全 文 ：·512· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
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土人参多糖的分离及诱导PCI2细胞分化活性
冉靓1’2，杨小生H，朱海燕1，王伯初2
(1．贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002，2．重庆大学生物工程学院生物力学与
组织工程教育部重点实验室，重庆400030)
土人参为马齿苋科植物栌兰Talinumpanicu—
latumGaertn．的根，又名参草、紫人参、土炕头、福
参、申时花等，生长于田间、路边、墙角石旁、山坡沟
边等阴湿处，分布于四川、贵州、云南、江苏、安徽、浙
江、福建等地，睬甘、淡、性平，有补中益气，润肺生津
之功效，可用于治疗气虚劳倦，食少，泄泻，肺痨咳
血，眩晕，潮热，盗汗，月经不调，产妇乳汁不足等
症[1’2]。近年来，对多糖的深入研究表明，多糖具有多
种生物活性[引，其中，有研究表明夹竹桃多糖[4]，刺
梨多糖[53等有促进PCI2细胞生长和分化作用。笔
者在开展贵州民族药的活性物质筛选时发现，土人
参的水提取物可诱导PCI2细胞的分化。因此本实
验以活性筛选为导向，对土人参多糖进行分离、纯
化，找到了活性多糖，并对其结构进行了初步研究。
1材料、试剂和仪器
1．1材料：土人参产自贵州省安顺市关岭县，经贵
阳中医学院陈德媛教授鉴定为马齿苋科植物栌兰
T．paniculaturnG ertn．的根。
1．2仪器与试剂：GC一14C型气相色谱仪(日本岛
津公司)；Agilent1100高效液相色谱仪(美国)；
HP8453紫外可见分光光度仪(美国惠普公司)；
VECTOR22型傅里叶变换红外光谱仪(德国)；
EYELAFDU一1100冷冻干燥机(日本)；FORMA
3111水套式CO。培养箱(美国)；尼康倒置相差显微
镜(日本)；DEAE一纤维素(dz海恒信化学试剂有限
公司)；SepharoseCL一6B(瑞典Pharmacia公司)；多
糖分子量标样Pullulan系列(日本东京化成公司)；
大鼠嗜铬细胞瘤PCI2细胞株(中国典型培养物保
藏中心)；其他试剂均为进口或国产分析纯。
2实验方法
2．1 粗多糖的提取：干燥土人参2．3kg，粉碎，
75％乙醇回流脱脂，每次2h，反复2次。药渣挥干溶
剂，加8倍水，煮沸浸提2h，反复2次。合并滤液。减
压浓缩至一定体积，加入工业乙醇，使含醇量达到
80％，静置过夜，抽滤，依次用95％乙醇、丙酮洗涤
沉淀，收集沉淀，于真空干燥箱中60℃干燥得土人
参粗多糖(7．paniculatumpo ysaccharides，TPP)。
2．2粗多糖的纯化
2．2．1 DEAE一纤维素离子交换色谱(OH一型)：取
土人参粗多糖10．0g溶于水，3000r／min下离心
收穰日期；2006—06-1l
基金项目；国家重大基础研究前期研究专项(2004CCA03800)；贵州省优秀科技人才培养计划项目[黔科合人字(2002)0205号]
作者简介：冉靓(1980一)，女，重庆市人，硕士研究生，主要从事活性多糖的分离纯化。
*通讯作者杨小生Tel：(0851)5380459E-mail：yang—xiaosheng@yahoo．com
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·513·
10min，以DEAE一纤维素柱色谱分离，依次用蒸馏
水、1．0mol／L为上限的NaCl溶液，0．2mol／L为
上限的NaOH溶液洗脱，以硫酸一苯酚法跟踪检测。
10．0gTPP经DEAE一纤维素柱色谱分离，分别得
到TPPl(180mg)、TPP2(631mg)、TPP3(1．625
g)、TPP4(579rag)、TPP5(467rag)5个组分。根据
活性筛选结果，对TPP3和TPP5两个组分进一步
分离纯化。TPP3(400mg)，TPP5(400mg)经
SepharoseCL一6B(100cm×2．6cm)柱色谱分离分
别得1个主要成分TPP3a(169mg)，TPP5b(105
mg)。TPP3a和TPP5b在SepharoseCL一6B柱(80
cm×1．6cm)上的洗脱峰均呈单一对称峰；2种多糖
在聚丙烯酰胺盘状电泳上均呈单一条带，同时
TPP3a和TPP5b的紫外光谱均显示其在260nlTl
和280am处未见明显特征吸收峰。
2．2．2SepharoseCL一6B凝胶色谱(100cm×2．6
cm)：以0．2mol／LNaCl溶液洗脱，体积流量为30
mL／h，分部收集，以硫酸一苯酚法跟踪检测多糖峰，
合并高峰部分，透析，冷冻干燥。
2．3纯度检测
2．3．1 聚丙烯酰胺盘状电泳[6]：聚丙烯酰胺浓度
5％，电泳缓冲液为0．025mol／L硼砂一硼酸缓冲液
(pH9．0)，每管3mA，电泳8h，上样量50弘L(含糖
量50|“g)，阿利新蓝染色。
2．3．2 SepharoseCL一6B凝胶色谱(80am×1．6
cm)：以0．2mol／LNaCI溶液洗脱，流速为30mL／
h，每管收集3mL，用硫酸一苯酚法跟踪检测多糖峰。
2．3．3紫外光谱：多糖样品1mg／mL水溶液，以蒸
馏水做空白，进行200～400nm紫外扫描。
2．4相对分子质量测定：凝胶渗透色谱法测定多糖
相对分子质量。色谱柱AgilentPLaquagel—OH
MIXED(300mm×7．5mm，8弘m)，流动相为0．2
mol／L的HAC：NaAC缓冲体系，体积流量1mL／
min，上样量50弘L，柱温30℃，柱压39×105Pa。
2．5单糖组成分析
2．5．1纸色谱：取TPP3a和TPPSb各10mg，加入
2mol／LH2SO；各3mL，于100℃油浴中水解10h，
冷却后加入BaCo。中和至中性，3000r／rain下离心
除去沉淀，取上清液，点样于新华1号滤纸，以醋酸乙
酯一醋酸一水(3：1：3)展开，苯胺一邻苯二甲酸喷雾，
置100℃加热5min，显色。对照单糖为葡萄糖、甘露
糖、果糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖。
2．5．2气相色谱：取多糖TPP3a和TPP5b各10
mg，加入2mol／L三氟醋酸各3mL，封管，于100
℃下水解6h。按文献方法[73制备样品和单糖对照品
的糖醇乙酸酯衍生物进行气相分析。色谱条件：色谱
柱为OV一275石英毛细管柱(30ITI× ．32mm×
0．25肛m)，柱温以10℃／min，从180。C升至250
℃，保持5min，检测器和进样器温度均为250℃，
氮气作载气，分流比10：1。根据单糖对照品的保留
时间和校正因子，判断单糖组成。
2．6红外光谱分析：取干燥多糖样品2mg与KBr混
合研细后，压片，在400～4000am_1进行红外扫描。
2．7诱导大鼠嗜铬神经瘤PCI2细胞分化实验：实
验设阳性对照组、空白对照组和样品组3个实验组，
以神经生长因子(NGF)为阳性对照，生理盐水为空
白对照，样品组平行3个样。取适量生长良好的
PCI2细胞，以每孔3×103个细胞接种于96孔酶标
板中(培养液为85％DEME、10％灭活马血清、5％
灭活胎牛血清、链霉素100pg／mL、青霉素100u／
mL)，然后分别加入NGF、样品和生理盐水至孔中，
使NGF和样品质量浓度分别达到100ng／mL、20
pg／mL，最后置于37℃、5％CO。的培养箱中培养，
3～4d换1次培养液，14d后在相差显微镜下观察
细胞形态。
3 结果
3．1 土人参多糖的分离纯化：2．3kg干燥土人参
制得土人参粗多糖(TPP)253．563g。TPP的紫外光
谱显示其在260nm和280nm处无明显特征吸收
峰，而且TPP的双缩脲反应呈阴性，说明土人参粗
多糖中的蛋白质的量较少。硫酸一苯酚法测得TPP
中总糖的质量分数为56．82％。
3．2土人参多糖组分的物理性状：经冷冻干燥后，
TPP3a为白色絮状粉末，TPP5b为浅褐色絮状粉
末；均易溶于水，不溶于高体积分数乙醇、丙酮、醋酸
乙酯、正丁醇等有机溶剂；与硫酸一苯酚反应均呈橘
黄色；TPP3a与硫酸咔唑试剂反应呈玫瑰红色，经
测定其糖醛酸质量分数为20．57％，TPP5b与硫酸
咔唑试剂反应为阴性；由凝胶渗透色谱(GPC)检测，
TPP3a的相对分子质量为1．076×105，TPP5b的相
对分子质量为8．452×103。
3．3土人参多糖组分的单糖组成分析：纸色谱结果
表明TPP3a中含有半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖，而
TPP5b中含有葡萄糖。根据气相色谱分析结果，
TPP3a由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，其物质
的量比为：0．81：1．04：1．00，而TPP5b由甘露糖
和葡萄糖组成，其物质的量比为1．00：4．50。
3．4土人参多糖组分的红外光谱分析：红外光谱表
万方数据
·514· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
明TPP3a和TPP5b均在4000～400cm_1具有多
糖类物质的一般特性。2种多糖在3400cm-1左右
的吸收峰是糖类分子间或分子内氢键的伸缩振动
峰，2930cm_1附近的弱吸收峰是C—H的伸缩振
动峰，以上两组峰是糖类的特征峰。TPP3a在1612
ClTI～，1424ClTI-1的吸收峰分别是羧基中C—O的
非对称伸缩振动峰、C一0的伸缩振动峰，这与
TPP3a中含有糖醛酸的结果相吻合；在1100～
1010cm_1的3个吸收峰，说明TPP3a中存在吡喃
糖苷，而其在894ClTI-1处的特征吸收峰则是吡喃糖
p型C—H的变角振动吸收峰。TPP5b在1650cm_1
附近的吸收峰是酰胺基中C—O的伸缩振动峰，而
其在1413cm-1附近的吸收峰则属酰胺11I带，这说
明TPP5b中存在酰胺基；此外TPP5b在1079
cm～，1025cml处的吸收峰，说明该多糖中存在呋
喃糖苷，而其在937cm叫处的吸收峰则对应呋喃环
的对称伸缩振动。
3．5 诱导大鼠嗜铬神经瘤PCI2细胞分化实验结
果：在相差显微镜下对细胞形态观察表明，空白对照
组细胞呈球形，阳性对照组细胞已分化出明显的神
经样突触，含20／-g／mLTPP5b的样品组细胞有部
分已分化出神经样突触，而其他样品组细胞仍成球
形，无神经样突触产生，这说明在20／-g／mL质量浓
度下，TPP5b对PCI2细胞的生长有一定的促分化
作用，具有一定的神经营养活性。
4讨论
土人参粗多糖中含有大量淀粉，淀粉成分的存
在对活性多糖成分的分离纯化和跟踪造成了一定的
干扰，因此在后续处理过程中反复采用溶解、离心的
方法，达到除去大部分淀粉的目的。土人参粗多糖呈
褐色，颜色较深，本实验中采用DEAE一纤维素分离
无色多糖和有色多糖，不仅脱去植物多糖中游离色
素，而且保持了多糖的天然本色，同时在一定程度上
避免了活性炭或双氧水等脱色方法对多糖造成的损
失或破坏。
本实验采用糖醇醋酸酯衍生物气相色谱法测定
单糖组成，可避免衍生物异构体的产生，但该方法不
能检出己糖醛酸，而在糖醛酸的量的测定中，发现
TPP3a含糖醛酸为20．57％，但究竟是何种糖醛酸
有待进一步的证实。对2种多糖的红外光谱的分析
显示，TPP3a中含有p型吡喃糖苷，TPP5b中有呋
喃糖苷，但呋喃糖苷的类型无法从红外光谱上直接
识别，需要通过核磁共振等手段进行鉴定。
从20世纪五六十年代起，人们逐渐发现多糖具
有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗凝血、抗溃疡、降血糖、
降血脂等药理作用，并开展了广泛的研究，但是在众
多的活性多糖研究中，多糖对神经系统作用的研究
报道相对较少‰引。然而随着社会发展，神经系统退
行性疾病的发病率急剧上升，对神经系统作用的药
物研究已成为一项热点‘10]，因此在多糖中寻找具有
神经营养活性的物质，是一件有意义的工作。
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万方数据
土人参多糖的分离及诱导PC12细胞分化活性
作者： 冉靓， 杨小生， 朱海燕， 王伯初
作者单位： 冉靓(贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室,贵州,贵阳,550002;重庆大学生物工程
学院,生物力学与组织工程教育部重点实验室,重庆 400030)， 杨小生,朱海燕(贵州省、中
国科学院天然产物化学重点实验室,贵州,贵阳,550002)， 王伯初(重庆大学生物工程学院
,生物力学与组织工程教育部重点实验室,重庆 400030)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(4)
被引用次数： 3次

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