全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第j0期2005年10月· 559·
肉苁蓉种子和胚的整体透明染色技术研究
陈庆亮，瞿志席，杨重军，王华磊，周海鹰，鄣玉海+
(中国农业大学农学与生物技术学院中药材研究中心，北京 100094)
目前，研究寄生植物肉苁蓉种子萌发对环境刺
激反应，需要一项观察胚发育的简便技术，以观察肉
苁蓉种子萌发过程中胚的形态变化和对不同刺激
(如神州4号人造卫星搭载、植物生长物质等)的反
应。整体透明与染色技术，已经成为研究受精前与受
精后的向日葵、烟草胚璩生长发育的一项有效技
术‘“，也在拟南芥受精后胚的发育E2]、水稻受精后胚
的发育等研究成功应用口]，但在肉苁蓉种子的透明
效果不明显，因而有必要探索肉苁蓉种胚整体透明
与染色技术及细节。本试验从固定、抽气、染色时间、
水合时间、脱水时间、去种皮等环节研究了各因素对
种胚透明、染色效果的影响，建立一套适用于肉苁蓉
胚的整体透明与染色技术，并用于观察肉苁蓉种子
对层积处理的萌发反应。 ·
1材料、仪器和试剂
1．1植物材料：肉苁蓉CistanchedeserticolaY．C．
Ma种子，来自内蒙古自治区阿拉善盟吉兰泰肉苁
蓉基地，2004年5月末采收。种子直径≥0．7mm，
含水量5．15％，千粒质量0．0865g。
种子处理：肉苁蓉种子在温度为20℃的蒸馏水
中浸泡24h；5℃湿沙中层积30、60、90d。
1．z 仪器：OlympusBH-2显微镜(Olympus公
司)：OlympusSZHl0体视显微镜(Olympus公司)；
SHB一Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限
公司)。
I．3试剂和配制：无水乙醇、钾钒、甘油、甲醇、冰醋
酸(分析纯)；冬青油(分析纯，军事科学院药材供应
站)I苏木精(Fluka进口分装，上海化学试剂厂)
爱氏苏木精(Ehrlich7shematoxylin)原液的配
制⋯：苏木精1g，冰醋酸5mL，甘油50mL，纯酒精
50mL，钾钒(potassiumalum)(2％)50mL。将苏木
精、钾钒分别溶解在纯酒精和蒸馏水中，然后将甘油
加人苏木精酒精液中，再与钾钒和醋酸混合。将此染
色液放置暗处，直到变为深红色时，备用。
2方法和结果
2．1透明与染色试验处理：种子处理：去种皮、不去
种皮。抽气处理：不抽气、抽气。染色处理时间：24、
36、48h。水合和脱水处理时间：15、30、60、90rain。
透明和染色效果作为试验指标。
2。2肉苁蓉种子透明和胚染色的影响因素
2．2．1种皮对种子透明和胚染色的影响：肉苁蓉种
子的种皮胶质影响物质的渗入，种孔(直径200“m)
是液体进入的唯一快速通道。固定前不去除种皮，因
种皮阻隔而导致固定液向种子的渗透缓慢，仅有部
分胚清楚，染色效果也较差(图1一A)；去除种皮处
理，解除了种皮的影响，固定液可直接进入种子，速
度大为加快。种子和胚透明清晰，染色深度适宜，胚
和胚乳清晰可见(图1一B)。
2．2．2抽气对胚乳透明和胚染色的影响：种子内部
存在空气，是影响固定渡、染色液在种子内均匀分布
的一个因素。抽气是排除种子内部空气的手段。样
品固定时不抽气，固定液渗入慢、不均匀，透明和染
色效果差(图1一c)I样品固定时抽气，种子透明和染
色效果好，胚及其形状清晰，容易区分胚和胚乳(图
1一D)。
2．2．3’染色时间对胚染色的影响：染色时间对胚染色
影响明显。染色时间少于24h，则染色不足(图1一E)，
染色时间在24～48h，则染色层次分明(图1一F)。
2．2．4水合和脱水时间对种子透明和胚染色的影
响：水合和脱水时间低于60rain，透明效果不佳(图
1-G)；水合和脱水时间在60rain左右，则透明层次
分明、染色效果显著(图卜H)，90、60min效果几乎
一样。
2．3 肉苁蓉种子整体透明与染色技术
2．3．1抽气与固定：去掉种子种皮，立即放人醋酸一
甲醇(1；3)固定液中，在0．09MPa左右大气压中
抽气5～10rain，放置24～48h。
2．3．2水合：材料在50％酒精、25％酒精、蒸馏水
基收J盎lm项B!目：：河Z0北04省lZ科-1技0攻关哑目(032764。8D一4)，重太基础研究前期研究专项(2004ccA01200)
尊黧弈雾罐茹7”Teh[,男’(010硕士)627生’32研究556方向E-m为ai船黧熬群磬表论文8辄B”“。。“@126·⋯
万方数据
·1560· 中草药ChineseTraditionalandHerbatDrugs第36卷第10期2005年lo月
中各放置lh，最后再放人蒸馏水中过夜。
2．3．3染色：材料在爱氏苏木精原液(需充分氧化
成熟)：45％醋酸和50％乙醇等体积混合液(1：2)
放置24～48h。
2．3．4换洗：材料先用蒸馏水在24～48h内换4～
5次；再用自来水在24～48h内换3～4次。
2．3．5脱水：材料在25％、50％、70％、95％、100％
酒精中各放置1h，最后再放人100％酒精中过夜。
2，3．6透明：材料放入酒精一冬青油(1：1)th，再
放入冬青油中3次，每次1h，然后再放入冬青油中
过夜，最后在OlympusBH一2显微镜下观察、拍照。
．4用肉苁蓉整体透明与染色技术观察肉苁蓉种
胚形态变化：利用肉苁蓉种子透明与染色技术观察，
层积后肉苁蓉种胚的形态发生显著变化。成熟种子
的胚为球形(图卜I)这与前人观察结果一致n]。层积
后3 d胚的顶芽极突起(图卜J)；层积后60d，胚的
胚根极伸长，从原来包围着胚的胚乳处伸出(图1
K)；层积后90d，种子葫发(图l-L)。
A固定前投去种皮B_固定前去睬种皮C一固定时饺有抽气D～I舌『定时抽气E一染色时间少于
04h F染色时间24～48h G一水台和脱水时问少于60rainH一水台和脱水60mm左右I一球
形胚J胚芽极和胚根极伸长K一胚根扳即将伸出胚乳I．一胚根饭伸出胚乳。一胚
AwithseedcoalbeforefixingB-withoutseedcoatheforefixingC—fixingwilhoutaspirating
D—fixingwilhaspiratingEstainingtimelesstban24h F—stainingt me24—48h G—hydration
andehydrutiontimeIeee也an60minH-hydrutmnandehydratmatimeahout60minLglobLl—
farembryoJ-embryobudandembryonicrootpolarelongatingK—embryonicrootpolarp otrud—
InglrometidospeTmLe bryonicrootpolarp olrudedtrorne dospern．一embryo
圉l荒漠内敲蓉胚和胚乳的染色和遗明及其种子的萌发
Fl詈-1Staininga dclearing0fenIbryoandendospermand雠edgerminatienhC．deserticola
3讨论
3。1自20世纪70年代Herr发明胚珠的整体透明
技术以来，透明技术被不断改进。最初，用于观察茄
科茄属植物的太孢子母细胞、大孢子和胚囊Is．z]。经
Grane改进03，可用于观察胚珠、子房，但存在透明
后胚珠、子房内部反差小的阔题。Stelly(1984)、杨弘
远(1986)用先染色后透明的方法‘⋯]，反差明显。但
用于肉苁蓉种子的透明效果不明显。本实验结果表
万方数据
申草药ChineseTraditionalandHerbMDrugs第36卷第10期2005年10月· 561·
明，种皮、抽气、染色时间、脱水时间和水合时间，对
透明效果有明显影响。去掉种皮、固定时抽气、染色
时间及脱水时间和水合时间加长取得良好的透明效
果，并建立了一套肉苁蓉种子整体透明与染色技术，
用于肉苁蓉种子胚的形态观察。这项技术为观察肉
苁蓉种子萌发过程中胚的形态变化和对不同刺激
(如神州4号人造卫星搭载、植物生长物质等)的反
应提供了一种新的手段。
3．2寄生植物肉苁蓉的种子萌发机制是肉苁蓉栽
培学的重要问题。最近报道，肉苁蓉种子在1／2MS
培养基上有萌发现象o⋯。本实验结果表明，5℃湿沙
层条件下肉苁蓉的种子可发萌发，但萌发率很低。关
于肉苁蓉种子萌发的机制和萌发条件，仍是需要进
一步研究的课题。
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广东菲牛蛭生活水体的化学环境
谭恩光
(中山大学中山医学院生物学教研室，广东广州 510089)
蛭类俗称蚂蟥，是传统中药。《本草纲目》对水蛭
的药理、疗效、使用方法作了较全面记载。现代药理
实验表明水蛭注射液能使肿瘤细胞坏死、消失，对网
状内皮细胞有增强作用。与非吸血蛭类比较，吸血的
菲牛蛭唾液腺含有较丰富的抗血液凝固水蛭素，在
医药学上有重要价值。有关吸血蛭类繁殖饲养研究，
国内谭恩光(2002)曾报道广东菲牛蛭Hirudinaria
manillensisLe son的生长和生殖，及吸血山蛭的生
态分布、生长、摄食和生殖““]。国外Keegan(1968)
对东南亚的菲牛蛭生活习惯进行观静“。1992年
Steiner从产自马尼拉的菲牛蛭中分离纯化新的水
蛭素，测定其原始结构和功能表明有抗凝活性o]。
1993年Seacheri从菲牛蛭中分离出2种水蛭素变
异体，测定其氨基酸序列，cDNA克隆和表达，表达
产物有抗凝活性口]。2002年谭恩光等从广东产的舴
牛蛭基因组中PCR扩增出水蛭索基因，并克隆和恻
序，表明与马尼拉的菲牛蛭水蛭紊基因Hm，和Hm。
同源性分别为90％和88．6％，说明国产菲牛蛭有抗
凝作用”]，有关蛭类田间饲养主要是非吸血的金线
蛭，如宽体金线蛭。现报道广东菲牛蛭生活水体的化
学环境，为田问规范化人工饲养牛蛭提供基础资料。
1材料与方法
1．1 水样的采集，在广州市郊的水稻田、菜田的沟
渠，低洼处等有牛蛭活动的水体，分别采集水样，后混
合在一起，带回实验室分析。结合室内人工饲养牛蛭
的水体，从幼体开始饲养，每月采水样1次，检测其化
学成分1次，每月换水1次。检测水样重复3年。
1．2 水样化学分析方法，水样采回后，分析K+、
Na+、Fe”、Ca”、Mg”、Cl、HC03一、P04”、S042
和pH值共10项。其测定方法：PO；”磷钼兰比色
法：cl硝酸银滴定法；sO。2铬酸钼比色法；HCO。
酸碱滴定法；pH用pH测定仪；Ca”、Mg”、Fe”、
些鍪最留：留装召蒙辑学基金资助项目(3880086、39160017)；广东省医学基金资助(1996)}广东省中医药基金资助(200011)
作者简介z谭恩光，男，广东阳江人，教授．研究方向为蛭类及在医学上应用， E—mailrtanenguang@，2len．com
万方数据
肉苁蓉种子和胚的整体透明染色技术研究
作者： 陈庆亮， 翟志席， 杨重军， 王华磊， 周海鹰， 郭玉海
作者单位： 中国农业大学农学与生物技术学院,中药材研究中心,北京,100094
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(10)
被引用次数： 3次

参考文献(10条)
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1.李彦坤.臧巩固.赵立宁.李育君.唐蜻.程超华 整体透明技术观察悬铃叶苎麻胚胎发育的方法研究[期刊论文]-中
国麻业科学 2011(3)
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