全 文 ：水飞蓟素对乳腺癌细胞系的作用及其机制研究
韩月恒 ,韩　炯 ,李　莹 ,刘新平 ,药立波
(第四军医大学 生物化学与分子生物学教研室 ,陕西 西安　 710032)
摘　要: 目的　研究水飞蓟素在体外对不同乳腺癌细胞系的作用 ,并进一步探讨其作用机制。 方法　 M TT实验测
定水飞蓟素对乳腺癌细胞系 M CF-7和 SK-BR-3的半数抑制浓度 ( IC50 ) ; 软琼脂克隆形成试验检测加药后两种细
胞在软琼脂内的增殖能力。在此基础上 ,用 Her-2抑制剂 AG825进行干预 ,对水飞蓟素的作用机制进行初步探讨。
结果　水飞蓟素对两种乳腺癌细胞有不同程度的抑制作用 ,其中对 MCF-7细胞的作用较强 , IC50≤ 0. 02% ,而对
SK-BR-3的作用较弱。 Her-2抑制剂 AG825可增加 SK-BR-3细胞对药物的敏感性 ,抑制了水飞蓟素作用后该细
胞在软琼脂中集落的形成。结论　水飞蓟素在体外对 MC F-7细胞具有明显的抑制作用 ,而 AG825可增强 SK-BR-
3细胞对药物的敏感性。因此 , SK-BR-3细胞中 Her-2的高表达可能是该细胞对水飞蓟素敏感性差的原因 ,而水飞
蓟素也可能通过 Her-2调节某个或某几个下游分子起作用。
关键词: 水飞蓟素 ;乳腺癌 ; He r-2; AG825
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 03 0238 04
Inhibitory effect of silymarin on different breast cancer cell lines
and associated molecular mechanism
HAN Yue-heng , HAN Jiong, LI Ying , LIU Xin-ping , YAO Li-bo
( Depa rtment o f Biochemistr y and Molecular Biolog y, Fourth M ilitary Medical Univ er sity , Xi an 710032, China )
Abstract: Object　 To investiga te the anticancer ef fect o f silymarin on dif ferent breast cancer cell
lines, and approach the mo lecular mechanism. Methods　 Tw o breast cancer cell lines w ere cul tured to
study the ef fect o f silymarin on cell g row th and proliferation. First ly, M T T assay w as used to evaluate the
IC50 of silymarin on the tw o cell lines, M CF-7 and SK-BR-3. Secondly , th rough so ft aga r assay , the abi li-
ty of cell proli feration, w hen expo sed to si lyma rin at v arious dosages, was detected. Finally, AG825, in-
hibi to r of the protein tyro sine kinase Her-2 was used to interv ene the effect of silymarin on SK-BR-3 cells.
Results　 Silymarin could inhibi t the g row th of M CF-7 and SK-BR-3 cells in v ared deg rees. M CF-7 cells
w ere very sensi tiv e to the agent, IC50≤ 0. 02% ; while SK-BR-3 cells w ere less sensi tiv e. Her-2 inhibi to r
AG825 increased th e sensi tivi ty of SK-BR-3 cells to si lyma rin and inhibi ted the g row th of the cells in sof t
ag ar. Conclusion　 From the above, it could be concluded that silymarin has the cancer chemopreventiv e
and anticancer ef fects on breast cancer cell lines. It could completely inhibi t the g row th o f M CF-7 cells,
and pa rtly of SK-BR-3 cells. AG825 could improve the sensi tivi ty of SK-BR-3 cells to si lyma rin. Overex-
pression of Her-2 on the surface of SK-BR-3 cells may be ow ed to the lower sensi tiv ity to silymarin and
si lyma rin may be possible to af fect cell g row th through one o r mo re downst ream mo lecules regulated by
Her-2.
Key words: si lyma rin; breast cancer; Her-2; AG825
　　水飞蓟素是从植物水飞蓟中提取的一种黄酮类
抗氧化剂 ,在欧洲和亚洲的一些国家被用于治疗肝
纤维化。该药物具有较强的肝脏保护作用 ,可使机体
抵御 CCl4等引起的脂质过氧化作用及肝脏毒性 ,并
能捕获自由基 ,是一种很强的抗氧化剂 [1, 2 ]。 国内外
的研究发现 ,水飞蓟素在体外对某些上皮组织的肿瘤
细胞 ,如前列腺癌、皮肤癌、结肠癌等有抑制作用但目
前对其抗肿瘤的机制尚无统一认识 [3, 4 ]。 我们研究了
水飞蓟素对乳腺癌细胞系 MCF-7及 SK-BR-3的作
用 ,并进一步探讨了其抑制肿瘤细胞的机制。
1　材料
1. 1　乳腺癌细胞系 MCF-7, SK-BR-3均为本室冻存。
·238· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
收稿日期: 2002-10-16基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30170465) ;全军医学科研“十五”计划重点课题 ( 01Z081)作者简介:韩月恒 ( 1974— ) ,女 ,第四军医大学生化教研室博士研究生 ,主要从事肿瘤细胞的信号转导方面的研究。
Tel: ( 029) 3374516-11　 E-mail: alex. h an2000@ sohu. com
1. 2　主要试剂: RPM I 1640培养基购自 Gibco公
司 ,小牛血清为北京元亨圣马生物技术公司产品 ,胰
蛋白酶、 M T T购自华美公司 ,水飞蓟素 (纯度>
80% , HPLC法 ) 由西安天行健科技发展有限公司
提供 ,细胞培养用琼脂粉、二甲基亚砜 ( DM SO)为
Sigma公司产品。
2　实验方法
2. 1　水飞蓟素对 MCF-7, SK-BR-3细胞的作用
2. 1. 1　细胞培养: M CF-7细胞和 SK-BR-3细胞均
为贴壁细胞 ,用含 10% 热灭活 ( 55℃ , 30 min)小
牛血清的 RPM I 1640培养液于 37℃ , 5% CO2及饱
和湿度条件下培养。
2. 1. 2　 MT T试验: 用 0. 25% 胰蛋白酶 (含 ED-
T A 0. 02% )消化单层培养细胞 ,用含有 5% 小牛
血清的 RPM I 1640培养液配成单个细胞悬液 ,以每
孔 1. 0× 104个细胞接种于 96孔板中 ,每孔体积 200
μL。 24 h后加入溶于 DMSO的水飞蓟素至终浓度
分别为 0. 005% , 0. 01% , 0. 02% , 0. 03% , 0. 05% ;
对照组加等体积的 DM SO。 每组设 6个复孔 ,并设
空白孔调零。在上述条件下培养 48 h后 ,每孔加入
MT T 溶液 ( 5 mg /m L) 20μL, 37℃ ,继续培养
4 h。终止培养 ,小心吸弃孔内培养上清。每孔加入
150μL DMSO,放入酶标仪中 ,测量前振荡 3 min,
使结晶充分溶解 ,选择 570 nm滤光片 ,记录各孔吸
光度值。以药物浓度为横坐标 ,细胞存活率 (试验组
吸光度值 /对照组吸光度值× 100% )为纵坐标绘制
生长曲线。
2. 1. 3　软琼脂克隆形成试验: 取对数生长期的
MCF-7细胞和 SK-BR-3细胞 ,用 0. 25% 胰蛋白酶
(含 EDTA 0. 02% )消化使之分散成为单个细胞 ,
细胞计数 ,调整细胞浓度至 1× 104 /mL。在 12孔板
中加入 0. 5% 的底层琼脂 2 mL,室温静置 1 h。取
400μL调整好的细胞悬液与 600μL 0. 5% 琼脂混
合均匀 ,制成顶层琼脂。制备过程中 ,保持琼脂温度
为 42℃。 两种细胞的悬液中分别含有 0. 01% ,
0. 03% , 0. 05% 水飞蓟素 ,及与溶剂等量的 DMSO
作为对照 ,各组设 3个复孔。置 37℃ , 5% CO2及饱
和湿度条件下培养 2～ 3周 ,倒置显微镜下观察 ,计
数克隆形成数。
2. 2　 AG825干预下水飞蓟素对 SK-BR-3细胞的
作用: 取对数生长期的 SK-BR-3细胞 ,用 0. 25%
胰蛋白酶 (含 EDTA0. 02% )消化使之分散成为单
个细胞 ,细胞计数 ,调整细胞密度至 1× 104 /mL。制
备底层琼脂与顶层琼脂的过程同上。 细胞悬液中分
别含有 1)水飞蓟素 0. 03% ; 2)水飞蓟素 0. 03% +
AG825 10μmo l /L; 3) 水飞蓟素 0. 03%+ AG825
30μmo l /L; 4) AG825 10μmo l /L; 5) AG825 30
μmol / L; 6) 与溶剂等量的 DMSO作为对照 ,各组
设 3个复孔。置 37℃ , 5% CO2及饱和湿度条件下
培养 3周 ,倒置显微镜下观察 ,计数克隆形成数。
3　结果
3. 1　水飞蓟素对两种乳腺癌细胞的抑制作用:药物
对 MCF-7细胞作用较强 ,而对 SK-BR-3细胞只有
部分抑制作用。 MT T实验测得水飞蓟素对 MCF-7
细胞的半数抑制浓度 ( IC50 )约为 0. 02% ;但药物浓
度达到一定水平后 , SK-BR-3细胞的存活率不再随
着药物浓度的增加而降低 ,说明水飞蓟素只能部分
抑制 SK-BR-3细胞的增殖 ,不能完全将细胞杀死
(图 1)。软琼脂克隆形成试验与上述 M TT实验结
果较为一致 ,水飞蓟素可显著抑制 MCF-7细胞在
软琼脂中形成克隆 ,但 SK-BR-3细胞在药物浓度达
到 0. 05% 时还会有少量体积较小的细胞团出现
(图 2)。
1-SK-BR-3　 2-MCF-7
图 1　水飞蓟素对乳腺癌细胞系 MCF-7,
SK-BR-3增殖的抑制作用
Fig. 1　 Inhibition of silymarin in proliferation
of breast cancer cell lines MCF-7 and
SK-BR-3 at diff erent degrees
　 1-SK-BR-3　 2-MCF-7
图 2　水飞蓟素对乳腺癌细胞系 MCF-7, SK-BR-3
在软琼脂中克隆形成的作用
Fig. 2　 Inhibition of silymarin in colony format ion
of breast cancer cell lines MCF-7 and
SK-BR-3 in sof t agar
·239·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
3. 2　 AG825干预下水飞蓟素对 SK-BR-3细胞的
抑制作用:在 0. 03% 水飞蓟素时 ,体系中加入不同
浓度的 AG825均可导致软琼脂中 SK-BR-3细胞
形成克隆数的减少 ,且细胞团的体积也明显减小。特
别是当 AG825浓度为 10μmo l /L时 ,其本身并不
足以影响 SK-BR-3细胞在软琼脂中的生长 ,却可使
细胞对水飞蓟素的敏感性增高。当 AG825浓度为
30μmo l /L, AG825对 SK-BR-3细胞在软琼脂中的
生长有一定抑制 ,但抑制程度也远小于水飞蓟素与
相同浓度 AG825同时存在的作用。 说明体系中加
入 AG825对 SK-BR-3细胞产生的抑制作用不是
由 AG825独自引起的 ,而是 AG825与水飞蓟素共
同作用的结果 (图 3)。
1-DM SO对照组　 2-水飞蓟素 ( 0. 03% )　 3-AG825 ( 10μmol /
L)　 4-AG825 ( 30μmol /L)　 5-水飞蓟素 ( 0. 03% )+ AG825
( 10μmol /L)　 6-水飞蓟素 ( 0. 03% )+ AG825 ( 30μmol /L)
1-DM SO cont rol　 2-si lymarin ( 0. 03% )　 3-AG825 ( 10μmol /
L)　 4-AG825 ( 30μmol /L)　 5-s ilymarin ( 0. 03% )+ AG825
( 10μmol /L)　 6-si lymarin ( 0. 03% )+ AG825 ( 30μmol /L)
图 3　水飞蓟素与 AG825共同作用对乳腺癌细胞系
SK-BR-3在软琼脂中克隆的抑制作用
Fig. 3　 Inhibition of silymarin combined with AG825
in colony formation of breast cancer cell lines
SK-BR-3 in soft agar
4　讨论
　　从天然植物中提取抗肿瘤药物既是中医药现代
化的重要组成部分 ,也是基础临床医学研究的一个
热点。水飞蓟素是一种黄酮类抗氧化剂 ,用于治疗酒
精性肝硬化等肝脏疾病有确切的疗效 ,在体外对于
某些上皮来源的肿瘤细胞如前列腺癌、皮肤癌、结肠
癌等有明确的抑制作用 ,但其作用机制尚不清楚。有
研究认为水飞蓟素是通过影响周期蛋白及相关激酶
的活性起作用 [5 ];亦有研究认为水飞蓟素抑制 N F-
kappa B的活性 [6 ];此外 ,还有研究表明 ,水飞蓟素
的作用是通过调控 ERK1 /2信号通路完成的 [ 7]。
本研究在观察水飞蓟素对两种乳腺癌细胞的作
用时发现 , M CF-7和 SK-BR-3细胞对水飞蓟素的
敏感性有十分明显的差异。水飞蓟素在很低的浓度
下即可对 MCF-7细胞有很强的抑制作用 ,而对
SK-BR-3细胞只有部分抑制作用 ,因此考虑从两种
细胞蛋白表达的不同入手 ,研究水飞蓟素的作用机
制。在这两种乳腺癌细胞中 ,已知表达差异的分子有
很多种 ,其中比较重要的信号分子有 Her-2, JAK1,
Rak, BRK, Syk等 [ 8]。而 Her-2分子的高表达是
SK-BR-3细胞不同于 MCF-7细胞的显著特征之
一。 Her-2,又称 ErbB-2为生长因子受体家族的蛋
白酪氨酸激酶 ,是由癌基因 c-erbB编码的 ,相对分
子质量为 1. 85× 105的跨膜蛋白。在临床上 ,乳腺癌
细胞中 Her-2的高表达与肿瘤耐药、预后较差及容
易复发密切相关 ,因而 Her-2的表达水平被认为是
乳腺癌恶性程度及判断预后的一个重要指标 [9, 10 ] ,
AG825是一种化学合成的 Her-2抑制剂 ,可特异地
结合于 Her-2的底物结合位点 ,并能抑制 Her-2的
自身磷酸化 ,而对 EGFR作用非常弱。 AG825在体
外试验中对 Her-2的 IC50为 0. 35μmo l /L,但由于
在活细胞体系中 ,外来物质会受到一定的加工 ,因此
AG825用于软琼脂试验的浓度是先经过 M T T试
验的初步测定 (实验数据在文中未显示 )。 10μmol /
L为对 SK-BR-3细胞无明显抑制作用的剂量 , 30
μmol / L略低于 AG825对活细胞的 IC50。 AG825与
Her-2的持续结合降低了 Her-2的磷酸化程度 ,进
而减弱了其激酶活性 [11 ]。 不同浓度 AG825的存在
可以增加 SK-BR-3细胞对水飞蓟素的敏感性 ,抑制
其在软琼脂中形成克隆的能力。这说明 , Her-2分子
活性的改变可导致 SK-BR-3细胞增殖能力以及对
水飞蓟素敏感性的改变。
水飞蓟素对表达水平不同的乳腺癌细胞的作用
有着明显的差异 , M CF-7细胞中 Her-2分子只有基
础表达量 ,对药物敏感 , IC50可低于 0. 02% ; SK-BR-
3细胞高表达该分子 ,对药物敏感性差 ,虽其增殖能
力可受到部分抑制 ,但在药物浓度很高的情况下仍
有一半以上的细胞存活。而当 Her-2的激酶活性通
过 AG825的干预减弱后 , SK-BR-3细胞对药物敏
感性显著提高。因此可以推测 , Her-2分子的高表达
可能是 SK-BR-3细胞对水飞蓟素敏感性差的原因 ,
而水飞蓟素也可能通过调节某个或某几个下游分子
起作用。
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东北鹤虱中香豆素类对兔离体回肠的作用
孟　林 ,尹勇强 ,高建华 ,周　晶

(天津医科大学 药理教研室 ,天津　 300070)
摘　要: 目的　观察东北鹤虱中香豆素类对兔离体回肠的作用及对钙离子的影响。方法　采用兔离体回肠标本 ,给
予不同剂量香豆素 ( CM )及维拉帕米 ( Ver) ,观察对平滑肌收缩的影响。 结果　 CM和 Ver可剂量依赖性地抑制
乙酰胆碱 ( Ach )引起的回肠的收缩 ,非竞争性拮抗 CaCl2所致回肠收缩 ,并对 Ach引起的第 1, 2相收缩均有影响。
结论　东北鹤虱中提取的香豆素类具有与 Ver相似的钙拮抗作用。
关键词: 东北鹤虱 ;香豆素类 ;维拉帕米 ;回肠平滑肌
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 03 0241 03
Effects of coumarin from LEG on contractivity in isolated rabbit ileum
MENG Lin, YIN Yong-qiang , GAO Jian-hua , ZHO U Jing
( Depar tment of Pha rmacolog y , Tianjin Univ ersity o f Medica l Sciences, Tianjin 300070, China)
Abstract: Object　 To observ e the effects o f coumarin ( CM ) and Verapamil ( Ver ) on contractivi ty
and i ts relationship wi th Ca
2+
in isola ted i leal smooth muscle o f the rabbi ts. Methods　 The ef fects o f CM
and Ver w ere observed in three doses by routine experimenta l methods in isolated rabbi t ileal. Results　
CM and Ver inhibited the contraction of isolated i leal smoo th muscle induced by acetylcho line and CaCl2 .
The responses w ere a concentration-dependent and non-competi tiv e manner. CM and V er were effectiv e a-
gainst the ini tial and sustained peak induced by acety lcholine. Conclusion　 CM has a calcium-antagonistic
ef fect which is similar to tha t of Ver.
Key words: Lappula echinata Gilib ( LEG) ; coumarin ( CM ); V erapamil (V er) ; ileal smoo th muscle
　　东北鹤虱 Lappula echinata Gilib ( LEG) 为紫
草科植物东北鹤虱的果实 ,具有驱虫 [1 ]、抗炎 [2 ]、止
泻 [3 ]的作用 ,本实验采用其果实中提取出的香豆素
类 ( coumarin, CM ) ,以兔离体回肠为标本 ,观察
CM 对生理激动剂乙酰胆碱 ( acety lcholine, Ach )
及氯化钙所引起的兔回肠平滑肌收缩反应的影响 ,
·241·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
收稿日期: 2002-06-12基金项目:天津市自然科学基金项目 ( 003608511)作者简介:孟　林 ,女 ,副教授 ,毕业于天津医科大学医学系 ,从事中药药理研究工作。