
C . clad osp orioides 直接 TLC 生
物自显影
检测法
( E ) -4-( 1, 5-d imeth-
yl-3-oxo-1-hexen -
yl) ben-zoic acid*
( E ) -4-( 1, 5-d imeth-
yl-3-oxo-1-4-hexe-
nyl) benzoic acid*
( R ) -4-( 1, 5-d imeth-
yl -3-oxo-4-h exe-
nyl ) benzoic acid*
( R ) -4-( 1, 5-d imeth-
yl-3-oxohexyl )
ben zoic acid
(—) -isonchaminic
acid*
( + ) -sesamin
4 -isopropylbenzoic
acid
50
25
　5
25
10
25
10
美国崖椒
F agara
zanthoxyloid es
二氯甲烷 C . cucumerinum/
Cand id a
albicans、 B .
subt il is
直接 TLC 生
物自显影
检测法/琼
脂覆盖法
dihydrocuspidiol
凸尖花椒二醇
phenylpropanol
( + ) -sesamin
N -isobutyl-( 2Z , 4Z ) -
deta-2, 4-dienamide
0. 01/ - , -
0. 1/ 10, 10
0. 1/ - , -
0. 1/ - , -
0. 1/ 10, 10
咪康唑/咪康唑、
氯霉素
1/ 0. 1, 1
道氏蒿Artemisia
d oug lasiana
水蒸气蒸
馏
Colletotr ichum
spp.
直接 TLC 生
物自显影
检测法
普通茼蒿酮 B —
漆叶花椒
Zanthoxylum
rhoif ol ium
甲醇 S . aureus、 S .
ep id ermid is、
K lebsiella
p neumoniae、
E scherichia col i
琼脂覆盖法 6 -
acetonyld ihydronit idine
6 -
acetonyld ihydroavicine
花椒素
1. 06～3. 12
1. 06～3. 12
3. 12～12. 5
阿莫西林 0. 2
Z. r hoif ol ium 二乙醚 S . aureus、
K . pneumoniae
琼脂覆盖法 es sent ial oil of the
leaves
es sent ial oil of the
fr uit s
1. 06～12. 5
12. 5～50
阿莫西林 0. 2
匍匐枪刀药
Hypoestes
serp ens
二氯甲烷 C . cu cumerinum/
Cand id a
albicans
直接 TLC 生
物自显影
检测法/琼
脂覆盖法
fusicoserpenol A
dolabeserpenoic acid
A
—
—
咪康唑 —
近皮氏百部
Stemona
cf. p ierrei
氯仿 C . herbarum 直接 TLC 生
物自显影
检测法
百部菲 A*
百部菲 B*
百部菲 C *
百部菲 D
百部 G
百部 B
diihydropin osylvin
st ilb ene pin osylvin
10b
10b
10b
10b
10b
10b
10b
10b
　　* 新化合物或首次从该植物中分离得到的天然产物　a:新化合物点样量/抑菌斑的直径　b:薄层板上抑菌斑的大小表明其抑菌活性　—:未测定
　　* new compound or new natu ral product isolated from a plan　a: amount of new compound ch arg e on TLC plate/ inh ibitory zone diameter
b: wh ite inhibitory zones of differen t size on TLC plate indicat s degree of ant ifungal act ivity　—: not be detected
部分显紫色, 由此可区分活性化合物和非活性化合
物[ 13, 16, 17]。这是因为, 自由基清除剂或抗氧化剂可将紫色的
1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基( 2, 2-diphenyl-1-picryhydrazyl,
DPPH)转化为黄色的二苯基苦肼 ( diphenylpicrylhydrazine,
DPPH-H ) [16]。此 外, 还 可 用 B-carotene 进 行 检 测, 如
Cespedes [18]和 Tor r es[ 19]等将 0. 05%B-carotene 氯仿溶液喷
洒到待测薄层板上显色 ,用 UV254nm光照射后, 薄层板上的背
景色褪去, 活性部位仍显黄色。与此相似, Silva[ 20] 和
Corsino[ 21]等用 0. 02%B-carocene二氯甲烷溶液进行检测,仅
在自然光的照射下即可使薄层板上的背景色褪去。该方法在
天然药物化学中的部分应用情况见表 2。
4　TLC生物自显影的定量应用
TLC生物自显影不仅可用来定性测定,也可用于定量测
定。活性化合物通过 TLC生物自显影, 抑制斑点的大小通常
随点样量的增加而增大。Singh 及 Adnarayana等[ 22]通过对一
系列测量数据的统计数据处理指出, 抗生素抑制斑点的面
积/ 直径比(S / d )与药物浓度 (C)之间存在量性相关关系, 以
logC(C 为抑菌斑点上药物的浓度)为自变量, log S/ log d 为
因变量, 进行直线回归, 可得标准曲线。Ramirez等[ 3]利用
TLC 生物自显影得到了氯霉素( chlor amphenicol) ,氨苄青霉
素( ampicillin)、苯甲基青霉素 ( benzylpenicillin)、双氯青霉素
( dicloxacillin)和红霉素 ( erythomycin)的标准曲线: Y= a+ b
lnC, Y 为抑菌斑点的直径 (mm) , C为药物的质量浓度 (Lg/
mL) ,回归系数分别为 0. 998 8、0. 960 8、0. 987 3、0. 998 4 和
0. 999 9。由于Rf值的变化常会引起S / d 比产生较大的变化,
Ad-nar ayana等[ 22]提出用PRA / PRD( PRA= 抑菌斑面积/标
·135·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 36 卷第 1 期 2005年 1月
表 2　TLC自显影对具有自由基清除活性的天然产物的筛选[ 13, 16～21]
Table 2　Na tural products with f r ee r adical scavenging activity identified by TLC autography technique[ 13, 16～21]
来　源　 提取溶剂 　活性化合物 　活性 对照品　 对照品活性　
布氏 F agraea blu -
mei
甲醇 布氏灰莉苷 —
美国崖椒
Fag ara
zanthoxy loides
二氯甲烷 cis -fagaramide
t ran s-fagaramide
( + ) -sesamin
8-acetonyldihydroch elerythrine
10 Lga
10 Lga
10 Lga
10 Lga
槲黄素 1 Lga
水 薄 荷 Mentha
aqu at ica
正己烷 1, 8-cineole —
长叶荷薄 Mentha
longif olia
正己烷 menthone+ isomen th one
mixture of mono-and sesquiterpene hydrocarb on s
—
—
辣 薄 荷 Mentha
p iperita
正己烷 isomenthone
menthone
mixture of mono-and sesquiterpene hydrocarb on s
—
—
—
毛 花 Globularia
trichosantha
甲醇 毛蕊花苷
毛花球花苷 A*
草苁蓉苷 A
trich osan th oside B*
—
—
—
—
柳 叶 Polyg onum
sal icif olium
正丁醇 quer cet in -3-O-B-D-glucopyranosid e
quer cet in -3-O-B-D-galactopyranoside
quer cet in -3-O-( 2″-O-galloyl ) -B-D-glucopyranoside
quer cet in -3-O-B-D-glucu ronopyranos ide
kaempferol-3-O-B-D-glu copyranoside
kaempferol-3-O-B-D-galactopyran os ide
more
more
more
more
lower
lower
槲黄素 2～9 Lg
柄花菊 Podanthus
ovatif olius
甲醇、二氯甲
烷
deacetylovat ifolin
1, 10-epoxyovat ifol in
54. 5 Lmol/ L
62. 7 Lmol/ L
槲黄素 26. 4 Lmol/ Lb
米 氏 柄 花 菊
Podanthus
mi tiqui
甲醇、二氯甲
烷
柄花菊素
11, 13-dihydroovatifolin
—
—
线酒神菊 Bacchari s
linnearis、马吉冷酒
神菊B . magel lan -
ica、伞形酒神菊
B. umbell if or mis
二氯甲烷 10, 11-epoxy t remetone
4-hydroxy t remetone
10, 11-epoxy -4-h ydroxy tremeton e
62. 6 Lmol/ Lb
53. 2 Lmol/ Lb
30. 6 Lmol/ Lb
四羟基醌
羟基茴香醚
9. 37 Lmol/ Lb
26. 4 Lmol/ Lb
朱 鲁 艾 里 花
Iry anthera
j uruensis
正己烷 7-meth yl-sargachr omenol
马尾藻色烯醇
ep i-guaiaacin
guaiaacin
疣雅木素
蜜腺樟素 B
10 Lg
10 Lg
10 Lg
10 Lg
10 Lg
10 Lg
刺叶美登木
May tenus
aqu if olium
醋酸乙酯 ep igal locatech in
( + ) ouratea-catechin
proanthocyanidin
quer cet in 3-O-A-L-rhamnopyranosyl ( 1→ 6) -O-[B-
D-glu copyranosyl ( 1 → 3 ) -O-A-L -
rhamnopyranosyl -( 1→2) ] -O-B-D-glucopyranosyl
kaempferol 3-O-A-L-rhamnopyranosyl ( 1→6) -O-[B-
D-glu copyranosyl ( 1→3) -O-L-rhamnopyranosyl -
( 1→2) ] -O-B-D-glucopyranosyl
10 Lg
10 Lg
10 Lg
10 Lg
10 Lg
危 险 丝 兰 Yucca
p ericu losa
甲醇 雷藜芦酚
3, 5, 3′, 5′-tet rahydroxy-4-methoxy-s tilben e
25. 27 Lmol/ Lb
22. 22 Lmol/ Lb
生育酚
咖啡酸
11. 86 Lmol/ Lb
2. 13 Lmol/ Lb
　　* 新化合物或首次从该植物中分离得到的化合物　a:半数抑菌量　b: 50%抑制浓度　—:未测定
　　* new compound or new natural pr od uct isolated from a plant　a: min imum inhibitory dose　b: 50% con cent rat ion on in hibit ion　—: not
be detected
准斑面积×100, PRD= 抑菌斑直径/标准斑直径×100)代替
面积/直径, 以消除 Rf 值的影响, 在对三苯基锡类抗生素
TPTA、TPTC 和 T PTH 和 TLC 生物自显影结果进行直线
回归后, 得到回归方程: lgPRA/ lgPRD= b+ algC, 3 种抗生素
的回归系数分别为 0. 99/ 0. 99、0. 99/ 0. 99 和 0. 998/ 0. 95。
5　TLC生物自显影技术的优势和不足
与其他生物活性测定的方法相比, TLC生物自显影的优
点很多, 它无需特殊的仪器设备, 操作简单, 实验耗费低, 灵
敏度和专属性高, 生物活性的测定速度快[2, 3, 4]。并且,由于薄
层色谱展开技术的应用, TLC生物测定法不仅可对化合物的
生物活性进行测定而且对化合物的代谢产物或转化物的生
物活性也可同时进行测定。T LC生物测定法的这一特点对那
些本身无生物活性但代谢产物或转化物有生物活性的化合
物的筛选具有重要的意义。如: Sluis [ 23]等将 iridodib 和
secoir idoib 葡萄糖苷点样于薄层板后, 先用一定浓度的 B-葡
萄糖苷酶水解,然后再进行 TLC生物自显影, 由此发现了一
些具有抗菌活性的葡萄糖苷类前药。
TLC生物测定方法在应用过程中也存在一定的局限性。
例如: T LC生物自显影法对各种具有细胞毒性的化合物如喜
树碱素、quassinoid 类和木酚素类化合物不敏感,大部分的此
·136· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 36 卷第 1 期 2005年 1月
类化合物在 TLC板无法形成抑制斑点。此外, TLC生物自显
影法并不适用所有极性的化合物[9]。由于 TLC生物自显影
使用的微生物培养基一般用水作溶剂, 极性较大, 因此要求
被测化合物的极性不能太大也不能太小。极性太大, 化合物
扩散太快不易形成抑制斑点;极性太小, 化合物不易进入介
质同样不能形成抑制斑点。
6　结语
目前, 天然药物化学的研究已从单一的“化合物”模式转
向“化合物+ 生物活性”模式[1] , 因此, 快速、有效、方便的生
物活性测定技术在天然药物化学中已占有越来越重要的位
置。TLC生物自显影技术已经发展了几十年, 是一个相对比
较成熟的技术,与其他活性试验方法配合使用, 可对化合物
的活性进行准确的评估, 由于它还具有操作简单、测定速度
快等优点, 因此, 它是一种非常适合于在天然药物化学实验
室开展的生物活性测定方法。T LC生物自显影技术的应用空
间很大, 其起初主要用于对具有抗菌/真菌化合物的筛选, 后
来发展到对自由基清除剂及抗氧化剂、胆碱酯酶抑制剂的筛
选, 相信随着天然药物化学与其他相关学科的相互渗透, 其
用途还会更加拓宽。
Refer ences:
[ 1]　Phill ipson J D. 50 Years of medicin al plant research—every
progress in methodology is a progress in science [ J ] . P lanta
Med , 2003, 69( 6) : 491-495.
[ 2]　Choma I, Grenda D, Malinowsk a I, et al . Determinat ion of
flumequine and doxycycline in milk by a s imple thin -layer
chr omatographic method [ J ] . J Chromatogr B, 1999, 734
( 1) : 7-14.
[ 3]　Ramirez A, Gut ierrez R, Diaz G, et al . High -performance
thin-layer ch romatography-bioautography for mult iple
an tib iot ic residu es in cows milk [ J ] . J Chr omatogr B , 2003,
784( 2) : 315-322.
[ 4]　Rhee I K, van de Meent M , In gkan inan K, et al . Scr eening
for acetylcholinesteras e in hibitors from Amar yl lidaceae us ing
sil ica gel thin-layer chromatography in comb inat ion with
bioact ivity s taining [ J] . J Chromatogr A, 2001, 915 ( 1-2) :
217-223.
[ 5]　Choma I M , Choma A, Stas zczuk K. Determin at ion of
flumequine in milk b y thin -layer chr omatography-
bioau togr aphy [ J] . J L iq Chrom Rel Technol , 2002, 25( 10/
11) : 1579-1587.
[ 6]　Wedge D E, Gal indo J C, Macias F A. Fungicidal act ivity of
natu ral and synthet ic sesquiterpene lactone analogs [ J] .
Phytochemist ry, 2000, 53( 7) : 747-757.
[ 7]　Jassb i A R, Zaman izadehnajari S, Azar P A, et al . Ant ibac-
terial diterpenoids from Astrag alus brachystachys [ J] . Z
N aturf or sch , 2002, 57( 11-12) : 1016-1021.
[ 8]　Dellar J E, Cole M D, Waterman P G. Ant imicrobial abietane
diterpenoids from Plectr anthus eleg ans [ J] . Phytochemist ry,
1996, 41( 3) : 735-738.
[ 9]　Wedge D E, Nagle D G. A new 2D-TLC b ioautography
meth od for th e discovery of novel anti fun gal agents to cont rol
plant pathogens [ J] . J N at Pr od , 2000, 63( 8) : 1050-1054.
[ 10]　Rasoamiaranjanahary L, Mar ston A, Gui let D, et al .
Ant ifungal diterpen es from Hypoestes serp ens ( Acanthaceae)
[ J] . Phytochemist ry , 2003, 62( 3) : 333-337.
[ 11]　Mackeen M M, Ali A M , Lajis N H, et al . Ant ifungal
gar cinia acid esters from the fr uit s of Garcinia atr oviridi s [ J] .
Z Naturf orsch, 2002, 57( 3/ 4) : 291-295.
[ 12]　Meepagala K M , Kuh ajek J M, Stu rtz G D, et al . Vulgarone
B, the ant ifungal cons tituent in the steam-dis til led fract ion of
Artemisia douglasiana [ J] . J Chem E col , 2003, 29( 8) : 1771-
1780.
[ 13]　Chaaib F, Queiroz E F, Ndjok o K, et al . Ant ifungal and ant i-
oxidant compounds from the r oot bark of Fag ara
zanthoxy loides [ J] . Planta Med , 2003, 69( 4) : 316-320.
[ 14]　Wil liams L A, Vasqu es E, Reid W, et al . Biological act ivit ies
of an ext ract from Cleome viscosa L. ( Capparaceae) [ J] .
N aturwissenschaf ten, 2003, 90( 10) : 468-472.
[ 15]　Marston A, Kiss ling J, Hostet tmann K. A rapid TLC
bioau tographic method for the d etect ion of
acetylcholinesteras e and butyrylcholinesteras e inhibitors in
plants [ J] . Phytochem Anal, 2002, 13( 1) : 51-54.
[ 16]　Mimica-Dukic N, Bozin B, Sokovic M, et al . Ant imicrobial
an d ant ioxidant activit ies of three Mentha sp ecies ess ent ial oil s
[ J] . Planta Med , 2003, 69( 5) : 413-419.
[ 17]　Calis I, Kirm izibekmez H, Ru egger H , et al . Ph enylethanoid
glycos ides from Globularia trichosantha [ J] . J N at P rod ,
1999, 62( 8) : 1165-1168.
[ 18]　Cespedes C L , Uchoa A, Salazar J R, et al. Plan t growth
inhibitory act ivity of p-hydroxyacetophen on es and t remetones
fr om Chilean end emic, Bacchari s species and some an alog ou s:
a compar at ive stud y [ J ] . J Ag ric F ood Chem, 2002, 50( 8) :
2283-2292.
[ 19]　Torres P, Avila J G, Romo de Vivar A, et al . Ant ioxidant
an d insect growth regulatory act ivit ies of st ilbenes and
ext ract s from Yucca p ericulosa [ J] . P hy tochemistry , 2003, 64
( 2) : 463-473.
[ 20]　Silva D H, Pereira F C, Zanoni M V, et al . Lip ophyllic ant i-
oxidants fr om I ryanthera juruensi s fruit s [ J ] . P hy tochemis-
try, 2001, 57( 3) : 437-442.
[ 21]　Corsin o J, Silva D H, Zanon i M V , et al. Ant iox idan t flavan-
3-ols and flavonol glycosides from Maytenus aquif olium [ J] .
Phytother Res, 2003, 17( 8) : 913-916.
[ 22]　Adinarayana M, Singh U S, Dwivedi T S. A biochr omato-
graphic technique for the quant itat ive est imat ion of t riphen yl-
t in fung icides [ J] . J Chromatog r, 1988, 435( 1) : 210-218.
敬　告　读　者
　　《中草药》杂志编辑部尚存部分过刊合订本, 包括: 1974-1975年、1976年、1979年、1985-
1994年( 80 元/年) , 1995- 1997年 ( 110元/年)、1998 年( 120 元/年)、1999年 ( 135 元/年)、
2000 年( 180元/年)、2001- 2003 年( 200 元/年)、2004年( 220元/年) ; 1996年增刊( 50 元)、
1997 年增刊( 45元)、1998年增刊( 55元)、1999年增刊( 70元)、2000年增刊( 70元)、2001年
增刊( 70元)、2002年增刊( 65元)、2003年增刊( 65元)、2004年增刊( 65元)。欢迎订购。
电话: ( 022) 27474913; ( 022) 23006821(传真)。
·137·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 36 卷第 1 期 2005年 1月