全 文 ：·1554· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs，第37卷第10期2006年10月
病效果，其中JB。效果最好，可将人参发病率控制在
5％左右。其次是JB。、JA。、JA。，其均能将人参的发
病率控制在10％左右。
35
30
25
罨20
饕15
10
5
O
圈2种播人参发病率
Fig．2IncidencerateofP．ginsengbysemination
3 结论
综合木霉菌剂对人参种子出苗率和种苗成活率
的影响及对人参根部病害的防治效果两方面看，蘸
根法和浸种法优于沟施法。一种原因可能是这两种
方法对人参种苗成活和种子萌发所需的水分起到补
充的作用，另一种原因可能是木霉菌剂中的主效成
分分生孢子能够更充分接触人参根部和种子外围，
有利于其快速抢占定殖位点，减少了病原菌侵入的
机会，降低了发病几率。沟施法的某些浓度如GA。、
GB。、GB。降低了人参种苗的成活率，具体原因尚不
明确。本实验附带对木霉施入土壤后的种群数量进
行了检测，结果发现木霉在土壤中可以长期存活，且
回收木霉毒力无明显减弱趋势，故该两种木霉可进
行更大面积的推广预试验，蘸根法使用木霉菌剂时，
可用Tv04—2制剂稀释5000倍，Th3080制剂稀释
10000倍。浸种法使用木霉菌剂时，可用Ta,04—2制
剂和Th3080制剂均稀释5000倍。
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川乌遗传多样性的ISSR鉴定
罗 群1，马丹炜1’¨，王跃华3
(1．四川I师范大学生命科学学院，四川成都610066；2．四JII大学生命科学学院，四川I成都610064；
3．成都大学生物工程系，四JII成都610081)
摘 要：目的应用ISSR标记技术分析川乌遗传多样性。方法对江油附子和9个野生乌头居进行了1SSR分析，
探索川乌各居群间的遗传多样性。结果 8个引物共扩增出98条带。其中68条具有多态性，多态位点百分率为
69．39％}观测等位基因数(Ⅳa)为1．6939，有效等位基因数(Ne)为1．3715，Nei’S基因多样性指数为0．2308，
Shannon信息指数(J)为0．3530；用ISSR855引物能够区分川乌的10个供试居群。结论ISSR标记适合于构建
川I乌的DNA指纹图谱、品种鉴定和遗传多样性分析。
关键词：川乌；ISSR；遗传多样性
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)10—1554一04
ISSRIdentificationofgeneticd versityinAconitumcarmichaeli
LUOQunl，MADan—weil’2，WANGYue—hua3
(1．CollegeofLifeScience，SichuanNorm lUniversity，Chengdu610066，China；2．CollegeofLifeSci nce，SichuanUni一
收稿日期：2005—12—26
基金项目：四川省教育厅重点项目(2003A084)
作者简介：罗 群(1979一)，女，硕士研究生，主要研究方向为植物遗传多样性及细胞工程。
*通讯作者马丹炜Tel：13709018761E—mail：danweiloma@yahoo．corn．cn
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1555·
versity，Chengdu610064，China；3．DepartmentofBiologicalEngineering，ChengduUniversity，Chengdu610081，China)
Abstract：ObjectiveISSRIdentificationofgeneticd versityinAconitumcar ichaelibyISSRmarker
technique．MethodsG neticd versitybe weenJiangyouRadixAconitiLateralisPreparataandninewild
A．carmichaelipopulationswasdeterminedbyISSRtechnique．ResultsEightprimerswereselectedo
producehighlyreproducibleISSRbands．Among98amplifiedbands，68showedpolymorphism，theper—
Centageofpolymorphicbands(PPB)reachedto69．39％．Observednumberofalleles(Na)，effective
numberofalleles(Ne)，Nei7Sgenediversityindex(H)，andSh nnoninformationindex(I)were
1．6939，1．3715，0．2308，and0．3530，respectively．ADNAprofilewasdiscoveredwithasingleprimer，
ISSR855，inwhicheachoftentestedpopulationshaditsuniquepatternsa dwasdistinguishedfromeach
other．ConclusionISSRMethodissuitableforDNAfingerprinting，identification，andgeneticd versity
analysisofA．carmichaeli．
Keywords：AconitumcarmichaeliDebx．；ISSR；geneticdivers ty
DNA分子标记为植物的遗传和物理图谱的建
立、基因的定位与克隆、数量性状位点的遗传分析、
遗传多样性评估、物种起源和分子标记辅助育种等
遗传学研究提供了有价值的工具[1]。在众多的DNA
分子标记中，简单重复间序列(inter—simplese—
quencer peats，ISSR)在植物遗传多样性研究中获
得了成功。ISSRDNA标记技术是由Zietkiewicz提
出的，该技术检测的是两个SSR之间的一段短
DNA序列上的多态性[2]。ISSR技术所用的PCR引
物长度在20个核苷酸左右，因此可以采用与常规
PCR相同的反应条件，稳定性比RAPD好。近年来，
ISSR标记技术已应用于水稻、玉米、大豆、大蒜等农
作物和苹果、李等果树的研究，在中药中ISSR标记
研究很少，国内仅少量报道[3“]。
川乌Aconiturnca michaeliDebx．为毛茛科乌
头属植物，附子RadixAconitiLateralisPreparata
为栽培种川乌的侧根，是“回阳救逆”要药，临床应用
范围不断拓宽，多用于传统的饮片配方，近年来也用
作制药工业原料。传统的种植地主要集中在四川江
油，为公认的地道产地。附子产品大量销往国内市
场、出口东南亚和日本等国，附子已经成为江油市重
要的经济作物。国内外市场对附子的品质、纯度和道
地性具有较高的要求。目前市场上附子产品来源比
、、较复杂，优劣品种混杂，采用传统的形态特征和系谱
来源对其分类研究和遗传分析较难。为准确鉴定和
使用，克服传统鉴定方法不易区分品种的不足，为其
新品种选育和育种提供分子依据，本实验采用ISSR
标记鉴定了江油附子与采自四川的青川县、平武县、
都江堰市、峨眉山、瓦屋山及九龙县等地的野生居群
的种质多样性。
1材料和方法
1．1供试材料：乌头野生居群采自都江堰(DJY)、
瓦屋山(WWS)、峨眉山太子坪(TZP)、峨眉山中锋
寺(ZFS)、平武(Pw)、九龙县(JL)、青川林场(LC)、
青川大坝(DB)、青川陈家坝(CJB)，栽培种采自江油
(JY)，野外采集材料由四川师范大学生命科学学院
马丹炜副教授鉴定，凭证标本保存在四川师范大学
生命科学学院细胞工程研究室；取新鲜叶片，用硅胶
迅速干燥后带回实验室，储于一70℃冰箱保存。
1．2 DNA的提取：参照邹喻苹等的CTAB法[6]。
1．3 PCR反应：ISSR引物购自哥伦比亚大学
(UBC9#)。筛选出条带清晰、反应稳定的引物进行
ISSR标记分析。反应总体积为20pL，其中含DNA
模板50ng，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各200
肛mol／L，引物0．2tJ￡mol／L，10×PCR缓冲液2弘L，1
UrTaq酶。PCR反应程度为：94℃，5min；94℃，
30S；48℃，45S；72℃，2min；45个循环；72℃，7
min。反应产物使用2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像
系统照相并记录结果。
1．4 数据处理与统计分析：每一条引物均重复扩
增、电泳3次，选取稳定清晰的条带进行统计分析。
电泳图谱的每条带(DNA片段)，均为一个分子标
记，代表一个引物的结合位点。根据分子标记的迁移
率及其有无统计所有的二元数据；有带(显性)记为
1，无带(隐性)记为0，强带和弱带的赋值均为1。采
用POPGEN32软件，计算多态性位点百分率(PPB，
thepercentageofpolymorphicbands)、观测等位基
n
因数(observednumberofalleles)(Na一乏Afn)、
i=】
有效等位基因数(effectivenumberofalleles)(Ⅳ8=
∑I-1／∑qZ]／n)、Nei’S基因多样性指数(Nei7Sgene
万方数据
·1556· 中草菊 ChineseTraditionalandH；rbaIDrugs第37卷第10期2006年10月
n 卅t
diversity)(H=∑El／∑qij]／n)、Shannon信息指数
l=1 J=1
(Shannoninformationindex)(J2莩手训f=
表1 ISSR引物及其碱基序列和多态性分析
TableISSRPrimersequencesandanalysisofISSR-
generatedban ingpatterns
，、摩∑z；·；Ey；)；根据Nei7s距离(GD)；用UPG一引物 碱基序列(5’～3’’
v t I ^ i
MA法进行系统聚类分析，构建分子进化系统树。
2结果与分析
2．1 扩增产物的多态性：从63条ISSR引物筛选
出8条ISSR引物用于PCR扩增，扩增条带的相对
分子质量从2001 000bp不等(图1)。共扩增出
98条带，其中具有多态性的条带数为68条，多态性
位点百分率为69．39％(表1)，并由POPGEN32软
件分析得出：观测等位基因数(Na)为1．6939，有效
等位其因数(ⅣP)为1．3715，Nei7S基因多样性指数
(H)为0．2308，Shannon信息指数(Jr)为0．3530。
图1 引物855对10个川乌居群的扩增特征图谱
Fig．1ISSRProfileoftenA．carmichaelipopulations
generatedbyPrimer855
扩增带多态性条多态性位
数／条 带／条 点数／％
R一(A，6)；Y=(C，1)
根据实验结果获得了10个JiI乌居群的遗传一
致度和遗传距离(表2)。青川大坝和青jiI陈家坝川I
乌居群间遗传一致度最大(O．959)；江油附子和都江
堰川乌居群问的遗传一致度次之(O．908)，青川大坝
和峨眉太子坪、峨眉中锋寺、九龙县川乌居群问的遗
传一致度最小，均为0．633，平均遗传一致度为
0．744，平均遗传距离为0．302。
2．2 ISSR特征图谱的建立：利用筛选得到的8条
ISSR引物分别对供试材料进行PCR扩增，建立了
相应的DNA指纹图谱，其中从855引物能够区分
川I乌的10个供试居群(图1)，该引物扩增的10个
JiI乌居群DNA电泳图谱为鉴定品种的真实性及品
种间的差异提供了科学依据。
2．3川乌的ISSR聚类分析：为了进一步表明10
个供试居群间的遗传关系，利用Nei7S遗传距离采用
表2 10个川乌居群的一致度和遗传距离
Table2 Nei’SGeneticidentityandgeneticd stancefortenA．carmichaelipopulations
非加权算术平均法(UPGMA)进行聚类(图2)，所
有居群明显划分为3组。第1组含有6个居群，包括
江油附子、都江堰、青川林场、平武、九龙县及瓦屋山
等地的居群；第二组包括峨眉山太子坪和峨眉山中
锋寺的居群；第三组包括青川大坝居群和青川陈家
坝居群。
3讨论
3．1 川乌居群的遗传多样性：从10个居群的遗传
一致度及聚类结果表明，川乌居群间遗传一致度从
0．633～0．908，遗传一致度较高，与形态学分类结果
一致，表明原产四川I的药材川乌在原位、迁移地或栽
培地不同生态型的分化较少。．
万方数据
中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·1557·
图2 10个川马居群间的ISSR聚类分析树状图
Fig．2DendrogramofISSRanalysisfortenA．carmic—
haelipopulationsbasedonNei’sgeneticd stance
10个川乌居群间的遗传多样性水平存在较大
差异，青川大坝居群和青川I陈家坝居群问遗传一致
度最大，江油附子和都江堰居群间的遗传一致度次
之，而青川大坝和峨眉太子坪、峨眉中锋寺、九龙居
群间的遗传一致度最低。树状聚类分析图中，青川大
坝和青川陈家坝居群聚在了第三组，峨眉太子坪和
峨眉中锋寺的居群聚在了第二组，表明地理分布范
围是决定植物遗传多样性的主要因素之一[7]，地理
距离小的居群间趋向于更高的遗传一致度，遗传多
样性水平较低，宽分布区的种趋向于具有更高的遗
传多样性水平。同样青川林场居群与青川大坝居群
和陈家坝居群相比，较其他两地的居群有较大的遗
传差异，可能与林场的海拔高度较大坝和陈家坝高
有关。
3．2江油附子与野生川乌居群间的遗传差异：江油
附子与都江堰居群间的遗传一致度最高；与峨眉中
锋寺居群遗传一致度最小，与峨眉太子坪、青川大
坝、青川陈家坝居群间的遗传一致度次之，如果长期
用同样的居群进行栽培，川I乌的品质将会逐渐下降。
因此，对峨眉中锋寺、峨眉太子坪、青川大坝、青川陈
家坝四个产地川乌的有效化学成分进行比较分析，
选育优质药材居群进行栽培和组织快繁，将能够为
JII乌的品种选育、栽培和杂交复壮提供丰富的种质
资源。
3．3 ISSR标记：ISSR通常为显性标记，呈孟德尔
式遗传，具有很好的稳定性和多态性[8]，且一套IS—
SR引物可以在多种植物中通用，提高了其利用率，
故在遗传关系研究方面有着广阔的应用前景。周延
清等[53用一个ISSR引物建立了10个怀区地黄样品
的DNA指纹图谱并且能将其彼此区分出来。姚明
哲等由两个ISSR引物扩增的指纹图谱可清楚区分
6个不同品种的茶树[9]。本研究也揭示了ISSR标记
的多态性，在10个供试川乌居群中，用8个ISSR
引物共扩增出98条带，多态性比率为69．39％，仅
用一条引物855就可以鉴别出本实验所用的10个
川乌居群，具有高效、准确的特点。
总之，ISSR技术是一种鉴定川乌种质的有效且
实用的工具，能够检测到较高的多态性。用它所得到
的多态带对栽培附子过程中生产育种组合亲本，对
杜绝生产中假冒伪劣品种的危害，对于大力发展我
国中药附子资源，促进中药附子的现代化生产皆具
有重要意义。
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万方数据
川乌遗传多样性的ISSR鉴定
作者： 罗群， 马丹炜， 王跃华， LUO Qun， MA Dan-wei， WANG Yue-hua
作者单位： 罗群,LUO Qun(四川师范大学生命科学学院,四川,成都,610066)， 马丹炜,MA Dan-wei(四川
师范大学生命科学学院,四川,成都,610066;四川大学生命科学学院,四川,成都,610064)，
王跃华,WANG Yue-hua(成都大学,生物工程系,四川,成都,610081)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(10)
被引用次数： 15次

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