全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (1): 120–126, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00120
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收稿日期: 2013-03-11; 接受日期: 2013-07-23
基金项目: 国家高技术研究发展计划(No.2012AA101202)、中国农业科学院中央级基本科研业务费预算增量项目(No.2013ZL007)和国际
原子能机构项目(RAS/5/056)
* 通讯作者。E-mail: liuluxiang@caas.cn
一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法
赵林姝, 刘录祥*, 古佳玉, 郭会君, 李军辉, 谢永盾, 赵世荣
中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物航天诱变技术改良中心, 北京 100081
摘要 以小麦(Triticum aestivum)花粉植株的叶片为材料, 利用整体透明技术制备小麦叶片气孔保卫细胞的观察样品, 比
较了4种透明剂的样品制备效果。结果表明, 利用整体透明技术制备小麦叶片气孔保卫细胞观察样品, 无需经过叶片撕取和
刮制步骤, 样品制备方法简便且高效; 用甘油溶液、饱和水合三氯乙醛及水合三氯乙醛与甘油的混合液3种透明剂处理小麦
叶片后, 在普通显微镜下均可观察到清晰的气孔保卫细胞。
关键词 花粉植株, 倍性鉴定, 保卫细胞, 小麦, 整体透明技术
赵林姝, 刘录祥, 古佳玉, 郭会君, 李军辉, 谢永盾, 赵世荣 (2014). 一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法. 植
物学报 49, 120–126.
小麦(Triticum aestivum)叶片气孔器由2个哑铃
状的保卫细胞组成。有研究表明, 小麦叶片气孔保卫
细胞的长度可作为鉴定花粉植株倍性的一个指标(王
培等, 1989; 范光年和王培, 1990)。此外, 根据水浇
地及旱地条件下小麦旗叶叶尖气孔保卫细胞长度的
差值还可初步判断小麦不同基因型的耐旱性(王培等,
1990; 范光年, 1991; 范光年和王培, 1993)。因此, 小
麦叶片气孔保卫细胞长度观察方法的研究对倍性鉴
定和耐旱性判断具有重要意义。
小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备一般采
用直接撕取法(刘沛和顾沛雯, 1993)、刮制法(王培等,
1989)、透明胶带粘取法(陈佰鸿等, 2004; 段云峰等,
2008)和离析法(封涛和胡东, 2008; 师长海等, 2010)。
由于小麦叶片表皮与叶肉结合紧密, 在实际应用中使
用这些方法一方面需要操作者掌握熟练的表皮撕取或
刮制技巧; 另一方面叶片样品的长度需符合要求, 否
则不易进行操作, 由此导致成功率低和定位性差。
整体透明技术是植物学研究中常用的一种技术,
多用于植物花粉粒、胚、子房和病原物的观察(Koga
and Kobayashi, 1980; Bruzzese and Hasan, 1983;
Keane et al., 1988; 赵世绪等, 1993; Van Baarlen et
al., 2002; 陈庆亮等, 2005; Liberato et al., 2005;
Noyes and Allison, 2005; 李彦坤等, 2011)。经常使
用的透明剂有强碱、冬青油、甘油、“Herr41/2”、
水合氯醛、二甲苯、氯仿和丁香油等(Herr, 1971; 郝
建华和强盛, 2007)。近年来, 有研究者(赵志敬等,
2010)将整体透明技术用于半夏(Pinellia ternate)叶
表皮的形态观察, 获得了较好的效果。本实验探索利
用整体透明技术制备小麦叶片气孔保卫细胞观察样
品的可行性, 比较氢氧化钾等4种透明剂的透明效果,
期望找到一种操作方便、定位性好且清晰度高的小麦
叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以利用花药离体培养技术获得的未进行加倍处理的
小麦(Triticum aestivum L.)花粉植株叶片为试材。全
部花粉植株种于中国农业科学院作物科学研究所中
圃场实验田(北京)。于花粉植株拔节前(3月20日左右)
取样并挂牌标记。
1.2 实验方法
1.2.1 化学试剂
使用乙醇/乙酸混合液(6份无水乙醇与1份冰醋酸混
合)对样品进行固定; 用10%氢氧化钾溶液(1 g氢氧
·技术方法·
赵林姝等: 一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法 121
化钾溶于10 mL蒸馏水)、甘油溶液(1 mL甘油溶于2
mL蒸馏水)、饱和水合三氯乙醛溶液(4 g水合三氯乙
醛溶于1 mL蒸馏水)以及三氯乙醛和甘油混合液(8 g
水合三氯乙醛溶于1 mL甘油和2 mL蒸馏水)对样品进
行透明处理。所用试剂均购自北京化学试剂公司。

1.2.2 叶片处理方法
本实验中小麦叶片样品的制备分为3步。(1) 利用乙醇
和乙酸混合液对叶片样品进行固定, 其方法是用剪刀
剪取已挂牌小麦花粉植株的倒二叶叶片叶尖部分约
1.0 cm, 放入装有乙醇乙酸混合液的离心管中室温固
定24小时, 以使叶片样品停止分裂并保持活体状态;
(2) 去掉乙醇乙酸混合液进行脱水处理, 先用70%乙
醇室温浸泡30分钟, 再用无水乙醇室温浸泡2次, 每
次30分钟, 以利于下一步的透明处理获得较好效果;
(3) 去掉乙醇溶液, 用10%氢氧化钾溶液、甘油溶液、
饱和水合三氯乙醛溶液以及三氯乙醛和甘油混合液4
种透明剂对固定和脱水后的小麦叶片样品分别处理
2、4、6、24和48小时。为了获得较好的透明效果, 透
明处理前可用手术刀将叶片切成0.5 cm×0.5 cm的
小块。

1.2.3 叶片观察
使用OlympusSZX16体式显微镜对固定、脱水和透明
各步骤处理后的小麦叶片样品进行观察(背景为黑色)
并拍照。
用OlympusBX51显微镜对叶片的气孔及其保卫
细胞进行观察。观察样品的准备方法如下: 首先将不
同透明剂处理过的叶片样品置于载玻片上, 用手术刀
将叶片切成约1 mm大小, 之后在样品上滴一滴透明
液并盖上盖玻片。

1.2.4 保卫细胞长度测量及倍性分析方法和花粉植
株育性统计方法
使用DP2-BSW软件对花粉植株叶片气孔保卫细胞的
长度进行测量, 每个叶片测量4个气孔, 以4个气孔保
卫细胞长度的平均值作为该样品值。根据王培等
(1989)对小麦花粉植株叶片保卫细胞长度的测量结
果进行分析, 将保卫细胞长度大于65 μm的小麦花粉
植株归为二倍体, 其成熟期植株应表现可育; 保卫细
胞长度小于65 μm的小麦花粉植株归为单倍体, 其成
熟期植株应表现不育。
于成熟期调查统计田间育性。鉴于小麦自然异交
率小于5%, 故以结实率5%为划分标准。花粉植株全
部分蘖结实率均小于5%为不育株, 均大于5%为可育
株。
2 结果与讨论
2.1 不同步骤处理后的小麦叶片样品观察
小麦叶片经过固定处理后肉眼可见叶片完全褪色, 变
成黄色并且变脆(图1B)。进一步脱水处理后叶片仍为
黄色, 但变软, 易于用手术刀片进行切割(图1C)。
小麦叶片经4种透明剂——10%氢氧化钾溶液、
甘油溶液、饱和水合三氯乙醛及水合三氯乙醛和甘油
混合液处理后效果各不相同。透明剂处理时间对叶片
颜色无影响, 经10%氢氧化钾和甘油溶液处理2、4、
6、24和48小时后, 叶片均呈浅黄色(图1D, E); 经饱
和三氯乙醛溶液透明处理2、4、6、24和48小时后, 叶
片均呈白色(图1F); 经水合三氯乙醛和甘油混合液透
明处理2、4、6、24和48小时后, 叶片均变得完全透
明(图1G)。甘油溶液、饱和水合三氯乙醛及水合三氯
乙醛和甘油混合液3种透明剂处理时间对叶片结构均
无影响, 不同时间透明处理后叶片结构均保持完整。
10%氢氧化钾透明剂处理时间对叶片结构有影响, 处
理2或4小时后叶片结构完好, 但处理6小时后叶片结
构受到破坏, 必须用镊子轻轻夹取才能保持叶片完
整, 处理24和48小时后叶片受损加重, 特别是处理
48小时后叶片严重受损, 镊子轻轻一夹即破损。
2.2 不同透明剂处理后小麦叶片样品的显微观察
使用OlympusBX51显微镜对经过4种透明剂处理2、
4、6、24和48小时后的小麦花粉植株叶片样品进行
观察。结果表明, 叶片经不同时间的透明剂处理后,
在10倍(图2)和40倍(图3)物镜下的观察结果均无差
异。
不同透明剂的透明效果差异明显, 10%氢氧化钾
溶液透明处理2、4、6、24和48小时后, 10倍物镜下
均可观察到清晰的叶片表皮长细胞和长细胞之间的
短细胞、维管束、气孔器及表皮绒毛结构(图2A–E); 40
倍物镜下均可观察到气孔器结构, 但保卫细胞边界不
清, 不利于准确测量保卫细胞的长度(图3A–E)。甘油
122 植物学报 49(1) 2014



图1 OlympusSZX16体式显微镜下各步骤处理后的小麦叶片
(A) 新鲜叶片; (B) 固定处理后叶片; (C) 脱水处理后叶片; (D) 10%氢氧化钾处理后叶片; (E) 甘油溶液处理后叶片; (F) 饱和三氯乙
醛溶液处理后叶片; (G) 三氯乙醛和甘油混合液处理后叶片。Bar=500 μm

Figure 1 Wheat leaf profiles of different agent treatments via dissecting microscope OlympusSZX16
(A) Fresh leaf; (B) The leaf after fixing treatment; (C) The leaf after dehydration processing; (D) The leaf after treatment with
10%KOH; (E) The leaf after treatment with glycerite; (F) The leaf after treatment with saturation chloral hydrate; (G) The leaf after
treatment with mixed solution of chloral hydrate and glycerin. Bar=500 μm



赵林姝等: 一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法 123


图3 不同透明剂处理后小麦叶片的显微观察(40倍物镜)
(A)–(E) 10%氢氧化钾处理2、4、6、24和48小时后叶片; (F)–(J) 甘油溶液处理2、4、6、24和48小时后叶片; (K)–(O) 饱和三氯乙
醛溶液处理2、4、6、24和48小时后叶片; (P)–(T) 三氯乙醛和甘油混合液处理2、4、6、24和48小时后叶片。Bar=50 μm

Figure 3 Microscopic profiles of wheat leaf surface after whole clearing with different clearing agents (objective 40×)
(A)–(E) The leaf surface after treatment with 10%KOH for 2, 4, 6, 24, 48 hours; (F)–(J) The leaf surface after treatment with
glycerite for 2, 4, 6, 24, 48 hours; (K)–(O) The leaf surface after treatment with saturation chloral hydrate for 2, 4, 6, 24, 48 hours;
(P)–(T) The leaf surface after treatment with mixed solution of chloral hydrate and glycerin for 2, 4, 6, 24, 48 hours. Bar=50 μm
_________________________________________________________________________________________________________________
←
图2 不同透明剂处理后小麦叶片的显微观察(10倍物镜)
(A)–(E) 10%氢氧化钾处理2、4、6、24和48小时后叶片, 箭头示表皮绒毛; (F)–(J) 甘油溶液处理2、4、6、24和48小时后叶片, 箭
头示表皮绒毛; (K)–(O) 饱和三氯乙醛溶液处理2、4、6、24和48小时后叶片, 箭头示表皮绒毛; (P)–(T) 三氯乙醛和甘油混合液处
理2、4、6、24和48小时后叶片, 箭头示表皮绒毛。Bar=200 μm

Figure 2 Microscopic profiles of wheat leaf surface after whole clearing with different clearing agents (objective 10×)
(A)–(E) The leaf surface after treatment with 10%KOH for 2, 4, 6, 24, 48 hours, showing the leaf epidermal hairs; (F)–(J) The leaf
surface after treatment with glycerite for 2, 4, 6, 24, 48 hours, showing the leaf epidermal hairs; (K)–(O) The leaf surface after
treatment with saturation chloral hydrate for 2, 4, 6, 24, 48 hours, showing the leaf epidermal hairs; (P)–(T) The leaf surface after
treatment with mixed solution of chloral hydrate and glycerin for 2, 4, 6, 24, 48 hours, showing the leaf epidermal hairs. Bar=200 μm
124 植物学报 49(1) 2014
表1 整体透明技术应用于小麦花粉植株倍性鉴定的准确率
Table 1 Accuracy of identified chromosome ploidy by wholemount clearing techniques in wheat pollen plants
The length of stomatal guard cell (μm) The number of plants Fertile plants Sterile plants Accuracy (%)
65.0–90.6 87 83 4 95.40
35.6–60.0 144 2 142 98.61


溶液透明处理2、4、6、24和48小时后效果均不理想,
10倍物镜下图像均不清晰(图2F–J); 40倍物镜下可观
察到清晰的气孔、保卫细胞、副卫细胞及气孔结构(图
3F–J), 可准确测量小麦叶片气孔保卫细胞的长度。饱
和三氯乙醛、水合三氯乙醛和甘油混合液2种透明剂
处理2、4、6、24和48小时后叶片显微图像清晰, 在
显微镜物镜放大倍数为10倍时可清楚地观察到小麦
叶片表皮的长细胞和长细胞之间的短细胞、维管束、
气孔器及表皮绒毛结构(图2K–T); 在显微镜物镜放
大倍数为40倍时可观察到清晰的气孔、保卫细胞、副
卫细胞及气孔结构(图3K–T), 可准确测量小麦叶片
气孔保卫细胞的长度。
2.3 整体透明技术应用于小麦花粉植株倍性鉴定
的效果
使用OlympusBX51显微镜对用水合三氯乙醛和甘油
混合液透明处理6小时后的231株小麦花粉植株叶片
的保卫细胞进行观察, 结果全部小麦花粉植株的叶片
样品均观察到了清晰的气孔器图像, 说明此样品制备
方法不仅在个别样品的制备观察中可获得较好效果,
而且对大批量的样品观察同样适用。根据所测花粉植
株气孔保卫细胞的长度进行倍性分析(表1), 结果有
144株花粉植株预测为单倍体(图4A), 87株花粉植株
预测为二倍体(图4B); 成熟期在田间对这231株花粉
植株的育性进行了调查, 结果根据保卫细胞长度预测
为单倍体的144株中有142株不育, 准确率为98.61%;
根据保卫细胞长度预测为二倍体的87株中有83株可
育, 准确率为95.40%。说明本实验建立的小麦叶片样
品制备方法用于保卫细胞长度测量, 进而进行花粉植
株倍性鉴定是可行的。
2.4 讨论
小麦叶片细长, 直接撕取法(刘沛和顾沛雯, 1993)往
往会将叶肉带下, 无法准确观察; 胶带粘取法(陈佰
鸿等, 2004; 段云峰等, 2008)也存在表皮粘着叶肉的


图4 单倍体及二倍体小麦花粉植株的气孔保卫细胞
(A) 单倍体花粉植株气孔保卫细胞的长度为53.86 μm; (B) 二
倍体花粉植株气孔保卫细胞的长度为81.44 μm。Bar=50 μm

Figure 4 Stomatal guard cells in haploid and diploid an-
ther-derived plants of wheat
(A) Length of stomatal guard cells in haploid is 53.86 μm; (B)
Length of stomatal guard cells in diploid is 81.44 μm. Bar=50
μm


问题 ; 铬酸离析法(封涛和胡东 , 2008; 师长海等 ,
2010)是先将叶片中的叶肉破坏掉, 再剥离表皮, 在
表皮剥离过程中容易造成支离破碎。以上几种方法均
需要经过撕取叶片表皮的步骤, 都存在表皮与叶肉难
分离的问题, 不易撕取成功, 从而影响样品的观察效
赵林姝等: 一种小麦叶片气孔保卫细胞观察样品的制备方法 125
果。刮制法(王培等, 1989)在刮制时力度和角度不易
掌握, 会出现叶肉刮除不彻底的现象, 从而影响样品
观察的清晰度。本实验利用整体透明技术制备小麦叶
片气孔保卫细胞观察样品, 只需对叶片进行固定、脱
水和透明3个步骤即可在显微镜下进行观察, 免去了
表皮撕取或叶肉刮制步骤, 操作简便易行, 取材少、
成本低、定位性好、压片清晰度高且气孔真实性好, 适
用于幼嫩和成熟叶片的气孔观察, 为小麦花粉植株倍
性鉴定研究中大量的、成批的气孔保卫细胞观察提供
了一种方便、快捷且高效的样品制备方法。
本实验选用4种透明剂, 每种透明剂选用5种处
理时间(2、4、6、24和48小时)对小麦花粉植株叶片
进行处理。显微观察结果表明, 经不同时间透明处理
后的叶片, 其气孔保卫细胞清晰度无差异。因此在实
际工作中进行大量样品观察时, 可以不受时间限制,
为大量样品的观察提供了方便。经不同透明剂处理后
的叶片, 其气孔保卫细胞清晰度差异明显, 其中甘油
溶液、饱和三氯乙醛及水合三氯乙醛和甘油混合液3
种透明剂处理叶片后, 40倍物镜下均观察到了清晰的
气孔结构, 可精确地进行气孔保卫细胞长度的测量。
由于水合三氯乙醛具有一定的刺激性气味, 从环保安
全角度考虑, 在制备小麦叶片气孔保卫细胞观察样品
时建议选用甘油作为透明剂。
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126 植物学报 49(1) 2014
A Method to Improve Sample Preparation for Observing Stomata
Guard Cells in Triticum aestivum
Linshu Zhao, Luxiang Liu*, Jiayu Gu, Huijun Guo, Junhui Li, Yongdun Xie, Shirong Zhao
Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Science/National Center of Space Mutagenesis for Crop
Improvement, Beijing 100081, China
Abstract We developed an efficient whole-leaf clearing method for observing stomata guard cells of anther-derived
plants in Triticum aestivum. We compared the effect of 4 different clearing agents. With this method, we could obtain a
sample for observing stomata guard cells in wheat without mesophyll tearing and shaving. After leaf treatment with glyc-
erite, saturation with chloral hydrate and mixed solution of chloral hydrate and glycerin revealed clear images of stomata
guard cells by microscopy.
Key words anther-derived plant, ploidy identification, guard cells, Triticum aestivum, whole-leaf clearing technique
Zhao LS, Liu LX, Gu JY, Guo HJ, Li JH, Xie YD, Zhao SR (2014). A method to improve sample preparation for ob-
serving stomata guard cells in Triticum aestivum. Chin Bull Bot 49, 120–126.
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* Author for correspondence. E-mail: liuluxiang@caas.cn
(责任编辑: 孙冬花)