全 文 ：中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月
独角莲水提取物对肝癌细胞SMMC一7721基因表达的影响
王顺启1一，倪虹1，王同顺1，陈力1+
(1．南开大学生命科学学院，天津300071；2．南昌大学生命科学学院，江西南昌330047)
独角莲是一味传统中药，在中医临床中被广泛
用于治疗多种恶性肿瘤疾病，显示出较好的临床疗
效。不仅动物模型的研究显示独角莲可明显抑制肿
瘤生长口’2]，研究还发现独角莲具有阻滞肝癌细胞
SMMC一7721生长于S期，并诱导肿瘤细胞发生凋
亡[3]。为进一步研究独角莲这一作用的分子机制，本
实验利用肝癌cDNA抑制性消减文库构建的肝癌
相关基因微阵列，对独角莲作用于肝癌细胞
SMMC一7721后基因表达的变化进行了探讨。
1材料与方法
1．1 药材及其处理：本实验所用药材为河北迁西人
工种植。一年生根茎，经本室陈瑞阳教授鉴定为天南
星科犁头尖属植物独角莲Typhoniumg ganteum
En91．的根茎。新鲜独角莲根茎洗净去皮，切成厚度
lmm左右的薄片，20～30℃阴干，粉碎后用研钵
研成粉末。用双蒸水配成30g／L的水溶液，液面上
部充N。密封，4℃浸泡1个月。0．22／xm微孔滤膜
滤过，4℃保存备用。
1．2 细胞培养：肝癌细胞系SMMC一7721由天津市
第三中心医院朱争艳医师惠赠。细胞培养用DMEM
培养基(购自美国Gibco公司)，含10％胎牛血清
(购自天津TBD公司)，100mg／L链霉素(购自美
国HyClone公司)，1．0x105U／L青霉素(购自美
国HyClone公司)；于37℃、5％CO。进行细胞培
养。细胞以5×105～6×105／mL密度接种于75cm2
的细胞培养瓶(购自挪威NUNC公司)，每瓶27
mL细胞悬液，预培养12h后，对照组细胞每瓶加
入3．0mL灭菌双蒸水，加药组细胞每瓶加入30g／
L的独角莲水提取物3．0mL(前期研究表明此剂
量作用明显)。继续培养36h，提取两组细胞的
RNA。
1．3微阵列膜制备
1．3．1微阵列设计：本实验室前期构建了肝癌组织
相对于癌旁组织的cDNA抑制性消减文库[4]，取其
中504个为检测基因，另设1个参考点(GAPDH
基因)，共计505个点。
1．3．2微阵列制作：使用自行开发的Microarray
Ⅲ型点样仪(专利号：1322609)制作微阵列(膜尺
寸：2．7cm×3．6cm)。
1．4探针制备
1．4．1RNA提取：依照TRIz01试剂(购自美国
Invitrogen公司)的方法提取细胞RNA。并分别利
用2．o％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测
RNA的完整性及质量。
1．4．2 mRNA纯化：按mRNA纯化试剂盒
(PolyATtract@mRNAIsolationSystems噩，购自
美国Clontech公司)的说明书进行。纯化后用紫外
分光光度计检测mRNA浓度，并计算mRNA
产率。
1．4．3 反转录：取2弘gmRNA加入1肛LOligo
(dT)，。(1pg／弘L，购自上海生工生物公司)，按照
AMV反转录酶(购自美国Promaga公司)的说明
进行反转录。
1．4．4探针标记：取3弘LcDNA加入3pLddH20
混合，95℃热变性5min，然后立即冰浴3min。加
入3肛LRPMix(购自美国Clontech公司)，1弘L
Klenow酶(4U／,uL，购自美国Clontech公司)，于
37℃水浴过夜。
1．5微阵列膜杂交、洗涤、显影
1．5．1 杂交：65℃预杂交30min，加入探针于
65℃杂交16h。
1．5．2 洗涤：2×SSC／0．5％SDS和0．2×SSC／
0．5％SDS各洗2次，TNT溶液洗1次。
1．5．3显影：加封阻液37℃温浴30min；加入抗
体(购自美国Roche公司)37℃温浴30min；
TNT溶液洗2次；加显色剂(购自美国Roche公
司)显色2h；显色结束用1×PBS终止反应。
1．6 图像分析：将微阵列杂交膜上的杂交信号扫描
收稿日期：2005—12—03
基金项目：天津市科委重点基金项目(003803411)
作者简介：王顺启(1978一)，男，博士，讲师，主要从事天然药物抗癌机制研究。
*通讯作者陈力Tel：(022)23500208Fax：(022)23497010E—mail：lichenl6@eyou．corn
万方数据
中草菊cMn髓eTraditionaludHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月·1385·
入计算机，用软件Chip一8．25对杂交信号结果进行
数字化检测与分析。
2结果
2．1 RNA及mRNA质量：用2．ooA琼脂糖凝胶
电泳检测表明RNA质量很高。如图1所示，28S与
18S能够达到2：1，5S比较弱，mRNA比较完整。
RNA、mRNA在260、280nm的吸光度(A)比值
比较理想(RNAA260。。／A280。=2．0，mRNA
A260。／A280。一2．o)；mRNA产率4．o％。
1一AEoTGEeffectgroup
2-controlg up
圈1 RNA的琼脂糖凝胶电泳圈
Fig．1Agar惦eg lelectrophoretrogramofRNA
2．2微阵列稳定性验证：将肝癌细胞系SMMC一
7721细胞培养36h后提取的mRNA反转录为
cDNA，利用随机引物法检测记cDNA为检测探针，
随后与两张微阵列膜进行平行杂交，微阵列杂交结
果如图2所示。在对数据进行分析时，分别以相对灰
度值相差1．5、2．0、2．3、3．0倍为评判阳性标准，对
所构建的微阵列膜的稳定性(假阳性率)进行统计
(表1)。
图2微阵列膜平行杂交
Fig．2Parallelhybridizationonmicroarraymembrane
表1不同标准下的假阳性率
Table1 Falsepositiverateunderdifferentstandards
2．3杂交结果：将培养36h后的对照组细胞和独
角莲组细胞的mRNA分别反转录成cDNA后，用
随机引物标记法进行标记，分别与微阵列膜杂交，进
洗膜和显色反应。其杂交结果如图3所示。将重
复杂交实验结果进行数据分析，以基因表达变化在
2．3以上为差异表达的标准；比较两次数据，当两次
杂交实验中差异都在2．3以上时假阳性率降低至
不足0．06％(2．38％×2．38％)。此时的结果表明：
共有18个基因的表达发生明显变化，其中16个基
因表达上调，2个基因表达下调。具体基因及其相关
功能如表2所示。
图3肝癌细胞cDNA与微阵列膜杂交
Fig．3Hybridizationonmieroarraymembrane
byhepatocarcinomacellscDNA
表2独角莲提取物作用肝癌细胞SMMC-7721
36h后差异表达的基因
Table2 DifferentiallyexpressedgenesinSMMC一7721
cellstreatedbyT．giganteumextractfor36h
克隆编号 基因名称 表达变化
万方数据
·1386· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月
3讨论
3．1 肝癌相关基因微阵列：本实验所用肝癌相关基
因微阵列的支持载体为尼龙膜，与目前商售基因微阵
列(高密度的又称基因芯片)相比，具有成本低廉，操
作与检测简单，不需要昂贵的荧光分析系统等优点。
目前商售基因芯片主要以密度差异2倍为基因差异
表达的标准，差异大于2倍的基因被认为表达水平是
有明显差异的。本研究所用微阵列的假阳性率如表1
所示，当差异倍数为2．0时，假阳性率为3．37％，略
高于商售芯片的假阳性率(≤3％)Is]。当差异倍数定
为2．3时，假阳性率为2．38％，低于文献通常报道的
2．5％的假阳性率。多次实验结果表明假阳性点的出
现具有随机性，两次重复试验假阳性率不到0．06％，
可确保差异表达基因的结果可靠。
3．2独角莲作用后表达下调的基因：微粒体环氧化
物酶(microsomalepoxidehydrolase，mEH)是下
调基因中的一个。mEH是癌变的诱因之一：在原发
性肝癌细胞培养中mEH水平受普通化学诱导的影
响；在啮齿动物中，原发性化学物可诱导mEH的高
表达；在敲除mEH的动物模型实验中，致癌物对动
物的致癌性明显减弱[6]。mEH底物广泛，参与化学
致癌剂、诱变剂及抗癌药物的代谢，与癌细胞的抗药
性有关，表达下调可增加癌细胞对抗癌药物的敏感
性，增强抗癌药物对癌细胞的生长抑制作用[6’7]。
另一个下调的基因是造血干细胞相关基因126
(hematopoiticstemandprogenitorcell126，HSPC
126)，该基因是研究造血干细胞时分离出来的，其具
体功能还有待进一步的研究。
3．3独角莲作用后表达上调的基因：上调基因中的
部分属于急性期反应蛋白，如纤维蛋白原(7多肽)，
血清淀粉样蛋白A，血清淀粉样蛋白A1，补体因子
B等，这些蛋白的上调是细胞培养时加入异源物质
后，细胞应答的一种表现。
上调基因中的部分属于能量代谢相关基因，主
要是线粒体相关的许多基因。线粒体上的呼吸链和
磷酸化系统由5个复合体构成：NADH泛醌／辅酶
Q氧化还原酶，琥珀酸盐／琥珀酸脂辅酶氧化还原
酶，辅酶细胞色素C氧化还原酶，细胞色素C氧化
酶和ATP合成酶；每一个复合物由多个酶体亚单
位构成[8]。其中有多个复合体的亚单位的基因表达
上调，推测是由于独角莲将肝癌细胞阻抑在细胞周
期的S期[3]，细胞需要较多能量用于合成代谢所致。
Cu／Zn超氧化物歧化酶表达升高可能与氧化代谢
旺盛产生大量氧自由基有关[9]。
上调基因中的部分属于蛋白代谢相关基因，如
与蛋白质降解相关的蛋白酶体亚单位a，与Fe代
谢、血红蛋白代谢及抗缺氧相关的铁蛋白重链多肽，
与蛋白质合成相关的真核转译延伸因子1等。这些
基因的上调与独角莲阻滞癌细胞生长于S期具有相
关性。
独角莲在将肝癌细胞阻抑在S期的同时，还诱
导了细胞凋亡的发生[3]。本研究中发现与代谢相关
多个基因表达升高，如细胞色素C氧化酶Ⅲ等，推
测独角莲阻滞肝癌细胞于细胞周期S期和诱导肝癌
细胞凋亡之间存在两种可能：一是将肿瘤细胞阻抑
在S期，延长了DNA检查和修复时间，启动细胞凋
亡机制；另一种可能是由于细胞被阻滞在S期后，代
谢相关基因的长时间高表达，细胞内氧化损伤加重，
引起细胞凋亡机制的激活。这些推测还需要今后进
一步的研究给予验证。
独角莲诱导一些基因表达上调的同时，还抑制
了一些基因的表达，这为独角莲影响肝癌细胞的多
基因表达提供了有力证据；独角莲作用肝癌细胞
SMMC一7721后，肝癌细胞生长被阻滞于S期，并被
诱导发生细胞凋亡[3]，与本研究中发现的基因表达
改变具有密切关系。本研究中发现的这些差异表达
基因不仅为今后进一步研究独角莲作用肝癌细胞的
分子机制提供了具体的线索；而且还可将这些差异
表达的基因作为独角莲作用的效应基因，用于独角
莲有效成分的筛选鉴定研究。
References：
E1]SunSF，ZengY，ZhaoWC．Studiesontherestrainof
Typhoniumg ganteumEngltomalignanttumorsEJ]．Tradit
ChinMedRes(中医研究)，1998，11(6)：8-10．
[2]YinJY，PuCJ，YangJZ，ela1．Studiesontherestrainof
YuBaiFu(TyphoniumgiganteumEn91)totumors(I)[J]．
JChangchunCollTraditChinMed(长春中医学院学报)，
2000，16(2)：52—53．
[3]WangSQ，NiH，WangJ，eta1．Studiesontheproliferation
restrainofTyphoniumg ganteumEngltoHepatocarcinoma
CellSMMC一7721口]．ChineJCellB ol(细胞生物学杂志)，
2003，25(3)：185—188．
[4]WangSQ，FengZN，LiuGH，eta1．Generationand
analysisofadifferentiallyexpressgenescDNAlibraryof
humanprimaryhepatocellularcarcinomal口]．ActaSciNat
UnivNankai：NatSci(南开大学学报：自然科学版)，2005，
38(4)：115-118．
[5]LiY，QiuMY，WuCQ，eta1．Detectionofd fferentially
expressedgenesinhepatocellularcarcinomausingDNA
microarray口]．ActaGenetSin(遗传学报)，2000，27(1z)：
1042—1048．
[6]FretlandAJ，OmiecinskiCJ．Epoxidehydrolases：bioche—
mistryandmolecularbiologyI-J]．ChemBiolInteract，2000，
129(1—2)：41—59．
[7]MurrayGI，PatersonPJ，WeaverRJ，eta1．Theex—
pressionof cytochromeP一450，expoxidehydrolaseand
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月
glutathioneS-transferaseinhepatocellularcarcinomaEJ]．
Cancer，1993，71(1)：36—43．
[8]HyslopSJ，DuncanAM，PitkanenS，eta1．Assignmentof
thePSSTSubunitGeneofHumanMitochondrialComp exI
toChromosome19p13I-J]．Genomics，1996，37(3)：375—
380．
[93YooHY，ChangMS。RhoHM．Heavymetal—mediated
activationoftheratCu／Znsuperoxided smutasegenvia
metal—responsiveelement口]．MolGenGenet，1999，262
(2)：310-313．
参麦注射液对休克大鼠肝脏I-xBa和白细胞介素一18
mRNA表达的影响．
刘淑杰1，李洪岩2，吕文伟3，袁兆新2，孙连坤2+
(1．白求恩医科大学制药厂，长春吉林130012；2．吉林大学基础医学院病理生理学教研室，吉林长春130021；
3．吉林大学基础医学院药理学教研室，吉林长春130021)
肠黏膜在机体受到如失血性休克等严重损伤
时，正常的机械屏障结构或功能受损造成细菌移位，
细菌和毒素通过门脉循环后，首先损伤肝细胞，引起
肝组织严重损伤和功能障碍[1]。
人参和麦冬是我国经典中药，对机体有着明显的
保护作用，具有毒性低等特点，较易进入组织发挥作
用。近些年的研究发现人参和麦冬合剂具有提高机体
免疫力、降低血脂、保护细胞的功能。本实验建立大鼠
“双击”模型(失血性休克+内毒素)，藉以模拟临床
中病人失血性休克后发生的细菌移位过程，通过测定
血清中NO和一氧化氮合酶(NOS)水平和肝组织
中I—KBa和白细胞介素一18(IL一18)mRNA的表达，
探讨参麦注射液的抗休克作用及其机制。
1材料与方法
1．1试剂与仪器：参麦注射液(正大青春宝制药有
限公司生产，批号031236)；大肠杆菌内毒素(LPS)
购于Sigma公司，血清型Om：B4，用生理盐水配
制。PCR相关试剂均购于Takara公司。
1．2实验动物分组及模型复制：健康Wistar大鼠，
由吉林大学基础医学院动物室提供，体重(250士
10)g，雌雄不拘，随机分为对照组，模型组，参麦注
射液大、小剂量(14．4、7．2mg／kg)组，每组各
5只。
大鼠用水合氯醛(350mg／kg)ip麻醉，手术分
离气管并插管，分离左侧颈总动脉，连接四导生理记
录仪(日本光电公司)记录平均动脉血压(MAP)，
分离左侧股动脉，连接放血插管。复制失血性休克模
型，10～15min内经股动脉放血使MAP维持在40
收稿日期：2006—01—10
作者简介；刘淑杰(1964～)，女，高级工程师，主要从事药物研究。
*通讯作者孙连坤E—mail：sunlk@jlu．edu．cn
mmHg，10min内血压不回升，失血性休克模型建
立，称为“第一次打击”。随即经舌下ivLPS1．5
mg／kg，称为“第2次打击”。参麦注射液组在模型建
立后舌下iv给予参麦注射液，剂量分别为7．2、
14．4mg／kg。4h后处死动物，取血分离血清，并采
集肝脏组织冻于液氮。实验过程中动态观察并记录
血压变化。
1．3 血清NoS活性及No水平的测定：按NOS、
NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所提供，
批号20030813、20030829)方法操作。
1．4肝脏组织I—KBa和IL一18mRNA的检测：参
照UltraspecTM一ⅡRNAIsolationSystem(Biotecx
Laboratories，INC)说明提取肝脏总RNA，逆转录
成cDNA，进行PCR反应。I—KBa引物序列为正义
链：5’GACGAGGATTACGAGCAGAT3’，反义链：
5
7GACGAGGATTACGAGCAGAT37，PCR循环
条件为变性94℃、30S；退火56℃、30S；延伸
72℃、45S。共35个循环，PCR产物为634bp。IL一
18引物序列为正义链：57一TGGAGACTTG—
GAATCAGACC一37，反义链：5-GGCAAGCTA—
GAAAGTGTCCT一37，PCR循环条件为变性94℃、
60S；退火56℃、60S；延伸72℃、60S，共35个循
环，PCR产物为395bp。GAPDH引物序列为正义
链： 57GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT37，
反义链：5’AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAA—
GTC37，PCR循环条件为变性94℃、30S；退火
58℃、30S；延伸72℃、60S，共25个循环，PCR产
物为700bp。
万方数据
独角莲水提取物对肝癌细胞SMMC-7721基因表达的影响
作者： 王顺启， 倪虹， 王同顺， 陈力
作者单位： 王顺启(南开大学生命科学学院,天津,300071;南昌大学生命科学学院,江西,南昌,330047)
， 倪虹,王同顺,陈力(南开大学生命科学学院,天津,300071)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(9)
被引用次数： 3次

参考文献(9条)
1.Sun S F;Zeng Y;Zhao W C Studies on the restrain of Typhonium giganteum Engl to malignant tumors[期
刊论文]-中医研究 1998(06)
2.Yin J Y;Pu C J;Yang J Z Studies on the restrainof Yu Bai Fu (Typhonium giganteum Engl) to tumors
(1) 2000(02)
3.Wang S Q;Ni H;Wang J Studies on the proliferation restrain of Typhonium giganteum Engl to
Hepatocarcinoma Cell SMMC-7721[期刊论文]-细胞生物学杂志 2003(03)
4.Wang S Q;Feng Z N;Liu G H Generation and analysis of a differentially express genes cDNA library
of human primary hepatocellular carcinomal[期刊论文]-南开大学学报(自然科学版) 2005(04)
5.Li Y;Qiu M Y;Wu C Q Detection of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma using
DNA microarray[期刊论文]-遗传学报 2000(12)
6.Fretland A J;Omiecinski C J Epoxide hydrolases:biochemistry and molecular biology[外文期刊]
2000(1-2)
7.Murray G I;Paterson P J;Weaver R J The expression of cytochrome P-450,expoxide hydrolase and
glutathione S-transferase in hepatocellular carcinoma[外文期刊] 1993(01)
8.Hyslop S J;Duncan A M;Pitkanen S Assignment of the PSST Subunit Gene of Human Mitochondrial
Complex I to Chromosome 19 p13[外文期刊] 1996(03)
9.Yoo H Y;Chang M S;Rho H M Heavy metal-mediated activation of the rat Cu/Zn superoxide dismutase
gene via a metal-responsive element[外文期刊] 1999(02)

本文读者也读过(10条)
1. 王顺启.倪虹.王娟.陈力 独角莲对肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖抑制作用机理的研究[期刊论文]-细胞生物学杂
志2003,25(3)
2. 张春兰 独角莲块茎提取液抗肿瘤活性的初步研究[学位论文]2009
3. 王林美.叶博.赵振军.李树英.WANG Lin-mei.YE Bo.ZHAO Zhen-jun.LI Shu-ying 独角莲抑制乳腺癌MCF-7细胞
增殖和诱导凋亡的作用研究[期刊论文]-沈阳农业大学学报2009,40(2)
4. 王顺启.倪虹.程华.王广良.王同顺.陈力 mRNA差异显示法比较独角莲作用肝癌细胞SMMC-7721前后的基因表达
[期刊论文]-中国中药杂志2004,29(10)
5. 朱俊德.余资江.龚明 高效液相色谱法测定独角莲膏中连翘苷的含量[期刊论文]-四川解剖学杂志2010,18(1)
6. 王顺启 独角莲对肝癌细胞系SMMC-7721细胞作用机理的研究[学位论文]2004
7. 段玉敏.刘书鑫.张洪娟.谷长秀 独角莲乙醇提取物体外抗肿瘤实验研究[期刊论文]-中医药学报2010,38(3)
8. 张洪娟.张妍妍.隋军.徐鹏 不同产地独角莲药材中肉桂酸的含量测定[期刊论文]-时珍国医国药2009,20(5)
9. 陈元 白附子治疗脑胶质瘤体会[期刊论文]-中国中医药信息杂志2007,14(1)
10. 胡长效.朱静.孙晓静 独角莲的化学成分及药理作用研究进展[期刊论文]-农业与技术2007,27(2)

引证文献(4条)
1.李庆勇.王春成.宋瑱.曲震寰.姜春菲.邱伟 独角莲超临界萃取物的GC-MS分析及体外抑瘤活性[期刊论文]-植物研
究 2011(1)
2.石宝俊.姜洪芳.赵伯涛.张卫明 独角莲水溶性成分研究[期刊论文]-中国野生植物资源 2010(6)
3.王林美.叶博.赵振军.李树英 独角莲抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导凋亡的作用研究[期刊论文]-沈阳农业大学
学报 2009(2)
4.江旭东.张义英.李晶.张涛.王国才.刘伟新 独角莲醇提液对H22荷瘤鼠的抑瘤及抗氧化作用[期刊论文]-中国老年
学杂志 2012(7)


本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200609041.aspx