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xtraction ofAstragalus polysaccharides bycellulase

纤维素酶法提取黄芪多糖



全 文 :·1804· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
纤维素酶法提取黄芪多糖
闫巧娟,韩鲁佳。,江正强
(中国农业大学工学院,北京100083)
摘 要:目的 研究纤维素酶处理对黄芪多糖提取效果的影响。方法 以提取液的总糖和还原糖为考察指标,确定
纤维素酶处理工艺。通过不同提取方法提取多糖及扫描电镜分析,探讨纤维素酶处理的效果。结果纤维素酶处理
条件的优化为纤维索酶加入量为60U/g生药,酶处理时间90min,温度50℃。与对照工艺相比得率由24.4%提高
至30.3%,增加率为24.2“.而多糖的质量分数基本不变。扫描电镜观察表明,纤维素酶明显地分解了黄芪原料中
的部分结构多糖,药渣中的网状结构变得十分清晰。结论纤维素酶处理有助于黄芪多糖的提取,能显著提高黄芪
多糖的得率。
关键词:黄芪多糖I纤维素酶,扫描电镜
中图分类号:R286.02 文献标识码:B 文章编号:02532670(2005)12—1804—04
ExtractionofAstragaluspolysaccharidesbycellulase
YANQiaojuan,HANLu—jia,JIANGZheng—qiang
(EngineeringCollege,ChinaAgr culturalUniversity,Beijing100083,China)
Keywords:Astragaluspolysaccharides(APS);cellulase;scanningelectronmicro opy(SEM)
近年来,酶法用于中草药有效成分的提取呈增
加趋势,通过选用合适的酶制剂能够提高皂苷类、蛋
白类、黄酮类以及多糖类等活性成分的得率。关于酶
法提取多糖已经有些报道,常用的酶制剂包括纤维
素酶、半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶“’“。黄芪的药用
部位为根,多糖是其主要的功效成分之一。黄芪多糖
几乎均以a一糖苷键相连,且有的多糖属于果胶类多
糖o]。中草药的细胞壁大多主要由纤维素构成。黄芪
原料及药渣中纤维素的质量分数较高,分别为26%
和48%左右。因此,结构多糖中的纤维素可能是制
约黄芪多糖最大限度溶出的主要物质。纤维素是由
D一葡萄糖p一1,4糖苷键连接而成,纤维素酶则能特
异性地降解纤维素生成葡萄糖等低相对分子质量的
糖。因此,本研究探讨纤维素酶法提取黄芪多糖,旨在
提高黄芪多糖的得率和最大限度地利用黄芪资源。
1材料与方法
1.1 主要仪器:回流提取装置(规格为1L和10
L),实验室组装;TU--1800SPC紫外可见分光光度
计(北京普析通用仪器有限责任公司),旋转蒸发器
(上海亚荣生化仪器厂),AB204一B型电子分析天
平(瑞士梅特勒公司),LGJ一18型冷冻干燥机(北
京四环科学仪器厂),LxJ一ⅡB低速大容量多管离
心机(上海安亭科学仪器厂),SCD005Sputter
Coater离子溅射金,FEIQuANTA200扫描电镜
(PHILIP)。
1.2 原料与试剂:黄芪为山西产蒙古黄芪
Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.
mongholicus(Bge.)Hsiao(炮台芪),由北京同仁堂
饮片厂提供。提取用水均为蒸馏水,分析用水均为双
蒸水。葡萄糖对照品(Sigma公司),重蒸酚、乙醇、硫
酸等均为国产分析纯,纤维素酶(初始活力单位1
800U/g,唐山太博尔生物工程有限公司)。
1.3分析方法:采用苯酚一硫酸法测定多糖。精密取
2ml。样品溶液,分别加入5%苯酚溶液1.0mL,摇
匀,迅速加入5.0ml。浓硫酸,振摇5rain,置沸水浴
上加热15min,然后置冷水浴中冷却30min,随行
空白对照,在490nm波长处测定吸光度。用标准曲
线计算多糖量。
采用Somogyi法测定直接还原糖。取5mI,样
品溶液,加入试管(230mm×21mm)中,然后加入5
mLSomogyi试剂,漩涡混合器上混匀。将试管I=I盖
上玻璃珠,置于100℃沸水浴中反应15min后,流
动冷水浴冷却至室温。加入2mL2%KI溶液,1.5
mL1 mol/LH。SO。溶液,漩涡混合器上混匀。用
收稿日期:20050215
基金项目:国家“十五”攻关课题(9002BA514—12—3)
作者简介:同巧娟(1971),女,河北衡水人,博士,副教授,主要从事生物物质资源及天然生物活性物质的研究。Tel:(010)62736778
E—mail:yanqj@call.edu.cn

*通讯作者韩鲁佳
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 805·
0.005moULNa。S。o。溶液进行滴定,接近终点时
加入1~2滴1%淀粉指示剂,继续滴定至终点(亮
蓝色)。
2结果分析
2.1纤维素酶处理条件的确定:称取一定量的黄芪
粗粉,加入10倍量水,提取2h后滤过,滤渣均分。
每份折合黄芪生药10g,置于消化管中,升温至所需
温度,加酶保温。迅速升温至沸腾继续提取1h,
3000×g离心15min,测定提取液中总糖和还原糖
的变化。分别进行纤维素酶加入量、酶处理时间和温
度对黄芪多糖提取的影响试验,试验重复3次,各指
标取平均值。文献报道将总糖与还原糖质量浓度之
差作为多糖质量浓度“]。考虑到黄芪中含有较多的
蔗糖,由于蔗糖极易溶于水而被提取出来,总糖与还
原糖质量浓度之差的变化能近似反映出黄芪多糖质
量浓度的变化。所以,本研究以总糖与还原糖质量浓
度之差为主要指标考察纤维素酶对黄芪多糖提取的
影响。
2.1.1 酶加人量:将滤渣加入8倍量水,纤维素酶
加入量分别为0、30、60、90、120、150U/g生药,处
理温度为50℃,处理时间为2h。纤维素酶加入量对
黄芪多糖提取的影响见图1。可以看出,还原糖和总
糖的质量浓度均随着加酶量的增加而逐渐增大,其
中还原糖的质量浓度随加酶量的增加几乎呈直线增
加,而总糖增加的趋势则随加酶量的增加渐缓。加酶
量从30U/g增至60U/g时,总糖与还原糖质量浓
度之差大幅度增加;从60u/g增至150U/g的过
程,增长趋势比较平缓。
10.00
,8.00
:600
E
菩400
蔷2oo

000
0 30 60 90 120 150
加酶坦/(u·911
】总糖2总糖还原错3一还原糖
/一totalsugar2 totalsugareducingsu ar3-reducings119a‘
图1纤维素葡加入量对黄芪多糖提取的影响
Fig.1Effectofcellulasedo ageonxtraction
ofAstragaluspoIysaccharides
2.1.2酶处理时间:将滤渣加入8倍量水,根据加
酶量的试验结果,取加酶量为60U/g生药,分别保
温0、30、60、90、120、180rain,保温温度为50℃。纤
维素酶处理时间对黄芪多糖提取的影响见图2。可
以看出,随酶处理时间的增加,还原糖和总糖的质量
浓度不断增加。反应时间由o~90min这一阶段总
糖与还原糖质量浓度之差大幅上升,几乎星线性增
长,从90~180rain这一阶段的上升趋势逐渐平缓。
1总糖2总糖一还原橱3还原糖
1一tota]sugar2 totalsugareducingsu ar3 reducingsu ar
圈2纤维素酶处理时间对黄芪多糖提取的影响
Fig.2Effectofincubationtimeextraction
ofAstragaluspoIysaccharjdes
2.1.3保温温度:将滤渣加入8倍量水,加酶量为
60U/g生药,根据酶处理时间的试验结果,保温时
间90rain,保温温度分别为35、40、45、50、55℃。不
同温度对黄芪多糖提取的影响见图3。结果表明,酶
处理温度从35℃逐渐增至55℃时还原糖在50℃
时质量浓度较高,其他温度下差别不大;总糖、总糖
与还原糖质量浓度之差在35~50℃逐渐上升,在
45~50℃达到最大值,之后又慢慢下降。

g

E





000
800
600
400
200
35 40 45 50 55
温度/℃
1总糖2总糖一还原糖3一还原糖
1-totalsugar2-totalsugar——reducings gar3 reducingsugar
田3纤维素酶处理温度对黄芪多糖提取的影响
Fig.3Effectof reatmentt mperatureonextraction
ofAstragaluspoJysacchnrides
综合以上纤维素酶处理各因素对黄芪多糖提取
的影响,得到纤维素酶处理的最佳条件为:加酶量
60u/g。酶处理时间90min,处理温度50℃。
2.2不同方法提取黄芪多糖的效果:根据所得到的
纤维素酶处理的最佳工艺条件提取黄芪多糖。酶处
理工艺为:纤维素酶加入量为60u/g生药,酶处理
时间90min,温度50℃。每次试验取生药800g,第
一次提取加10倍量水,提取2h,第二次加8倍量
一.、{如g),巡蛙删蜒
万方数据
·1806· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
水,提取1.5h的工艺作为传统工艺口]。加酶工艺按
上述酶处理条件在第一次提取完成后,将滤渣加水
后进行酶处理,然后升温灭酶后继续提取1.5h。同
时进行按照加酶工艺保温但不加酶的对照试验。将
各工艺的两次提取液分别合并浓缩,加入4倍量无
水乙醇进行醇沉,干燥后计算得率并测定多糖的质
量分数重复3次,取均值。不同方法提取黄芪多糖的
效果见表1。结果表明纤维素酶处理工艺的多糖得
率比传统方法有较大幅度提高,多糖得率由24.4%
提高至30.3%,增加率为24.2%。比对照的多糖得
率25.2%提高了20.2%。可见,在酶处理工艺中的
保温条件对得率的提高有一定影响,但影响不大。3
种方法所得多糖质量分数为56.1%~56.6%,变化
不大。
裹1不同方法提取黄芪多糖的效果
Table1 YieldandcontentofAstragaluspolysaccharides
extractedbydifferentm thods
2.3黄芪原料及药渣的扫描电镜图:将黄芪原料,
酶处理工艺和传统工艺所得药渣的粉末进行离子溅
射金处理后扫描电镜观察。黄芪原料、药渣的1000
倍下扫描电镜观察见图4。黄芪原料可见较模糊的
纤维状物质,上面有较多的粒状物,可能是淀粉粒、
蔗糖等。传统工艺提取后的药渣显现出较模糊的网
状结构,还有部分其他成分附着在网状结构上。因
此,推断多糖的提取不是很完全。纤维素酶处理后的
药渣其网状结构变得非常清晰,附着物很少,提示多
糖的提取可能比较完全。
图4黄芪原糖(A)、传统工艺药谴(B)和
酶处理药渣(C)的扫描电镜
Fig.4Scanningelectronmicroscopy(SEM)ofRadix
Astragali(A),gruffsbytraditionalprocess
(B),andgraftsbycellulasetreatment(C)
3讨论
黄芪多糖主要采用传统的水提醇沉工艺提取,
得率较低。因此,近年来仍有许多研究者致力于提高
黄芪多糖的得率。采用稀碱溶液提取黄芪多糖,得率
提高,但碱法提取会影响黄芪多糖的高级结构、组分
变化以及其生物活性有待研究o]。微波处理应用于
水提醇沉法提取黄芪多糖,反应时间缩短了12
倍o],但微波设备的可操作性和局部受热不均等使
微波提取的应用具有一定的局限性。本实验应用纤
维素酶处理工艺提取黄芪多糖,得到了较好的效果。
纤维素酶处理能较大幅度地提高多糖的得率,
大多研究报道集中于对藻类、食用真菌类和百合等
非木质材料的酶处理上,而对黄芪等木质材料的研
究报道较少”]。多数文献报道采用直接酶处理后浸
提的方法提取多糖,预试验结果表明这种方法对黄
芪多糖的提取并不适宜。根据传统工艺黄芪多糖大
多进行了2次水提的特点口],本研究采用在第一次
提取完成后进行酶处理,明显增加了黄芪多糖的得
率。这可能由于黄芪原料组织得到充分软化,有利于
被纤维素酶作用。另一方面,黄芪的一次提取液中含
有大量的糖类物质可能对纤维素酶的作用形成反馈
抑制,将滤液分离后酶处理,有助于提高纤维素酶的
效率。另外,黄芪的一次提取液中也含有较多的蔗糖
等小分子糖类,影响纤维素酶的稳定性。研究表明,
在较高温度下蔗糖和葡萄糖对纤维素酶有破坏作
用“]。进行第二次水提,既具有钝化酶的作用,同时
又可将剩余的多糖充分提取出来。
纤维素酶的功能是通过将细胞壁主要结构成分
纤维素分解为还原糖,它有助于增加多糖的溶出,从
而最终提高多糖的得率。总糖和还原糖的分析结果
表明纤维素酶处理能降解黄芪的结构多糖中的纤维
素,提高提取过程中糖的溶出率。不同方法提取黄芪
多糖的试验表明,与传统工艺和对照相比,酶法所得
到的黄芪多糖的质量分数几乎不变,但得率大幅度
增加。扫描电镜观察结果进一步从微观结构上揭示
了纤维素酶处理后药渣的网状结构变得十分清晰,
黄芪原料的部分结构多糖受到破坏,中间的多糖等
物质得到了较充分的溶出[9]。总之,本实验采用的纤
维素酶处理工艺简单易行,能较大幅度提高黄芪多
糖的得率,而且不需进行专门钝化酶的操作,因此具
有很大的工业化应用前景。
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崔元璐1,戚爱棣2,韩 毙2,李克峰1,姚康德1
(1.天津大学,天津300072}2.天津中医学院,天津300193)
制备载有药物和细胞因子的生物材料和研究生
物材料对药物与细胞因子的控制释放已经成为组织
工程的研究热点之一[1]。传统中药的某些有效成分
具有与细胞因子类似的生理活性和广泛的药理作
用,且价格低廉,理化性质相对稳定,有作为细胞因
子和抗生素替代物应用于组织工程的良好前景。本
课题组的研究表明,低质量浓度的粉防己碱在体外
能够促进软骨细胞的增殖,维持软骨细胞的功能表
达,并具有抗炎、抗变态反应和抗凝血作用。以相分
离一溶剂置换一冷冻干燥法制备载有粉防己碱的聚乳
酸多孔组织工程支架材料,通过扫描电镜分析材料
形貌;利用高教液相色谱法测定载药支架材料中的
载药量。
1材料与仪器
左旋聚乳酸(poly—L—lactica id,PLLA,%为
1.08×105g/mol,美国麻省大学化工系),粉防己碱
(中国药品生物制品检定所),三氯甲烷、四氢呋喃、
甲醇等化学试剂均为市售分析纯,色谱流动相用甲
醇为色谱纯,水为超纯水,二己胺为分析纯。
AE200精密电子天平[梅勒一脱利多仪器(上
海)有限公司],ChristAlpha2—4冷冻干燥机,
PhilipsXL30扫描电子显微镜,Agilenti00高效
液相色谱仪,G131IA四元泵。G1322A脱气机,
G1316A柱温箱,1314AUV可变波长检测器,HP
Rev.A.0501化学工作站。
2方法与结果
z.1材料的制备
2.I.1聚乳酸支架材料的制备o]:精密称取1.5g
聚乳酸,放入200mL磨口三角瓶中,加入50mL四
氢呋晡,在60℃水浴中不断振摇,使其完全溶解,配
制成质量浓度为3%的溶液。将4mL聚乳酸溶液加
入到磨El玻璃称量瓶中,盖严盖子,放入5℃的冰箱
中8h,使溶液凝胶化。取出称量瓶,打开盖子,放入
去离子水中置换四氢呋哺。每隔8h换水1次,连续
置换48h。将凝胶连同玻璃称量瓶一起取出,置于
一40℃低温冰箱中冷冻,使其冻结。取出玻璃称量
瓶,放人冷冻干燥机中,使其完全干燥。取出称量瓶
中的支架材料,备用。
2.1.2含有粉防己碱的聚乳酸支架材料的制备:精
密称取10mg粉防己碱,溶于0.5mL三氯甲烷中,
备用。精密称取1.5g聚乳酸,放人200mL磨口三
角瓶中,加入50mI,四氢呋晡,然后用移液器精密
量取150p.I。粉防己碱三氯甲烷溶液,加入三角瓶
中,在60℃水浴中不断振摇,使其完全溶解,配制成
含有粉防己碱的聚乳酸溶液。将4mL聚乳酸溶液
加入到磨口玻璃称量瓶中,按聚乳酸支架材料的制
备项下方法操作,即得。
2.1.3材料形貌分析:采用PhilipsXL30扫描电
子显微镜观察测试。用不锈钢剃刀片切割材料,将材
料的表面、断面经离子溅射仪喷金镀膜后进行观察,
见图1。可见两种生物材料都由均匀分布的细小纤
维构成,具有相互贯穿的通孔结构,两者(孔隙率、纤
鏊銎品曹;鸷装莒纂备学基金资助项目(303。0457),中国博士后科学基金资助项目(2004∞5D149)
万方数据
纤维素酶法提取黄芪多糖
作者: 闫巧娟, 韩鲁佳, 江正强, YAN Qiao-juan, HAN Lu-jia, JIANG Zheng-qiang
作者单位: 中国农业大学工学院,北京,100083
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2005,36(12)
被引用次数: 16次

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本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200512017.aspx