全 文 ：·272· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月
(250mmX4．6mm，5肚m)，ShimadzuVP一0DS
(250mm×4．6ram)，DiamonsilTMC18(250mm×
4．6mm，5弘m)色谱柱，结果显示ShimadzuVP一
0DS(250mm×4．6ram)柱能够将药材各组分峰很
好地分开，达到比较理想的效果。
3．5 由生成指纹图谱可以看出，14批防己药材指
纹图谱中主要色谱峰的整体图貌基本一致。同时相
似度评价结果表明，同一基地和不同产地的相似度
计算结果均在0．9以上，相似度较高，说明地域性差
异不明显。利用药典委员会颁布的指纹图谱软件，能
够很好地对防己药材指纹图谱进行相似度评价。
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青牛胆SRAP标记反应体系的建立与优化
杨 兵，王天志。，罗 禹，陈 璐
(四川大学华西药学院，四J『『成都 610041)
摘要：目的为青牛胆的物种鉴定和遗传图谱的构建寻找一种新的途径。方法采用序列相关扩增多态性(Se—
quencerelatedamplifiedpolymorphism，SRAP)技术对青牛胆DNA进行PCR扩增，逐级优化反应参数。结果优
化得到稳定重复性好的青牛胆SRAP反应体系。结论SRAP技术在分子水平上对青牛胆进行鉴定是一种行之有
效的手段，为今后进一步的青牛胆物种鉴定、遗传图谱的构建等研究奠定基础。
关键词：青牛胆；SRAP；分子标记
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)02—0272—04
EstablishmentandoptimizationofSRAPreactionsysteminTinosporasagittata
YANGBing，WANGTian—zhi，LUOYu，CHENLu
(WestChinaSchoolofPharmacy，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)
Abstract：ObjectiveTodevelopanewmethodforTinosporasagittataspeciesdentificationand
geneticmapconstruction．MethodsSequence——relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)wasappliedfor
T．sagittatatOcarryonPCRamplificationofitsDNAandoptimizethereactionparametergradebygrade．
ResultsThestableandreproducibleSRAPr actionsystemofT．sagittatahasbeendeveloped．Conclu．．
sionSRAPisaneffectivemethodf rT．sagittataidentificationinmoleculardeg eeandithasetupa
foundationforthefurtherspeciesdentificationandgeneticmapconstructionofT．sagittata．
Keywords：Tinosporasagitt ta(Oliv．)Gagnep；sequence—relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)；
mo】ecularm ker
青牛胆Tinosporasagittata(()liv．)Gagnep是
防己科青牛胆属植物，药用其块根，又称金果榄，为
《中国药典》历版所收载。有清热解毒、利咽止痛等功
效。目前药用青牛胆为野生，复杂的野外环境造成其
植株的形态变异。本课题材料采自四川巴中地区，其
植株形态差异极大。因此，从分子水平对青牛胆进行
物种鉴定以控制其药材质量变得日益重要。SRAP
(sequencerelatedamplifiedpolymorphism，序列相
关扩增多态性)是由Li等n3提出的一种新的分子标
记技术。SRAP标记是针对基因外显子中GC丰富
而启动子、内含子里AT丰富的特点来设计引物进
行PCR扩增，因不同个体的内含子、启动子与间隔
收稿日期：2006—08—08
作者简介：杨兵(1981一)，男，四川遂宁人，生药学研究生在读，主要从事天然药物品质评价与化学成分研究。
E—mail：only—miracle@tom．corn
*通讯作者王天志Tel：(028)85503639
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·273·
区长度不等而产生多态性。具有简便、稳定、中等产
率、在基因组中分布均匀的特点，适合于遗传多样性
研究、遗传图谱构建、基因定位、预测杂种优势、cD—
NA指纹图谱等诸多研究领域[2]。目前已应用于棉
花‘引、小麦‘4|、辣椒‘53等作物，而在药用植物中的应
用研究较少。本实验以青牛胆为材料，对反应程序、
模板、Mg抖、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶浓度，预
变性，延伸时间等的最佳反应条件进行探索，力求建
立适用于青牛胆的SRAP反应体系，从而为利用
SRAP标记技术进行物种遗传变异分析和构建遗传
图谱奠定基础。
1材料与方法
1．1材料：青牛胆采自四川巴中地区，经四川大学
华西药学院王天志教授鉴定。新鲜嫩叶经变色硅胶
快速干燥冰冻保存备用。
加拿大哥伦比亚大学提供的SRAP引物序列
在TaKaRa公司合成，10倍Buffer(M92十free，即不
含M92+)、M92+、dNTP和Taq酶均购自TaKaRa
公司，Rnase(RNA裂解酶，购自Sigma公司)。
高速离心机(BIOFUGE，Heraeus)，PCR仪
(BIO—RAD，icycler)，DYY一Ⅲ12B型三恒多用电泳
仪(北京六一仪器厂)，凝胶成像分析系统(BIO—
RAD)。
正向引物ME2，5I-TGAGTCCAAACCGGA—
GC一37；ME5，5-TGAGTCCAAACCGGAAG一37。反
向引物EM3，5’一GACTGCGTACGAATTGAC一37；
EM4，5-GACTGCGTACGAATTTGA一37；EM6，
57一GACTGCGTACGAATTGCA一37。
1．2 青牛胆总DNA的提取及定量：CTAB法提取
总DNA，取约100mg冷冻的青牛胆嫩叶快速研成
细粉，转移至1．5mL离心管中加入700弘LCTAB
液，振荡混匀，放置在65℃金属浴保温20rain，加
入等体积的氯仿一异戊醇(24：1)，抽提两次，1000
r／min离心10min，将上层水相转移至另一洁净离
心管中，加人等体积的无水乙醇混匀，一20℃沉淀
30rain，取出样品在室温下8000r／min离心5rain，
使DNA附于管底，去上清液，空气干燥，加入100
弘LddH20、2肛LRnase，36℃保温30rain，4℃保存
备用。取10弘L，1．0％琼脂糖凝胶电泳，紫外下凝胶
成像，并用荧光定量分析软件totallabv2．01测定所
提DNA的质量浓度约为10ng／弘L。
1．3 SRAP—PCR反应程序的优化：参考Li等[1]的
扩增程序：94℃预变性5rain、94oC变性1rain、35
℃复性1rain、72℃延伸1min、5个循环；94℃变性
1min、50oC复性1min、72℃延伸1min、35个循
环，且参考本实验室的条件：终浓度为0．2mmol／L
的10倍Buffer(M92+free)2．5肛L，2mmol／L的
M92+2弘L，0．2mmol／L的dNTP2弘L，1／,mol／L
的引物各1弘L，2．0UTaqDNA聚合酶0．4pL，模
板1弘L，ddH。0补足25弘L反应体系在Bio—RAD
基因扩增仪上进行反应程序优化。
1．3．1 引物筛选：用本实验室现有的引物组合
ME2一EM3、ME2一EM4、E2一EM6、ME5一EM4、ME5一
EM6在上述条件下进行引物筛选，结果见图1，选
择组合ME2一EM4进行反应体系优化。以上述体系
为基础，按以下顺序逐级优化反应参数，选择优化出
的最佳参数做下一个参数优化。
1．3．2模板浓度优化：每反应含模板DNA量分别
为5、10、20、30、50、70ng(图2)。
1．3．3’M92+浓度优化：每反应M92+终浓度分别为
0．5、1．0、2．0、2．5、3．0、5．0mmol／L(图3)。
1．3．4dNTP浓度优化：每反应dNTP终浓度分别
从左至右依次为：ME2一
EM3、ME2一EM4、。ME2一
EM6、ME5一EM4、ME5一
EM6。Marker
FromlefttOright：ME2一
EM3，ME2一EM4，ME2一
EM6，ME5一EM4，ME5一
EM6，andMarker
图1引物筛选
Fig．1Primersieving
从左至右依次为：Marker，
5、10、20、30、50、70ng
FromlefttOright：Mark—
er，5，10，20，30，50，
and70ng
图2模板浓度的影响
Fig．2Templateconcentration7Simpact
从左至右：0．5、1．0、2．0、
2．5、3．0、5．0mmol／L，
Marker
Fromleftoright：0．5，
1．0，2．0，2．5，3．0，and
5．0mmol／L，andMarker
图3 M92+浓度的影响
Fig．3M92+Concentration’simpact
万方数据
·274· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月
为0．05、0．1、O．2、0．25、0．3、0．5mmol／L(图4)。
1．3．5 引物浓度优化：每反应引物终浓度分别为
0．5、1．0、1．5、2．0、3．0、5．0t_￡mol／L(图5)。
1．3．6Taq聚合酶浓度优化：每反应酶终浓度分别
为0．5、1．0、1．5、2．0、4．0U(图6)。
1．3．7预变性时间及延伸时间的考察：预变性时间
分别为1．0、2．0、3．0、4．0、5．0min(图7)；延伸时间
分别为1．0、3．0、5．0、7．0、10．0min(图8)。
1．4扩增产物电泳分析：在1．4％的琼脂糖凝胶中
分离扩增产物，电泳结束后在凝胶成像系统下成像。
从左至右：0．05、0．1、0．2、
0．25、0．3、0．5mmol／L，
Marker
Fromlefttoright：0．05，
0．1，0．2，0．25，0．3，and
0．5mmol／L，andM[arker
图4 dNTP浓度的影响
Fig．4dNTPConcentration7simpact
从左至右：1．0、1．5、2．0、
3．0、0．5、5．0tlmol／L，
Marker
Fromleftoright：1．0，
1．5，2．0，3．0，0．5，and
5．0／』mol／L，andM rker
图5引物浓度的影响
Fig．5Primerconcentration7Simpact
从左至右依次为：Marker，
0．5、1．0、1．5、2．0、4．0U
Fromlefttoright：Mark—
er，0．5，1．0，1．5，2．0，
and4．0U
图6 Taq聚合酶浓度的影响
Fig．6TaqPolymeraseconc ntration
7
Simpact
图7预变性时间的影响
Fig．7Initialdenaturationtime’Simpact
从左至右依次为：I．o、
3．o、5．o、7．o、IO．orain，
Marker
Fromleftoright：1．0，
3．0，5．0，7．0，and10．0
rain，andMarker
图8延伸时间的影晌
Fig．8Prolongationtime
7
Simpact
2结果与分析
2．1模板DNA浓度对SRAP扩增的影响：适宜的
模板量是保证特异性扩增的前提。模板DNA小于5
ng时产物少，条带模糊，在5～70ng时扩增条带稳
定且几乎无差异(图2)，因此青牛胆DNA的浓度范
围在5～70ng，考虑节约模板与实验操作的准确性，
本实验采用模板浓度为每25pL反应体系10ng。
2．2 M92+浓度对SRAP扩增的影响：反应混合物
中M92+浓度对SRAP反应的特异性和扩增效率均
有影响，浓度过高或过低都会导致扩增反应失败。
M92十是Taq酶的激活剂，M92+不足时，Taq酶的作
用效率降低，且dNTP竞争Mg抖，M92+受dNTP
总量的影响。对于青牛胆DNA，Mg抖浓度小于2．0
mmol／L时无扩增；2．5～3．0mmol／L时条带清晰
稳定，大于3．0mmol／L时条带弥散变弱(图3)。因
此，M92+适宜浓度为2．5mmol／L。
2．3 dNTPs浓度对SRAP扩增的影响：dNTPs浓
度直接影响PCR扩增产物的生成。dNTPs浓度不
足时，扩增产物减少，dNTPs浓度过高时，会从两方
面影响PCR扩增，一方面错配率大大增加，另一方
面同TaqDNA聚合酶竞争Mg抖，使反应体系中的
Mg抖总量下降，TaqDNA聚合酶活性受到影响。
dNTPs浓度低于0．10mmol／L时扩增产物强度较
低；在0．25～0．30mmol／L时条带多且清晰，达到
0．5mmol／L时几乎无扩增产物(图4)。因此，
dNTPs的最佳浓度为0．25mmol／L。
2．4引物浓度对SRAP扩增的影响：用ME2一EM4
引物，比较了引物浓度差异对扩增结果的影响。引物
浓度在0．5t-mol／L时条带很少，在1umol／L时条
带清晰且条带较多，在3．o～5．0t-mol／L时逐渐出
现弥散状(图5)。引物适宜浓度范围为1．0～3．0
／umol／L，从节约成本考虑，本实验选择引物浓度为
1．0umol／L。
2．5 TaqDNA聚合酶对SRAP扩增的影响：Taq聚
合酶用量的多少直接影响PCR反应的成败，酶量过
k基
础∽麓裟黑譬帅
氨m
出L‰
黏叭
=呈⋯：三
接队。
m一¨
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·275·
低，导致无扩增；酶量过高，使非特异性产物增加。当
酶用量为0．5U时扩增产物较少，在1．O～2．0U时
扩增条带逐渐清晰稳定；当酶用量达4．0U时产物弥
散(图6)。因此，Taq聚合酶的用量为1．5U最佳。
2．6 预变性时间及延伸时间SRAP扩增的影响：
本实验预变性和延伸时间对SRAP反应的影响进
行了考察，结果表明预变性时间和延伸时间对扩增
结果无太大影响，延伸时间在1～10min，变性时间
在1～5min扩增条带无太大差异。从缩短实验周期
和节约成本考虑，最终选择预变性2min，延伸5
min(图7、8)。
3讨论
本实验最终以青牛胆DNA为材料，建立了重
复性好、分辨率高的SRAP反应体系，即在25肛L反
应体系中，模板DNA质量浓度为10ng／t-L，2．5弘L
的10倍Buffer(M92+free)缓冲液，MgCl22．5
mmol／L，dNTPs为0．25rnmol／L，引物1．0弘mol／
L，Taq酶1．5U；扩增程序为：94℃预变性2min、
94℃变性1min、35℃复性1min、72℃延伸1
min、5个循环；94℃变性1min、50℃复性1min、
72℃延伸5min、35个循环。
对青牛胆SRAP扩增最为敏感的因素是
M92+，dNTPs，TaqDNA聚合酶浓度，而模板适宜
浓度范围较宽，5～70ng均有良好扩增，引物浓度
要求也不高，这与武志朴等对小麦H3及任羽等[53对
辣椒的研究结果是一致的。扩增前5个循环退火温
度为50℃，保证反应稳定可重现性。
SRAP是对ORFs进行扩增，对基因相对较少
的着丝粒附近及端粒的扩增较少，如结合可扩增这
些区域的SSR标记，可获得覆盖整个基因组的连锁
图。在遗传多样性研究中，SRAP比AFLP更能反映
表型的多样性及进化史[6]，且比AFLP操作简单，省
去了酶切，连接等烦琐的步骤，在药用植物种质资源
评价等方面具有广泛的应用前景。
SRAP技术是基于PCR的一种分子标记方法，
是针对生物体基因组进行分析，亲缘关系越近的生
物基因相似性越大，故推断本实验优化所得的反应
条件对防己科青牛胆属及亲缘关系相近的其他植物
同样适用。
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柴胡愈伤组织生长和不定根诱导的研究
姚智1，高文远¨，李克峰1，PAEKKee—yoeup2
(1．天津大学药物科学与技术学院，天津300072；2．ResearchCenterfort eDevelopmentofAdvancedHorticultural
Technology，ChungbukNationalUniversity，Cheongju361—763，Chungbuk，Korea)
摘要：目的探讨柴胡愈伤组织生长和其不定根诱导的适宜培养条件。方法 以无菌苗为外植体诱导获得愈伤
组织后，对不同种类和不同质量浓度的生长素进行实验，并对光和温度对柴胡愈伤组织生长和其不定根诱导的影
响进行了研究。结果 柴胡的愈伤组织适宜于在MS+NAA4mg／L+KT0．2mg／L培养基或MS+NAA2rag／
L+KT0．2mg／L培养基上继代培养。诱导其不定根时宜采用的培养基为MS+JBA2mg／L+KT0。2mg／L。25
℃条件下，黑暗培养既有利于柴胡愈伤组织的生长又有利于其不定根的诱导。结论 比较适宜于柴胡愈伤组织生
长的生长素为NAA，而有利于不定根诱导的生长素为IBA。温度对愈伤组织的生长影响非常明显，光照是其发根
的限制因素。
收稿日期：2006—04—10
基金项目：国家中医药管理局中医药科学技术研究专项(04—05ZPl0)
*通讯作者高文远Tel：(022)87401895
万方数据
青牛胆SRAP标记反应体系的建立与优化
作者： 杨兵， 王天志， 罗禹， 陈璐， YANG Bing， WANG Tian-zhi， LUO Yu， CHEN Lu
作者单位： 四川大学华西药学院,四川,成都,610041
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(2)
被引用次数： 5次

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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200702042.aspx