全 文 ：·药理与临床·
灯盏乙素拮抗硒对人肝细胞 L-02 毒性的研究
王　红,刘　琼a , Ali Abdella,徐辉碧
(华中科技大学 化学系药物研究所, 湖北 武汉　430074)
摘　要:目的　研究灯盏乙素拮抗硒对人肝细胞株 L-02 毒性作用。方法　采用噻唑蓝 ( M TT ) 法研究灯盏乙素和
硒对 L-02 细胞生长的作用; 倒置荧光显微镜观察细胞形态变化;测定丙二醛 ( MDA )、巯基含量和总抗氧化能力等
氧化还原相关生化指标。结果　0. 5 mmol/ L 灯盏乙素与细胞作用 48 h 时达到促细胞生长最佳条件, 且可以显著
拮抗 1, 5 Lmo l/ L 硒对 L-02 细胞生长的抑制作用; 灯盏乙素和硒共同处理的细胞与仅用硒处理的细胞相比 ,细胞
损伤程度明显减轻, MDA 含量显著降低, 巯基含量及体系抗氧化能力均显著增高。结论　灯盏乙素通过抗脂质过
氧化和提高细胞抗氧化能力拮抗硒对 L-02 细胞的毒性。
关键词: 灯盏乙素; 硒; 人肝细胞 L-02; 脂质过氧化
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 04 0413 03
Antagonistic effect of scutellarin on toxicity of selenium in human liver cells L-02
WANG Hong, LIU Qiong , ALI Abdella, XU Hui-bi
( I nstitute of Pharmacy , Depar tment of Chemistr y , Huazhong Univ ersit y o f Science and T echno lo gy , Wuhan 430074, China )
Abstract: Object　To invest igate the antagonist ic ef fect of scutellarin on the to xicity o f selenium in
human liv er cells L-02. Methods　MT T method w as used to obser ve the ef fects of scutellarin and selenium
on cell grow th. T he mo rpholo gical changes o f cells w ere observed by f luo rescent m icroscope. The MDA
level, thiol content , and total ant iox idat iv e capacity of cells w ere also measured. Results　T he opt imum
condit ion for scutellar in to promote cell g row th w as 0. 5 mmol / L in 48 h culture period. Comparing w ith
the only selenium treated group, 0. 5 mmol / L scutellarin signif icantly antag onized the inhibit ion o f cell
gr ow th caused by 1 and 5 Lmol/ L selenium, suppressed the selenium-induced cell damage and the increase
of MDA content , as w ell as incr eased the thiol content and cell ant io xidat ion capacity. Conclusion　Scutel-
larin markedly antag onizes the toxicity o f selenium in human liver cells L-02 by inhibit ing lipid perox ida-
tion and promo ting cellular ant io xidat ion capacity .
Key words : scutellarin; selenium ; human liver cells L-02; lipid pero xidat ion
　　硒 ( Se) 是人体必需的微量元素,具有重要的
生物功能。研究表明硒的浓度过高会使机体中毒[ 1]。
硒造成细胞毒性的一个重要原因是催化细胞内的巯
基发生氧化还原反应产生活性氧 ( ROS) , 过量
ROS 在体内积累导致细胞抗氧化能力降低,进而引
起细胞损伤[ 2]。灯盏乙素是从菊科植物灯盏全草中
分离的黄酮成分, 环上有酚羟基, 具有一定的还原
性,可清除 ROS [ 3, 4]。本实验以人正常肝细胞 L-02
为研究对象, 从细胞生长、形态学变化和氧化还原能
力的角度,观察灯盏乙素对硒的细胞毒性的影响。
1　材料与方法
1. 1　试剂和仪器:灯盏乙素,云南玉溪药业公司,含
量> 96%, 用稀 NaOH 溶液溶解。分析纯 Na2SeO 3,
天津化学试剂研究所。RPM I-1640 干粉、新生小牛
血清、胰蛋白酶、MT T、吖啶橙 ( AO) 等均为 Gibco
产品。丙二醛 ( MDA)、巯基及总抗氧化能力测试盒
购自南京建成生物工程研究所。倒置荧光显微镜为
日本产 Olympus IX—70。UV—7500紫外可见分光
光度计,上海天美科学仪器有限公司。
1. 2　细胞培养: 人正常肝细胞株 L-02 购自中国典
型培养物保藏中心(武汉)。细胞用含 10% 新生小
牛血清、100 U / mL 青霉素、100 Lg/ mL 链霉素和
0. 25 U/ mL 胰岛素的 RPM I-1640 完全培养液于
37 ℃, 5%CO2的培养箱中进行培养。
1. 3　灯盏乙素浓度和作用时间的选择:取生长状态
良好的 L-02 细胞,用 0. 25% 胰蛋白酶消化制成细
·413·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 4 期 2004年 4月
a 收稿日期: 2003-07-12基金项目:教育部优秀青年教师资助计划项目(教人师 2002 No. 40)作者简介:王　红( 1978—) ,女,山东德州人,华中科技大学化学系药物研究所硕士研究生。
* 通讯作者　T el: ( 027) 87543532　Fax: ( 027) 87543632　E-mail: Qiongliu hus t@ 163. com
胞悬液,接种于 24孔细胞培养板中。常规培养 24 h
后,弃去培养基,加入新鲜培养基,细胞分为:正常对
照组: 加入完全培养基;灯盏乙素组:每组加入灯盏
乙素,使其终浓度分别为 0. 3, 0. 5 和 0. 7 mmol/ L。
每组均为 3 孔。加药后分别培养 24, 48, 72 h, 通过
MTT 染色, 在 UV—7500 紫外可见分光光度计上
于 570 nm 波长处测定各孔的吸光度 ( A 570 ) 值,观
察细胞的生长状况 [ 5]。
1. 4　灯盏乙素和硒对细胞生长的影响:按 1. 3项方
法培养细胞并加入灯盏乙素和 Na2SeO3。细胞分为
正常对照组:加入完全培养基; 硒组:加入 Na2SeO 3
溶液, 使硒的终浓度分别为 1, 5 Lmol/ L ; 灯盏乙素
组: 加入灯盏乙素, 使其终浓度为 0. 5 mmol/ L ;
硒+ 灯盏乙素组: 每组加入 Na2SeO 3溶液和灯盏乙
素,使硒的终浓度分别为 1, 5 Lmol/ L , 灯盏乙素终
浓度为 0. 5 mmol/ L。加药后分别培养 24, 48, 72 h
后,采用 MTT 法检测细胞生长状况 [ 5]。
1. 5　细胞形态学观察:细胞培养及分组同 1. 4项方
法,加药培养 48 h 后, 倒置显微镜下观察并用成像
系统拍照。然后吸出孔内液体, PBS 洗 2遍, 5 mg / L
AO 染色 20 min 后,荧光显微镜下观察并拍照。
1. 6　生化指标的测定:将细胞接种于 100 cm 2的培
养盘中,按 1. 4项方法分组,加药培养 48 h 后, 将细
胞刮下并悬于冷 PBS 中。将细胞置于 - 80℃ 低温
冰箱和 37 ℃ 水浴中, 反复冻融 4 次, 4 000 r / min
离心 10 m in 后,吸出上清液用于测定生化指标。蛋
白质含量采用考马斯亮蓝 G-250 法测定,以牛血清
白蛋白作标准 [ 6]。MDA 含量、巯基含量和体系总抗
氧化能力的测定按试剂盒要求, 采用比色法,分别于
532, 412及 520 nm 波长处测定。
1. 7　数据处理:数据用 x±s 表示,采用 t 检验。
2　结果
2. 1　灯盏乙素浓度及作用时间的选择: 结果见表
1, M T T 比色法显示: 与对照组相比, 0. 3, 0. 5
mmol / L 灯盏乙素组的 A 570值均增加, 且以 0. 5
mmol / L 时最为明显,说明在该浓度范围灯盏乙素
促进细胞生长; 而当灯盏乙素浓度为 0. 7 mmol/ L
时 A 570值低于对照组,说明该浓度灯盏乙素对细胞
生长已表现出抑制作用。从作用时间来看,加药培养
48 h 后灯盏乙素对细胞生长的促进效果最明显。因
此,选择 0. 5 mmo l/ L 灯盏乙素进行下面实验。
表 1　灯盏乙素对 L-02 细胞生长的影响 ( x±s, n= 3)
Table 1　Ef fect of scutellarin on L-02 cell
growth ( x±s, n= 3)
组　别 终浓度
/ ( mmol·L - 1)
A 570
24 h 48 h 72 h
对照　　　 - 0. 336±0. 004 0. 356±0. 008 0. 245±0. 014
灯盏乙素 0. 3 0. 338±0. 020 0. 363±0. 010 0. 250±0. 013
0. 5 0. 402±0. 012 0. 409±0. 018 0. 254±0. 010
0. 7 0. 302±0. 005 0. 310±0. 011 0. 210±0. 002
2. 2　灯盏乙素和硒对细胞生长的影响: 见表 2。
MT T 法显示: 与对照组相比,加 1, 5 Lmol/ L 硒组
的细胞 A 570值显著降低,且呈浓度依赖性,表明此浓
度范围的硒抑制 L-02 细胞生长; 而硒+ 灯盏乙素
组细胞 A 570比对照组低,但显著高于硒组细胞,表明
灯盏乙素可以拮抗硒的毒性, 促进细胞生长。
2. 3　细胞形态学观察: 由荧光显微镜照片可观察
到, 对照组和灯盏乙素组的细胞饱满,胞膜光滑, 荧
光发光均匀;加 1, 5 Lmol/ L 硒时, 细胞形状变得不
规则,发光不均匀,且浓度越大,现象越明显; 而硒+
灯盏乙素组的细胞与仅加同浓度硒的细胞相比, 细
胞发光均匀,损伤程度减轻。由倒置光镜照片可观察
到, 对照组与灯盏乙素组的细胞饱满完整; 加入 1
Lmol/ L 硒, 细胞变形,出现发泡现象; 而当硒的浓度
达到 5 Lmo l/ L 时, 细胞体积肿胀, 有碎片出现;硒+
灯盏乙素组细胞的损伤程度明显减轻。结果说明灯盏
乙素能有效地拮抗硒对 L-02 细胞的毒性作用。
2. 4　生化指标的测定
2 . 4. 1　MDA含量测定: 由表3可知, 与对照组相
表 2　灯盏乙素和硒对 L-02 细胞生长的影响 ( x±s, n= 3)
Table 2　Ef fects of scutellarin and selenium on L-02 cell growth ( x±s, n= 3)
组　别 终浓度硒/ ( Lmol·L- 1) 灯盏乙素/ ( mmol·L- 1)
A 570
24 h 48 h 72 h
对照 - - 0. 310±0. 008 0. 378±0. 009 0. 363±0. 003
硒 1 - 0. 266±0. 012* 0. 289±0. 012* * 0. 269±0. 007* *
5 - 0. 109±0. 004* 0. 156±0. 011* * 0. 140±0. 015* *
灯盏乙素 - 0. 5 0. 311±0. 006 0. 379±0. 011 0. 357±0. 010
硒+ 灯盏乙素 1 0. 5 0. 297±0. 008* △ 0. 316±0. 007* * △ 0. 308±0. 007* * △△
5 0. 5 0. 177±0. 006* * ▲▲ 0. 219±0. 008* * ▲▲ 0. 215±0. 009* * ▲▲
　　　与对照组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01;　与 1 Lmol/ L 硒组比较: △P< 0. 05　△△P < 0. 01;　与 5 Lmol/ L 硒组比较: ▲▲P < 0. 01
　　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01 v s cont rol group;　△P < 0. 05　△△P < 0. 01 v s 1 Lmol / L S e group;　▲▲P < 0. 01 v s 5 Lmol/ L Se group
·414· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 4 期 2004年 4月
比,灯盏乙素组细胞内 MDA 含量显著降低, 表明
0. 5 mmo l/ L 灯盏乙素具有抗氧化、降低细胞脂质
过氧化的能力; 1 Lmol/ L 硒组细胞内 MDA 含量与
对照组相比差异不显著,表明该浓度硒不引起细胞
脂质过氧化水平的改变; 而硒 ( 1 Lmol/ L ) + 灯盏乙
素组细胞内 MDA 含量显著低于对照组和仅加同浓
度硒组; 当硒浓度为 5 Lmol/ L 时,细胞内 MDA 含
量显著高于对照组,说明此浓度硒促进细胞脂质过氧
化; 而硒 ( 5 Lmo l/ L ) + 灯盏乙素组细胞内 MDA 含
量显著低于对照组和仅加同浓度硒组。结果表明,对
L-02 细胞补充适量硒 ( 1 Lmol/ L ) 不造成细胞脂质
过氧化,而补充过量硒 ( 5 Lmo l/ L ) 则促进细胞过氧
化。灯盏乙素具有抗氧化作用, 能降低细胞脂质过氧
化水平,并拮抗过量硒所致细胞脂质过氧化损伤。
2. 4. 2　巯基含量和总抗氧化能力的测定:由表 3可
见, 1 Lmol/ L 硒组细胞的巯基含量和总抗氧化能力
无显著性变化, 而 5 Lmol/ L 硒则显著降低细胞内
巯基含量和总抗氧化能力; 在硒此浓度下加入 0. 5
mmol / L 灯盏乙素,细胞内巯基含量和总抗氧化能
力尽管仍低于对照组,但却显著高于仅加同浓度硒
组,说明灯盏乙素可以提高细胞抗氧化能力, 拮抗过
量硒所致的细胞抗氧化能力的降低。
表 3　灯盏乙素和硒对 L-02 细胞 MDA 含量、巯基含量和总抗氧化能力的影响 ( x±s, n= 3)
Table 3　Ef fects of scutellarin and selenium on MDA content , thiol content
and total antioxidation capacity of L-02 cells ( x±s, n= 3)
组　别 终浓度硒/ ( Lmol·L- 1) 灯盏乙素/ (m mol·L- 1)
MDA
/ ( Lmol·g - 1)
巯基
/ ( mm ol·g- 1)
总抗氧化能力
/ (U·mg- 1)
对照 - - 1. 81±0. 11 0. 184±0. 026 2. 76±0. 04
硒 1 - 1. 86±0. 15 0. 178±0. 015 2. 35±0. 27
5 - 3. 95±1. 13* 0. 090±0. 023* 1. 09±0. 47*
灯盏乙素 - 0. 5 0. 66±0. 09* * 0. 195±0. 002 2. 95±0. 21
硒+ 灯盏乙素 1 0. 5 0. 92±0. 06* * △△ 0. 182±0. 021 2. 78±0. 09
5 0. 5 1. 38±0. 23* * ▲ 0. 139±0. 003* ▲ 2. 12±0. 16* ▲
　　　与对照组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01;　与 1 Lmol/ L 硒组比较: △△P < 0. 01;　与 5 Lmol/ L 硒组比较: ▲P < 0. 05
　　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01 v s cont rol group;　△△P < 0. 01 v s 1 Lm ol / L S e group;　▲P< 0. 05 v s 5 Lmol/ L Se gr ou p
3　讨论
　　本实验以人正常肝细胞 L-02 作为研究对象,
通过 MTT 比色法研究灯盏乙素和硒对细胞生长的
影响,发现 1, 5 Lmol/ L 硒组与对照组相比, 细胞生
长均受到明显抑制; 细胞形态学表明, 1, 5 Lmo l/ L
硒可造成显著性细胞损伤,这可能是细胞生长受抑
制的原因。对其机制进行研究, 发现 5 Lmol/ L 硒显
著性促进细胞脂质过氧化水平, 降低细胞巯基含量
和总抗氧化能力, 这说明过量硒致 L-02 细胞毒性
的机制之一为促进细胞发生氧化应激。已有报道,硒
造成细胞毒性的一个重要原因是催化细胞内的巯基
发生氧化还原反应产生 ROS, 过量 ROS 在体内的
积累导致细胞抗氧化能力降低, 进而引起细胞膜磷
脂、DNA 和蛋白质等生物大分子损伤[ 2]。本实验通
过 L-02 细胞模型进一步证实了这一结论。
本实验结果表明, 0. 5 mmol / L 灯盏乙素能显
著性促进 L-02 细胞生长,降低细胞脂质过氧化水
平,并使细胞中巯基含量和总抗氧化能力略有升高。
同时, 灯盏乙素能显著逆转过量硒对 L-02 细胞的
生长抑制及损伤,降低由过量硒所致升高的细胞脂
质过氧化水平, 并能显著性阻止 5 Lmol/ L 硒引起
的细胞的巯基含量和总抗氧化能力的降低。这说明
灯盏乙素通过抗氧化机制保护细胞免受过量硒引起
的氧化损伤,从而达到减轻硒毒性的目的。
硒具有预防癌症及其他多种疾病的功能。然而,
过量补硒或长期大剂量补硒所致的过量硒积累都会
造成硒中毒。本研究表明,灯盏乙素作为黄酮类的一
种物质通过抗氧化机制拮抗过量硒的毒性。提示其
他黄酮类物质也可能在拮抗硒毒性方面发挥作用。
　　致谢: 华中科技大学药物研究所杨祥良教授和
生命科学院徐涛教授提供药物及仪器使用。
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