全 文 ：·综述·
HPLC法在生物碱分析中的研究进展
李晓海, 周同惠
(中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所, 北京 100050)
摘 要: 生物碱是植物中一类重要化学成分,许多生物碱或含生物碱的提取物已广泛用于医药领域, 因此对不同来
源的, 存在于较复杂体系或基质中的生物碱进行快速、灵敏、可靠的定性、定量分析一直是受人瞩目的研究课题。本
文对近年来 HPLC 分析生物碱理论与应用的研究进展进行概述。
关键词: HPLC; 生物碱;含量测定
中图分类号: R286. 022 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2002) 04 0368 05
Advances in analysis of alkaloids by HPLC
L I Xiao-hai, ZHOU T ong-hui
( I nstitute of M ateria Medica, Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical Co lleg e, Beijing 100050, China)
Key words : HPLC; alkalo ids; assaying
生物碱是植物中一类重要化学成分, 至少有 50 多科
120 余属的植物中已证明有生物碱存在[ 1]。目前人们研究发
现的约有一万二千余种, 大多具有较强生理活性。许多生物
碱或含生物碱的提取物已广泛用于医药领域,如阿片中镇痛
成分吗啡,麻黄中抗哮喘成分麻黄碱等; 许多滥用药物亦是
生物碱,如士的宁、可卡因、海洛因等; 同时食物或草药中常
含有一些有毒的生物碱, 如肝毒性吡咯里西定类生物碱[ 2]已
引起国际医药学界重视。因此对不同来源的, 存在于较复杂
体系或基质中的生物碱进行快速、灵敏、可靠的定性、定量分
析一直是受人瞩目的研究课题[ 3]。其中HPLC 法由于其具有
较高效的分离效能, 较宽的适用范围及条件优化的灵活性等
优点在生物碱分析中得到广泛应用[ 4]。Kabulo vB D[ 5]曾对
90年代前的生物碱 HPLC 分析法进行了较全面的综述。本
文对近年来 HPLC 分析生物碱理论与应用的研究进展进行
概述, 以对从事分析工作的科学工作者有一定借鉴意义。
1 生物碱 HPLC 分析模式及机制
根据 HPLC 分析生物碱时所使用固定相性质, 流动相
组成及极性不同,其分析模式大致可分为: 正相吸附色谱法、
正相硅胶-反相洗脱系统色谱法、反相色谱法及离子交换色
谱法。
1. 1 正相吸附色谱法: 通常以硅胶基质为吸附固定相, 流动
相为不同极性的有机溶剂或不同比例混合溶剂, 分离过程主
要依靠生物碱与吸附剂吸附作用的差异实现, 为了改善分
离,提高溶剂洗脱能力, 常于流动相中加入浓氨液、二乙胺、
三乙胺等[5]。近年来该法应用于生物碱分析的文献较少,傅
应华等[ 6]使用 Alltima 正相硅胶柱, 以氯仿-甲醇-浓氨液
( 90∶10∶0. 3)为流动相,紫外法检测,建立了测定马钱子中
士的宁和马钱子碱含量的方法, 两者分离及峰形良好, 其它
应用见表 1。
1. 2 正相硅胶-反相洗脱系统色谱法( NS-RE ) :通常采用未
表 1 正相吸附色谱法在生物碱分析中的应用
生物碱 固定相 流动相 检测器 文献
氧化苦参碱 Spherisorb-S iO 2, 5 m
25 cm×4. 6 mm
meth anol-hex ane( 4∶1)
1. 2 m L 28% NH3-H2O/ 100 mL
UV220 25
莲心碱,异莲心碱,
甲基莲心碱
Utrasphere Si
25 cm×4. 6 mm
CH2Cl 2-is opropan ol-Et 2NH
70∶30∶0. 2
UV 26
马钱子碱,士的宁 Plat inum s ilica, 3 m
15 cm×4. 6 mm
hexan e-CH2Cl 2-methanol-NH3
47. 5∶47. 5∶5∶0. 35
UV254 27
经化学改性的普通硅胶为固定相, 以极性有机溶剂(甲醇、乙
腈)和高 pH 缓冲溶液为流动相, 分析包括生物碱在内的碱
性药物。该法柱效高,峰形对称, 是简便有效的方法[ 7]。在实
际应用中,流动相的组成是主要影响因素, 流动相中除含有
调节 pH 的缓冲盐外,有时还要加入三乙胺、溴化四丁基铵
等竞争离子或烷基磺酸钠等对离子,因此,影响保留与分离
的主要因素是流动相pH、竞争离子种类及浓度。周桂生等[8]
称该法为正相硅胶柱-准离子交换色谱法, 并建立了测定马
·368· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002 年第 33卷第 4期
收稿日期: 2001-06-20作者简介:李晓海( 1970-) ,男,河北怀安县人,中国医学科学院药物所分析专业 99级博士生,主要从事中药成分分析及常用中草药成分代谢转化研究。
钱子中士的宁含量的方法; 刘乃强等[ 9]用正交试验法对该法
所用溶剂系统进行了研究, 发现它既不同于正相硅胶吸附
法, 亦不同于反相分配法,组分色谱行为与其脂溶性或极性
无关, 生物碱碱性大小( pK a)以及碱性基团的多少成为主要
影响因素, 该法有效地避免了生物碱在分配(或吸附)柱上保
留时间长、峰形拖尾的缺点 , 作者认为该法有可能成为
HPLC 分析生物碱的新趋势。魏清芳[10]亦采用未改性硅胶
柱建立了测定复方黄连注射液中硫酸小檗碱及甲氧苄氨嘧
啶含量的方法, 流动相中使用了有机改性剂三乙胺, 并讨论
了改变流动相 pH、离子强度及加入三乙胺对分离的影响, 得
到了类似结论。
1. 3 反相高效液相色谱法( RP-HPLC) : 近年来 RP-HPLC
应用于生物碱分析方面的文献很多,已成为常规的方法, 应
用实例见表 2。但普通存在色谱峰的展宽拖尾,导致分离效
能低,这主要缘于生物碱结构中碱性氮原子与固定相未键合
酸性硅醇基的相互作用[4] , 即使是所测生物碱在较低浓度
下,仍常产生峰漂移及峰对称性差等现象。针对此缺陷,研究
工作者从适用于碱性物质分析的反相填料的设计选择[ 11, 12] ,
流动相中缓冲盐的使用,流动相添加剂(离子对试剂、有机胺
改性剂)等几方面进行了较为广泛细致的研究, 取得了一定
进展,现从固定相、流动相优化两方面进行评述。
1. 3. 1 固定相的选择: 近年来,适用于碱性物质分析的反相
表 2 RP-HPLC在生物碱分析中应用
生物碱 固定相 流动相 检测器 文献
psychot ridin e, pyrrolidi-
noindolin e and quindin e
alkaloids
S ymmetry C18, 5 m
25 cm×4. 6 mm
meth anol-H2O-E t2NH 720∶280∶1 to
850∶15∶1 in 25 min
U V,
T SI/ MS
28
钩藤碱 rhyn choph ylline,
is orhynch ophyll ine
Phenomenox C 18, 5 m
25 cm×4. 0 mm
CH3OH-H2O( 55∶45) 0. 01 mol·L-1 Et 3N
adjust pH to 7. 5 w ith HAc
U V254 29
in dole alkaloids ,
蛇根碱,阿吗碱等
Nucleosil 5 C18, 5 m
25 cm×4. 6 mm
MeOH -A CN-25 mm ol·L-1 sodium acetate-E t3N
( 15∶40∶45∶0. 1)
U V280 30
plasma, urin e,
青风藤碱, sinomenin e
ODS ACN-0. 01 mol·L-1 NaH2PO 4-tet rameth yldieth y-
lamine( 46∶54∶0. 22) adjust pH6. 9
U V263 31
human serum,
caf feine, p araxanthine
S upelco LC-18-DB 0. 05 m ol·L-1 NaH2PO 4, containing E t3N
( pH6. 4) / MeOH( 830∶160)
U V273 32
plasma or organ t issue
colch icine
LiC hrosph er 100RP-18, 5 m
25 cm×3. 9 mm
Gradient elut ion A: ACN B: 0. 03 mol·L-1
( NH4) 2HPO4, 0. 1% Et 3N, pH3. 0
U V 33
bisbenzylis oqu inoline:
alkalaids aromoline,
obamegine, berber ine
M icrosorb-MV C 18, 5 m
25 cm×4. 6 mm
ACN/ 0. 05 mol·L-1 KH2PO4 bu ffer ( 27 ∶73)
containing 2 mmol·L-1 sodium h eptanesulphon ate
0. 1% Et 3N
U V207 34
at ropine, atr op ine-l ike
alkaloids at ropine,
h om at ropine
U lt raspher, 5 m CN
25 cm×4. 6 mm
H2O-ACN-THF( 67∶30∶3) containing 1 mm ol·L-1
perchloric acid
ECD 35
colch icine alk aloids Hypersil C 18
10 cm×4. 6 mm
Gradient elut ion ACN-KH2PO 4 buf fer( pH4. 5) -T HF U V 36
-carboline alk aloids S him-pack CLC C8, 5 m
25 cm×4. 6 mm
ACN-T FA-H2O ( 90∶1∶409) FD 37
野罂粟碱 YWG-C18
25 cm×3. 9 mm
ACN-CH3OH-Et 3N phosphate ( 15∶10∶75) , pH3. 0 U V261 38
rh ynchoph yllin e Phenomenex C18, 5 m
25 cm×4. 0 mm
MeOH -H 2O( 55∶45) 0. 01 mol·L-1Et 3N , pH7. 5 U V254 39
codeine, ephedrine u-Bondapak ODS, 5 m
15 cm×4 mm
0. 05 m ol·L-1KH2PO 4( 1% Et 3N, pH3. 0) -
0. 005 m ol·L-1 IPR-B6 M eOH solut ion( 1. 2∶1)
U V254 40
填料的设计和选择日益受到重视。Haber lein 等[ 11]指出 RP-
HPLC 分析生物碱时峰拖尾变形,分离效能差的程度与所选
用的反相填料的性质相关, 主要受反相填料硅醇基活性, 硅
胶基质的性质, 硅烷化试剂的差异等因素影响, 并利用29Si
及 13C-CP-MAS-NMR 谱学手段阐明了反相填料 Nucleo sil
100AB 及 L iChro spher 60RP-select B 各自结构特征及差别,
以及这些差别在分离、分析白屈菜属生物碱黄连碱、白屈菜
碱以及小檗碱时对分离效果的影响, 得出选择合适固定相对
于分析生物碱是必要的结论。Theodo ridis G 等[ 13]测试比较
了专用于碱性化合物的 HPLC 分析设计的新型柱填料, 其
中包括硅胶基体的甲基苯基-丙基甲硅烷基、硅胶基体的 C18
和 C8, 以氧化铝和聚苯乙烯-二乙烯苯为基体的聚合物填料
以及混有阳离子交换-C18功能的填料, 针对每种柱填料均进
行了流动相组成的优化, 碱性化合物在这些 C18柱和聚合物
柱上得到满意的分离效果,以不同柱填料为固定相对生物碱
的分离、分析呈现明显选择性差异, 这些新柱填料已被用于
金鸡纳生物碱和长春花生物碱的分析。Imaz C 等[14]以尿中
麻黄碱类生物碱的分析为评价依据,比较了几种专用于碱性
物质分析的反相柱 L iChro spher 60RP-select B、L iChro-
spher-100RP 18、Hypersil BDS-C18、Inert sil ODS-2、Spher iso-
rb ODS-B、Symmet ry Shield RP8 的分析效果, 结果表明麻
黄碱类生物碱在各种反相柱均得到较佳分离效果, 所建立的
方法适用于该类兴奋剂检测。最后需要指出的是, 一个合理
客观的评价碱去活反相柱性能的标准可以为选择合适的反
相柱提供依据 , McCalley D V [15]针对烟草类生物碱在不同
碱去活性反相柱分离效果与反相柱性能比较结果不符, 提出
了以尿嘧啶作为死体积标示物, 以吡啶代替 N , N—二甲苯
胺作测试物,所测得的柱效及拖尾因子可提示不同柱填料性
·369·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002 年第 33卷第 4期
能之间的差异。总之, 近来出现的许多适于碱性物质分离的
反相填料,具有比常规填料更好的重现性、更高的耐酸碱稳
定性以及不易受次级保留作用的影响, 提高了生物碱 RP-
HPLC 分析固定相选择的灵活性。
1. 3. 2 流动相添加剂的选择: RP-HPLC 分离、分析包括生
物碱在内的碱性化合物时, 为克服硅醇基的不利影响,从流
动相角度入手,多从以下途径加以改善: 在合适 pH 值下,
流动相中加入低浓度离子对试剂[ 16] (见表 3) ; 流动相中加
入一定浓度的电解质缓冲盐,通过改变流动相离子强度, 稳
定 pH 值及促进离子对相互作用而起到改善色谱峰形、分离
选择性及分离效能,通常可加入无机盐类( NaOAc、KI、KBr、
NH4OAc、NaSCN、NH4SCN 及 NBu4I 等) , 起到掩蔽硅醇基
的作用; 加入有机胺改性剂 ,竞争或部分阻断硅醇基的影
响,通常使用二乙胺、三乙胺、二甲基辛胺等。上述方法的综
合运用,可以有效地改善峰形, 提高分离效能, 因而得到广泛
的应用。但不足的是,这些有效的流动相添加剂实际应用中
常导致平衡时间长,基线噪音强, 清洗柱系统时间长, 反相柱
长期使用的稳定性降低,腐蚀仪器等缺点[ 3]。
表 3 反相离子对 HPLC在生物碱分析中的应用
生物碱 固定相 流动相 检测器 文 献
morp hine, codeine,
thebaine, papaverine,
noscapine
Hypersi l BDS
25 cm×4 mm
gradient elu tion A : pH3. 2 Sodium heptanesu lfon ate
( 1 g/ 390 mL) B: ACN
UV 41
nicot ine, es erin e,
cocaine, st rych ine
ODS, 5 m
25 cm×4. 6 mm
A: pH3. 0 0. 01 mol·L-1 sodiumoctyls ulfonate
0. 05 mol·L-1 Cit ric acid B: m ethanol ( A∶B 11∶
9)
DAD 42
bisbenzylis oqu inoline
alkaloids : aromolin e,
obamegine, berbam ine,
hom oarmol ine
m icrosorb-MVC18 5 m
25 cm×4. 6 mm
pH3. 0 50 mmol·L -1 potassium phosphate buf fer/ ACN
( 27∶73) ( containing 0. 1% E t2NH 2 mmol·L-1 sodi-
um heptanesul fonate)
UV207 43
plasma, urin e, codein e
and metabolit es
Zorbax C8, 5 m
15 cm×4. 6 mm
ACN/ buf fer ( 77∶23)
suf fer: 5 mmol·L-1 NaH 2PO 4, 0. 7 mm ol·L-1
sodium dodecylsulfate
UV214,
ECD
44
1. 4 离子交换色谱法:该法以阳离子交换树脂为固定相, 利
用质子化的生物碱阳离子与离子交换剂交换能力的差异而
达到分离生物碱的目的, 有关生物碱高效液相离子交换色谱
法的应用报道较少。Bo rg P J 等[ 17]使用 What man Partisil
10SCX阳离子交换色谱柱建立了测定大鼠脑及血浆中吗啡
的离子交换色谱-电化学检测法, 分离效果好, 测定的专属
性、灵敏度高; Cro es K 等[18]使用 Spher iso rb S5SCX (磺丙基
键合硅胶)强阳离子交换树脂为固定相,以具有合适 pH 值
及离子强度缓冲液(高氯酸或高氯酸铵)甲醇体系为流动相,
建立了测定包括奎宁、可待因、吗啡在内的碱性药及季铵类
化合物的 HPLC 方法,分离效果及峰形均较佳。
2 生物碱 HPLC分析检测方法
目前, 生物碱 HPLC 分析检测方式多以紫外法为主, 在
定性分析方面, 紫外法检测选择性低,定性专属性差。随着二
极管阵列检测器使用的普及, 显著提高了液相分析检测的选
择性。此外,根据生物碱的理化性质, 其它检测方式如荧光
法、电化学法、蒸发光散射法亦得到了应用。朱龙等[ 19]建立
了 RP-HPLC 化学发光检测吗啡、可待因的方法,获得了比
紫外法检测更高的灵敏度; 朱丹妮[ 20]建立了测定贝母类药
材生物碱的 HPLC 方法,以蒸发光散射检测, 排除了杂质的
干扰。近年来, 液相色谱-质谱联用技术已应用于生物碱分
析, 增强了对生物碱的定性检测能力 ,提高了检测灵敏度[3]。
Chuang 等[ 21]用紫外和电喷雾质谱 ( ESI-MS)测定黄连中的
7 种生物碱, 通过追踪选定离子来解决重叠峰问题, 用诱导
碰撞裂解反应获得单个组分的结构信息, 1 h 内分离鉴定了
黄连粗提物中黄连碱、小檗碱等。新的接口技术及离子化方
法的发展, 使得 HPLC-MS 在生物碱的分析中得到较广泛的
应用,近年的文献报道日渐增多。
3 生物碱 HPLC 分析的样品处理方法
生物碱常具有一定的碱性,一般常用碱化液液萃取或酸
水提取等方法从中草药、中成药及生物样品等较复杂体系中
提取纯化,以达到富集和去除杂质的目的。近年来,固相萃取
( SPE)技术及超临界流体萃取等现代提取纯化技术亦应用
于样品的提取纯化。Yuan Y F [ 22]在测定紫堇属延胡索中
DL -延胡索乙素时, 将样品干燥粉碎后,与适量 Ca( OH) 2混
合碱化,利用混有甲苯的超临界 CO2 进行萃取,待测成分萃
取率较高,杂质干扰少。Hur lbut J A [23]利用固相萃取技术,
建立了从生药中提取麻黄碱类生物碱的方法。SPE 作为一种
有效的样品预处理及净化技术,在 HPLC 测定法医或临床
来源的生物样品中的生物碱得到充分应用[ 24]。
5 结语
本文较全面地综述了 HPLC 应用于分析生物碱的各种
模式及应用特点。其中,正相吸附色谱的应用范围窄,不适用
于生物体液样品的测定; 正相硅胶-反相洗脱色谱法具有碱
性药物保留时间短, 拖尾改善 ,峰形对称, 流动相组成简单,
固定相稳定 ,选择性好等优点 ,近年来成为分析生物碱及碱
性药物的一种有效方法; RP-HPLC 目前仍是分析生物碱的
主要手段, 值得一提的是, 由于未键合残留硅醇基使得生物
碱的分析受到不利影响,不同型号甚至同一型号不同批号的
ODS 柱所得分析结果重现性极差, 针对这些问题,人们开始
关注问题的焦点——反相填料的性能,逐渐开发出适用于碱
性物质分析的新型反相填料及碱去活色谱柱, 使得生物碱
HPLC 方法建立得以简化, 估计今后更有效地分析包括生物
碱在内的碱性药物的新型固定相将会不断涌现。另外, 随着
·370· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002 年第 33卷第 4期
二极管阵列检测技术、LC-MS 联用技术的日趋普及与完善,
生物碱 HPLC 分析的定性鉴别能力大大得到加强。总之, 随
着适用性好、高性能反相填料的生产及使用, 流动相添加剂
理论及应用的成熟以及灵敏度高、定性鉴别能力强的检测方
法的综合运用, HPLC 方法仍将在生物碱的分离、分析中扮
演主要角色。
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一种尚待开发的中药——竹黄
钟树荣,赵 海, 李安明,戚天胜
(中国科学院成都生物研究所,四川 成都 610041)
摘 要: 竹黄是中国传统的中药之一。从生态学、药物化学、药理作用及临床应用等方面对竹黄的研究现状作了较
为全面的介绍, 初步探讨了竹黄研究中存在的问题, 指出其微生物学、生态学和分子生物学等领域的研究尚待深
入。并且认为光敏色素——竹红菌素有望发展成为新型的抗肿瘤和抗病毒药物。
关键词: 竹黄;竹红菌素; 自敏光氧化;光损伤
中图分类号: R282. 71 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2002) 04 0372 03
Potential TCM——Shiraia bambusicola
ZHONG Shu-rong, ZHAO Hai, L I An-ming , Q I T ian-sheng
( Chengdu Institute o f Biolog y, Chinese Academ y of Sciences, Chengdu Sichuan 610041, China)
Key words : Shiraia bambusicola Henn. ; hypocr ell ins; auto-sensitized pho to oxidation; photodamage
竹黄 Shiraia bambusicola Henn. 别名赤团子、竹赤团
子、竹茧、竹赤斑菌、淡菊花、天竹花、淡竹花、竹花等,为肉座
菌科( Hypocr eaceae)真菌竹黄寄生于特定竹类上形成的子
实体(也叫子座)。其性温味淡, 具有止咳祛痛、舒筋活络、祛
风利湿、补中益气、活血补血、散瘀通经之功效。主要分布于
我国江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、四川、贵州等地。民
间用于治疗虚寒胃痛、风湿性关节炎、气管炎, 百日咳、坐骨
神经痛、跌打损伤、贫血头痛等症, 是我国一种重要的中药资
源[ 1]。目前, 随着竹黄中具有光敏活性的竹红菌素(竹红菌甲
素和竹红菌乙素)的发现,竹黄的研究日益受到重视。为使读
者对竹黄有一个全面的认识, 更好地开发利用宝贵的自然资
源, 现将竹黄的国内外研究现状概述如下。
1 生态学
竹黄的主要寄主为短穗竹属(B rachy stachyum Keng )植
物。其中最重要的为短穗竹 B . densif lorum ( Rendle) Keng
及其变种毛环短穗竹 B . d ensif lorum ( Rendle) Keng var .
villosumS. L . Chen et C. Y . Yao, 并且发现竹黄的另一种重
要的新寄主植物——白纹短穗竹 B . albostr iatum G. H.
Lai。竹黄在不同生境竹林中的寄生状况也颇有不同: 竹黄
在山凹洼地或阴坡湿润阴凉生境竹林中的寄生率明显高于
其它生境竹林;在纯竹林中的寄生率高于混交林。每年 5 月
下旬至 6 月上旬为竹黄最佳生长发育期, 也是其最佳采收
期[2]。
2 化学成分
2. 1 主要色素及自敏光氧化反应机制: 竹黄中分离提纯的
色素主要有竹红菌甲素( hypocrellin A, 简称 HA)和竹红菌
乙素 ( hypocrellin B,简称 HB) , 二者均属 醌类衍生物, 统
称为竹红菌素[ 3]。此两种色素首先自竹红菌 Hypocrella bam-
busae Sacc中发现,因而得名(图 1)。
图 1 竹红菌素的结构式
张志义等从光生物学角度, 用电子自旋共振( ESR)等近
代技术, 探讨了 HA 光敏作用原初反应的特征。结果表明,
·372· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002 年第 33卷第 4期
收稿日期: 2001-09-14作者简介:钟树荣( 1977-) ,女,云南会泽人,中科院成都生物所在读硕士研究生,指导教师李安明,目前从事高等真菌的研究工作。
E-mail: sarazhong@ hotmail. com