全 文 ：肉桂醛与柠檬醛抗曲霉菌作用机制的研究
谢小梅1, 张文平2, 付颖瑗2, 许　杨1α
(11 南昌大学中德联合研究院 教育部食品科学重点实验室, 江西 南昌　330047; 21 江西医学院, 江西 南昌　330006)
　　曲霉菌是深部真菌感染的常见病原菌。由于真
菌对现有临床使用药物具有抗药性以及药物存在不
良反应, 人们一直在寻找高效低毒的抗真菌药物。中
药副作用小, 来源广, 价格低廉, 较少出现耐药等, 使
研究开发抗真菌中药具备良好前景。目前对中药的
抗真菌作用研究大多停留在从中药中分离抗真菌活
性成分, 对其机制较少涉及, 特别是抗曲霉菌作用机
制报道甚少。本研究采用扫描电镜及同位素标记技
术, 探讨具有良好抗曲霉菌作用的中药活性成分肉
桂醛与柠檬醛的抗真菌机制, 为开发和研制更理想
的抗真菌药物提供有益的线索和理论依据。
1　材料
111　实验菌株: 烟曲霉菌 (CCCCM ID A 1)、黄曲霉
菌 (CCCCM ID A 2) 标准株, 购自中国医学科学院
皮肤病研究所真菌室中国医学真菌中心 (南京)。
112　药物与试剂: 肉桂醛 (cinnam aldehyde) 购自上
海双喜香料制剂厂 (批号 20020401) , 柠檬醛 (cit ra l)
德国进口 (批号 002489 S20085632)。同位素标记前
体: (甲基23H ) 胸腺嘧啶核苷 (3H 2T dR , 浓度: 317×
107 BqömL , 放射性活度: 1111×1012 Bqömmo l) , L 2
3H 尿嘧啶核苷 (3H 2U dR , 浓度: 317×107 BqömL ,
放射性活度: 6166×1011 Bqömmo l) , L 2(4, 523H ) 亮
氨酸 (浓度: 1185×107 BqömL , 放射性活度: 2122×
1012 Bqömmo l) , 由中国科学院上海核技术开发公司
提供。蔡氏培养液[1 ]。其他试剂均为分析纯。
113　仪器: 真菌培养箱, 紫外分光光度计, 酶标仪,
ZT—Ê 型多头细胞样品收集器, FJ—2101G 双道液
体闪烁计数器, S—570 型日立扫描电镜等。
2　方法
211　菌液制备: 将菌株接种于蔡氏斜面, 26 ℃培养
至快速生长早期, 活化 2 次, 此时菌苔覆盖斜面, 加
入蔡氏培养液, 吸管吹打菌落使孢子游离于培养液
中, 用 5 层纱布滤过, 滤液经血细胞计数板计数及紫
外分光光度计测定, 调整孢子浓度为 1×106ömL。
212　最低抑菌浓度 (M IC) 测定: 参照文献[2 ]用微
量液基稀释法分别测定肉桂醛和柠檬醛对黄曲霉
菌、烟曲霉菌的M IC。
213　扫描电镜标本的制备: 分别用 1ö2 M IC, 1ö4
M IC, 1ö8 M IC 的肉桂醛和柠檬醛作用于快速生长
期菌, 于作用后第 4 天取标本, 若是液体培养则滤过
菌丝并用生理盐水冲洗; 若是固体培养则取 1 cm 3
琼脂块。将标本浸入 3% 戊二醛中, 4 ℃ 固定至少 2
h, 丙酮逐级脱水, 醋酸异戊脂置换, 临界点干燥, 金
属镀膜置扫描电镜下观察。
214 　同位素前体掺入实验[3 ]: 以 3H 2T dR , 3H 2
U dR , 3H 2亮氨酸分别作掺入前体进行同位素掺入
实验。分别以 1ö2 M IC,M IC, 2 M IC 肉桂醛和柠檬
醛作用于快速生长期的黄曲霉菌、烟曲霉菌, 测定两
者对黄曲霉菌、烟曲霉菌 DNA、RNA、蛋白质生物
合成的影响。在经氯仿和紫外线照射灭菌的 96 孔
平底细胞培养板中依次加入含不同浓度药物的蔡氏
培养液 18010 ΛL (对照组不加药物, 用生理盐水代
替)、211 项制备的菌液 210 ΛL 及 20 ΛL 同位素前
体物质 (终浓度分别为: 3H 2T dR 为 1111×105 Bqö
mL , 3H 2U dR 和 3H 2亮氨酸 1185× 104 BqömL ) ,
2615 ℃ 静置培养 48 h。培养液用 49 型玻璃纤维滤
纸在多头细胞收集仪收获, 80 ℃ 干燥 2 h。将收获
培养液的 49 型玻璃纤维滤纸置于液体闪烁瓶中,
加闪烁液浸泡过夜。次日, 闪烁瓶置于 Β2液体闪烁
计数仪中检测, 计数每分钟脉冲数 (cpm )。
215　实验设计及统计学处理: 同位素掺入实验分别
设 3 个不同浓度药物组和一个生理盐水对照组, 每
组设 6 个平行孔。实验结果 cpm 值以 x ±s 表示, 并
计算各种同位素掺入抑制率。实验重复 3 次。
掺入抑制率= 对照组 cpm - 试验组 cpm对照组 cpm ×100%
3　结果
311　M IC 测定: 肉桂醛对黄曲霉菌、烟曲霉菌的
M IC 分别为 01100, 01050 ΛgömL ; 柠檬醛对黄曲霉
菌、烟曲霉菌的M IC 分别为 21600, 01650 ΛgömL。
·034· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 4 期 2004 年 4 月
α 收稿日期: 2003208212
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30160099)
作者简介: 谢小梅 (1964—) , 女, 博士研究生, 教授, 研究方向为中药与微生物。T el: (0791) 8181400　E2m ail: 1990xxm @ sohu. com
参考郑玮清等[4 ]方法, 判定肉桂醛和柠檬醛有良好
的体外抗曲霉菌活性。
312　扫描电镜观察: 用药前黄曲霉菌菌丝饱满, 舒
展; 分生孢子梗壁极粗糙, 表面遍布颗粒状突起; 分
生孢子形态大小均匀, 表面粗糙。用药后菌丝扭曲,
欲折; 分生孢子梗萎缩, 表面光滑; 分生孢子形态不
一, 表面变平坦并有黏连趋势。液体培养鲜有分生孢
子头。用药前烟曲霉菌菌丝柔软, 饱满; 分生孢子梗
壁光滑; 分生孢子形态大小均一, 表面有颗粒状突起
或细刺。用药后菌丝扭曲, 折断; 分生孢子梗萎缩; 分
生孢子形态不一, 皱缩, 表面变平坦 (图略)。
313　同位素前体掺入实验结果: 见表 1, 2。
表 1　肉桂醛和柠檬醛对烟曲霉菌生物合成的影响 (x±s, n= 6)
Table 1　Effects of c innamaldehyde and c itra l on biosyn thesis of A sp erg illus f um iga tus (x±s, n= 6
组　别 药物浓度
3H 2T dR
cpm 抑制率ö% 3H 2U dRcpm 抑制率ö% 3H 2亮氨酸cpm 抑制率ö%
对照 - 1 838±142 - 8 778±729 - 6 950±618
柠檬醛 2 M IC 115± 233 3 # # 9317 133± 533 3 9815 263±1123 3 # # 9611
M IC 196± 223 3 7814 238± 753 9713 1 566±7393 3 7715
1ö2 M IC 983± 803 3 # # 4615 3 845±7483 3 # # 5611 4 338±4763 3 # # 3716
肉桂醛 2 M IC 163± 593 3 # # 9113 183±1013 3 9719 165± 653 3 # # 9716
M IC 315± 993 3 8219 383±1653 3 9516 1 228±1033 3 8213
1ö2 M IC 962±2103 3 # # 4714 3 837±4803 3 # # 5613 3 577±5163 3 # # 4815
　　　与对照组比较: 3 3 P < 0101; 与自身M IC 剂量组比较: # # P < 0101
　　　3 3 P < 0101 vs con tro l group; # # P < 0101 vs M IC do sage in the sam e group
表 2　肉桂醛和柠檬醛对黄曲霉菌生物合成的影响 (x±s, n= 6)
Table 2　Effects of c innamaldehyde and c itra l on biosyn thesis of A sp erg illus f lavus (x±s, n= 6)
组　别 药物浓度
3H 2T dR
cpm 抑制率ö% 3H 2U dRcpm 抑制率ö% 3H 2亮氨酸cpm 抑制率ö%
对照 - 1 658±102 - 7 897±777 - 6 088±527
柠檬醛 2 M IC 157± 243 3 # # 9015 173± 263 3 9718 113± 323 3 # # 9811
M IC 341±1083 3 7914 221± 913 3 9712 1 350±1893 3 7718
1ö2 M IC 1 143±1213 3 # # 3110 4 586±4163 3 # # 4119 4 117±6523 3 # # 3213
肉桂醛 2 M IC 112± 133 3 # # 9312 168± 573 3 9719 203± 593 3 # # 9617
M IC 368± 643 3 7718 502± 903 3 9316 1 333±1703 3 7810
1ö2 M IC 1 090±1413 3 # # 3412 4 591±7193 3 # # 4210 3 643±4713 3 # # 4011
　　　与对照组比较: 3 3 P < 0101; 与自身M IC 剂量组比较: # # P < 0101
　　　3 3 P < 0101 vs con tro l group; # # P < 0101 vs M IC do sage in the sam e group
4　讨论
　　肉桂醛和柠檬醛分别是肉桂、山苍子的主要活
性成分, 研究表明它们具有良好的广谱抗真菌作
用[5 ] , 本实验首次应用同位素标记法结合扫描电镜
研究它们的抗曲霉菌作用机制。扫描电镜观察发现,
经药物作用后的曲霉菌形态发生一系列变化, 说明
药物可能破坏细胞壁、细胞膜结构[6 ] , 并抑制分生孢
子的形成。一旦胞壁、胞膜被破坏, 真菌细胞就不能
维持细胞固有形态, 胞内外物质交换受阻, 结合于胞
膜上的各种酶不能正常发挥作用, 导致菌细胞对营
养物质吸收降低、生物大分子合成受阻[7 ]。结合同位
素标记掺入实验结果也证实了这一点。T dR、U dR
和亮氨酸分别作为DNA、RNA、蛋白质生物合成的
前体物质, 以其同位素标记物进行同位素掺入实验,
可充分反映真菌生物大分子的合成代谢情况。将同
位素掺入实验应用于中药活性成分的抗曲霉菌作用
机制研究尚属首次。掺入实验结果表明: 肉桂醛和柠
檬醛对 3 种标记前体的掺入均具有显著的抑制作用
(P < 0101) , 且随药物浓度的升高对标记前体掺入
抑制率也升高。当药物浓度为M IC 时, 3 种标记前
体物中, 对 3H 2U dR 的掺入抑制率最高, 达 90% 以
上, 对 3H 2T dR 和3H 2亮氨酸的掺入抑制率在 77%
～ 83%。上述结果提示肉桂醛和柠檬醛的抗菌机制
可能是通过影响曲霉菌的DNA、RNA 和蛋白质的
合成而表现抗菌效应。该结果与文献报道相一
致[7, 8 ] , 但由于蛋白质和核酸为生物细胞的共有成
分, 且各种真菌在结构和化学组成方面仍有较大差
异, 因此认为肉桂醛和柠檬醛强大的抗曲霉菌作用
可能存在其他更广泛的抗菌作用机制。
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银杏叶提取物新配方对大鼠高脂血症形成的影响
魏建明1, 顾振纶2, 谢梅林2α
(11 复旦大学附属金山医院 心内科, 上海　200540; 21 苏州大学医学院 药理教研室、苏州中药研究所, 江苏 苏州　215007)
　　血脂异常在动脉粥样硬化 (A S) 的发生发展及
其引起的心血管疾病中起着非常重要的作用, 高脂
血症与A S、冠心病 (CHD ) 的关系密切, 降低血脂能
够预防心血管疾病的发生, 从而降低死亡率[1 ]。因此,
采用降脂疗法防治A S 及 CHD 的研究受到医药工
作者的广泛关注。银杏叶提取物新配方 (GBEN P) 是
由银杏总黄酮和银杏内酯组成的制剂。本实验拟对
GBEN P 预防高脂血症形成进行研究。
1　材料
111　受试药物: 银杏叶提取物新配方 (GBEN P) 为
棕黄色粉剂, 含银杏总黄酮 50% , 银杏内酯 25% ,
批号 20009020, 由上海理工大学张立国教授提供。
力平脂 (L ipan thyl) : 200 m gö粒, 法国科尼大药厂
产品, 进口许可证号 X970304, 批号 298702ö98。
112　试剂与仪器: 胆固醇, 南京生物化学制药厂产
品。猪油, 市售自制。 3 号胆盐, 进口分装品
(O xo id) , 批号 F990702。甲基硫氧嘧啶, 国营武进县
制药厂产品, 批号 990615。聚山梨酯 80, 宜兴市亚
盛化工厂, 批号 990920。丙二醇, 中国上海星联化工
厂, 批号 000025。血清总胆固醇 (TC ) , 甘油三酯
(T G) 和高密度脂蛋白胆固醇 (HDL 2c) 测定试剂
盒, 均由温州东瓯生物工程公司提供, 批号分别为
200046029, 200038001 和 200032008。 apoA I 和
apoB 测定试剂盒, 由上海玉兰生物技术研究所提供,
批号 20A ug00。721 型分光光度计和 752C 型紫外分
光光度计, 均为上海第三分析仪器厂产品。高速台式
离心机 (T GL、16G) 上海医用分析仪器厂制造。
113　实验动物: SD 大鼠 60 只, 雄性, 体重 (179±
11) g, 苏州大学医学院实验动物中心提供, 合格证:
苏州 (环) 98008, 苏动 (质) 98018。
2　方法
211　高脂大鼠模型制备[2 ]和分组: 取雄性大鼠 60
只, 实验室适应性饲养一周后, 随机分成 6 组, 每组
10 只: 正常对照组、高脂模型组、力平脂组 (25 m gö
kg)、GBEN P 小、中、大剂量组 (20, 40, 80 m gökg)。
各组均以 10 mL ökg 体积于每天上午 9: 00～ 10: 00
ig 给药。正常对照组和高脂模型组给予等体积的蒸
馏水。除正常对照组外, 其余各组大鼠于每天下午同
时以 10 mL ökg 体积 ig 脂肪乳剂 (内含胆固醇
8% , 猪油 15% , 3 号胆盐 2% , 甲基硫氧嘧啶
012% , 丙二醇 20% , 聚山梨酯 80 16% ) , 连续 28 d,
实验第 29 天, 各组大鼠在禁食 15 h 后用戊巴比妥
钠 45 m gökg ip 麻醉, 由腹主动脉取血, 分离血清后
分别测定血清 TC、T G 和 HDL 2c、apoA I、apoB , 计
算 LDL 2c (LDL 2c= TC - 1ö212 T G - HDL 2c) ; 同
时取大鼠肝脏, 10% 甲醛溶液固定后进行病理检
查, 观察肝脏脂肪变性程度:“- ”表示肝细胞内无或
偶见脂肪空泡;“+ ”表示部分肝细胞内见脂肪小空
泡;“+ + ”表示弥漫性肝细胞内见散在脂肪小空泡;
“+ + + ”表示弥漫性肝细胞内充满脂肪小空泡。
212　血清脂质测定: 按试剂盒方法测定, 血清 TC
用胆固醇氧化酶2PA P 法测定, T G 采用磷酸甘油氧
化酶2PA P 法测定, HDL 2c 采用磷钨酸镁 (PTA 2
M g2+ ) 沉淀法测定, apoA I 和 apoB 采用免疫比浊
法测定。
213　数据处理: 数据用 x ±s 表示, 采用 t 检验。
·234· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 4 期 2004 年 4 月
α 收稿日期: 2003206211