全 文 ：青蒿素和青蒿琥酯对人乳腺癌 MCF-7细胞的体外抑制作用比较研究
林　芳 1 ,钱之玉 1 ,薛红卫 2 ,丁　健 3 ,林莉萍 3
( 1. 中国药科大学 药理教研室 ,江苏 南京　 210009; 2. 中国科学院上海植物生理生态研究所 分子遗传国家重点实验室 ,上
海　 200032; 3. 中国科学院上海药物研究所 肿瘤药理组 ,上海　 200032)
摘　要:目的　对比研究青蒿素及其衍生物青蒿琥酯对人乳腺癌 MCF-7细胞增殖的影响并探讨其作用机制。方法
采用体外培养的人乳腺癌 M CF-7细胞株 ,利用 SRB法测定青蒿素和青蒿琥酯对 M CF-7细胞增殖的影响 , FCM
法测定细胞周期的变化 ,亚 G1期含量测定和 DAPI荧光染色法观察细胞凋亡。结果　 10μmo l /L青蒿素和 1μmol /
L青蒿琥酯能明显改变 M CF-7细胞的细胞周期 ,使 S期细胞显著减少 , G0+ G1期细胞明显增加。青蒿素对 M CF-
7细胞增殖仅有微弱抑制作用 ,但其衍生物青蒿琥酯却有显著的抑制作用 , IC50为 0. 31μmol /L。同样 , 1μmo l /L青
蒿琥酯引起 MCF-7细胞的凋亡和直接的细胞毒作用明显强于 10μmo l /L青蒿素的作用。结论　体外研究表明 ,对
肿瘤细胞增殖的抑制青蒿琥酯比青蒿素作用强。
关键词: 青蒿素 ; 青蒿琥酯 ; MCF-7细胞
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 04 0347 03
Comparison of inhibitory effects between artemisinin and
artemisunate on proliferation of MCF-7 cells in vitro
LIN Fang
1 , Q IAN Zhi-yu
1 , XU E Hong-wei
2 , DIN G Jian
3 , L IN Li-ping
3
( 1. Depa rtment o f Pharmacolog y , China Pharmaceutica l Univ er sity , Nanjing 210009, China; 2. Nationa l Labo rato ry
o f Plant Mo lecula r Genetics, Shanghai Institute of Plant Physio lo gy , CAS, Shanghai 200032, China;
3. Shanghai Institute o f Materia Medica, CAS, Shanghai 200032, China)
Abstract: Object　 To study the effects of ar temisinin and i ts analo gue artemisuna te on the prolifera-
tion o f human breast cancer MCF-7 cell line, as w ell as thei r mechanism compara tiv ely. Methods　 Th e in-
hibi tion o f cell proli feration w as determined by SRB method. Cell cycle was determined by f low cytometry
( FCM ) analysis. Apoptosis was confi rmed by sub-G1 cells content and DAPI method. Results　 The cell
cycle of M CF-7 w as changed g rea tly when trea ted 24 h w ith ei ther 10μmol /L a rtemisinin or 1μmo l /L
a rtemisunate, the dist ribution of M CF-7 cells among S phase was reduced g rea tly , w hi le inereased during
G0+ G1 . How ever, artemisinin had w eaker effect on the pro liferation of M CF-7 cell , while artemisunate
ef fectiv ely inhibi ted the prolifera tion of M CF-7, the IC50 was 0. 31μmol /L. Apopto sis induced by 1μmol /
L artemisunate w as stronger than that by 10μmo l /L a rtemisinin, too. Conclusion　 The inhibi to ry ef fect
o f artemisunate on the proli feration of tumo r cell i s st ronger than tha t of artemisinin in vitro.
Key words: a rtemisinin; ar temisuna te; M CF-7 cel l line
　　青蒿为菊科一年生草本植物。黄花蒿 Artemisia
annua L. , 20世纪 70年代初 ,我国青蒿素研究协作
小组首次从黄花蒿分离出抗疟有效单体青蒿素
( artemisinin)
[1 ]
,一种非生物碱倍半萜内酯 ,具有独
特的过氧桥结构 ,后合成了很多青蒿素的衍生物 ,如
青蒿素琥珀酸酯 (青蒿琥酯 , artemisunate) ,二氢青
蒿素 ( dihydroartemisinin)、蒿甲醚 ( artemether )
等 ,在临床上对抢救和治疗脑型疟疾和恶性疟疾等
疗效显著 [2 ]。 20世纪 90年代以来有报道发现青蒿
琥酯对人类肿瘤细胞在体外有杀伤作用 ,对杂种小
鼠 3种移植性肿瘤和裸鼠移植人鼻咽癌亦有一定
的抑制作用 [3 ]。为了扩大临床应用范围 ,本研究比较
了青蒿素和青蒿琥酯对人乳腺癌细胞 MCF-7的抑
制活性 ,并对其抑瘤机制做了初步探讨。
1　材料与方法
1. 1　试剂: RPM I-1640培养液 (美国 Gibcobrl公
司 ) ,小牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公
司 ) ,磺酰罗丹明 B ( Sulfo rhodanmine B, SRB) (美
·347·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 4期 2003年 4月
收稿日期: 2002-06-03作者简介:林　芳 ( 1973— ) ,女 ,福建人 ,中国药科大学 1998级药理专业博士生 ,研究方向为中药药理及新药研究开发。
E-mai l: linfo929@ sohu. com
* 通讯作者　 Tel: ( 025) 3271322
国 Sigma公司 ) ,二甲基亚砜 ( DM SO)。青蒿素和青
蒿琥酯由中国科学院药物所李英研究员惠赠。 配制
方法如下:青蒿素以少量 DMSO溶解 ,配成浓度为
0. 2 mol /L的母液 ,超声助溶 , 4℃ 保存。实验前用
PBS ( pH7. 4)稀释至所需浓度 ( DM SO终浓度 <
0. 1% )。青蒿琥酯实验前配制 ,用 5% NaHCO3溶解
配成浓度为 0. 2 mo l /L的母液 ,再用 PBS稀释至所
需浓度。
1. 2　细胞培养:人乳腺癌细胞 MCF-7由中国科学
院上海药物研究所肿瘤药理组提供。在含 15% (体
积分数 )灭活小牛血清的 RPM I-1640培养基中 ,置
37℃ 含 5% CO2孵箱中培养 ,每 3～ 4天传代 1次。
加药实验用含 10% 灭活小牛血清的 RPM I-1640
培养基培养细胞。
1. 3　细胞毒性测定 ( SRB法 ): 取对数生长期细胞
制备成单细胞悬液 ,台盼蓝染色进行活细胞计数。以
2× 105 /mL的细胞密度均匀接种至 96孔板中 , 90
μL /孔 ,培养 24 h后 ,加 10μL各受试药物混匀。每
个药物剂量至少设 4个复孔 ,对照组加等容积
PBS。置 37℃ , 5% CO2条件下孵育 72 h。倾去培养
液 ,用 10% 冷 TCA固定细胞 , 4℃ 放置 1 h,蒸馏
水洗涤 5次 ,空气中自然干燥。每孔加由 1% 冰醋
酸配制的 SRB 4 mg /mL溶液 100μL,室温染色 15
min。去上清 , 1% 冰醋酸洗涤 5次 ,空气干燥。每孔
加入 150μL Tris溶液 ( p H7. 4) ,在平板震荡器上
充分溶解 SRB蛋白复合物。以空白管调零 ,于酶标
仪 (V ERSAM AX) 测定 A540值。
抑瘤率= (无药细胞对照孔 A 值 -用药孔 A值 ) /无药
细胞对照孔 A 值× 100%
1. 4　荧光显微镜术:将青蒿素和青蒿琥酯分别作用
于 MCF-7细胞 24 h后 ,收集细胞 , PBS洗涤 1次 ,
用 3% 多聚甲醛 ( pH7. 4, PBS)室温固定 30 min,
PBS洗涤后加入 1% Tri tonX- 100,作用 4 min,
PBS洗涤后再用 DNA荧光染料二氨基苯基吲哚
( DAPI, 0. 15μg /mL, pH7. 4)避光染色 60 min,荧
光显微镜观察细胞形态并拍照。
1. 5　流式细胞术:将处于对数生长期的细胞分为 3
组 ,对照组、青蒿素和青蒿琥酯用药组 ,对照组用
PBS ( pH7. 4)代替药液 , CO2孵箱内继续培养 24和
48 h。 0. 25% 胰酶消化后制成细胞悬液。 PBS洗两
次 , 70% 乙醇固定 12 h;再用 PBS洗涤 1次 ,用含
50μg /m L RNase, 0. 5% Tri ton X- 100和 0. 1%
柠檬酸三钠的碘化丙啶 ( PI, 50μg /mL) 避光染色
30 min,用流式细胞仪 ( Becton-Dickinson Co. )检
测细胞周期和凋亡率。
2　结果
2. 1　青蒿素和青蒿琥酯对肿瘤细胞 MCF-7增殖
的影响: 正常 MCF-7细胞排列密集呈梭形 ,细胞与
细胞之间界限不明显 ,青蒿琥酯处理 24 h后细胞排
列疏松 ,呈分离状态 , 48～ 72 h细胞逐渐变圆 ,折光
性增强 ,漂浮细胞增加。
SRB法测定青蒿素和青蒿琥酯对 MCF-7细胞
生长的影响: 青蒿素从浓度 0. 17, 0. 33, 0. 66, 6. 6,
11到 110μmol /L 对 MCF 细胞生长抑制约在
20% ～ 35%。 青蒿琥酯能强烈抑制 MCF-7细胞的
增殖 ,其 IC50为 ( 0. 31± 0. 016)μmol /L ( IC50的计
算用“ IC50计算软件”进行 )。
2. 2　青蒿素和青蒿琥酯对 MCF-7的细胞周期改
变:流式细胞检定 ( FCM )结果显示 1μmol /L青蒿
琥酯和 10μmol /L青蒿素能明显改变 MCF-7的细
胞周期: 不加药组 (对照组 ) 体现了肿瘤细胞的特
性 ,处于 S期的细胞多达 51. 79% 。青蒿琥酯和青蒿
素使 S期细胞明显减少 ,细胞的生长被滞留在 G0+
G1期。 说明青蒿琥酯和青蒿素阻止了基因组 DNA
的合成 ,从而抑制了细胞的分裂增殖速度。并且随着
药物作用时间的延长 ,这种抑制作用有所增强 (见
表 1)。
表 1　青蒿素和青蒿琥酯对 MCF-7细胞周期的影响
Table 1　 Effect of artemisinin and artemisunate
on cell cycles of MCF-7 cells
组　别　　 G0+ G1 /% S /% G2+ M /%
对照 39. 14 51. 79 　　　 9. 07
青蒿素 24 h 62. 77 26. 11 11. 12
青蒿素 48 h 63. 23 23. 43 13. 33
青蒿琥酯 24 h 65. 33 26. 29 8. 38
青蒿琥酯 48 h 66. 24 22. 58 11. 17
2. 3　青蒿素和青蒿琥酯对 MCF-7细胞凋亡的诱
导作用: 10μmol /L青蒿素和 1μmol /l青蒿琥酯分
别作用于 MCF-7细胞 24 h后 ,用 DNA荧光染料
二氨基苯基吲哚 ( DAPI)对细胞进行染色 ,荧光显
微镜观察到一些细胞核皱缩 ,聚集于核膜边缘 ,呈境
界分明的块状或半月状的凋亡小体 ( apopto tic
body )。其中 ,青蒿琥酯作用后形成的凋亡小体明显
高于青蒿素的作用。
由于凋亡细胞内 DNA裂解成小片段 ,从细胞
内漏出 ,因而 DNA含量直方图上 , G峰左侧出现非
整倍体 DNA的峰型 ,此峰的百分比即为凋亡细胞
的含量。 MCF-7细胞对照组凋亡细胞占 5. 93% , 10
μmol /L青蒿素作用后凋亡细胞占 6. 00% ,即几乎
·348· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 4期 2003年 4月
未形成凋亡峰 ,而经 1μmo l /L青蒿琥酯处理后凋
亡细胞占 14. 62% ,形成一小的凋亡峰。
DAPI染色结果与 FCM结果都显示青蒿琥酯
比青蒿素诱导 MCF-7细胞凋亡的能力强得多。
2. 4　青蒿素和青蒿琥酯作用后死细胞增多:用台盼
蓝拒染色法计数 1 000个细胞中台盼蓝染色阳性即
死细胞的数量。 结果显示对照组死细胞在 1%～
3% , 10μmo l /L的青蒿素作用 48 h后 ,使得细胞死
亡率增高 ,达到 10. 40% ; 1μmol /L青蒿琥酯作用
48 h后 ,死细胞增至 43. 60% 。
3　讨论
　　已有研究证明青蒿琥酯对人宫颈癌细胞系
Hela细胞的 IC50为 37μg /m L,而对人涎腺样癌细
胞 SACC-83的 IC50为 30μg /mL[4 ] ,青蒿琥酯对体
外培养人宫颈癌 Hela细胞、人低分化鳞状上皮鼻
咽癌 CNE2和 SUNE-1细胞的 IC50分别为 42. 7,
101. 6, 1. 29μg /mL[ 3]。对人肝癌 BEL-7402细胞的
IC50为 21. 4μg /mL ( 52. 5μmol /L ) [ 5]。本实验中青
蒿琥酯对 MCF-7细胞的 IC50为 0. 31μmol /L
( 0. 12μg /mL)。 上述实验结果说明青蒿琥酯对
MCF-7细胞有选择性杀伤作用。
在研究抗疟原虫机制中 ,通过比较青蒿素及其
衍生物的构效关系发现青蒿素结构中的过氧基是产
生抗疟作用的必需基团 ,内酯环的羰基 (第 12位
上 ) 还原成羟基以及增长该羟基链时可增效 [ 6]。本
实验结果对青蒿素骨架上 12-C上内酯环的羰基
(第 12位上 )进行衍生化处理后的青蒿琥酯 ,对肿
瘤细胞的抑制作用比青蒿素明显增强。
本实验表明 ,青蒿素和青蒿琥酯对 MCF-7细
胞的周期作用相似。青蒿素和青蒿琥酯作用 MCF-7
细胞 24 h后 , S期细胞明显减少 , M CF-7细胞的生
长被滞留在 G0+ G1期。说明青蒿素和青蒿琥酯阻止
了 MCF-7细胞 DNA的合成 ,从而抑制了细胞的分
裂增殖速度。 SRB法测定细胞增殖水平表明青蒿素
对 MCF-7细胞增殖仅有微弱抑制作用 ,但其衍生
物青蒿琥酯却有非常显著的抑制作用 ,实验结果表
明青蒿素和青蒿琥酯药效有明显差异的原因有二:
( 1)青蒿琥酯诱导 MCF-7细胞凋亡的作用较强:尽
管由于 MCF-7细胞缺失 caspase3蛋白 ,其细胞在
青蒿素和青蒿琥酯作用下发生凋亡的程度较轻 ,但
我们从亚 G1期细胞的含量可看出 , 10μmo l /L青蒿
素几乎没有亚 G1期细胞峰 ,而 1μmol /L青蒿琥酯
亚 G1期细胞的含量有 14% , DAPI染色也观察到 1
μmol /L青蒿琥酯比 10μmol /L青蒿素诱导的凋亡
细胞数量多 ,这与张星等认为青蒿琥酯促进人肝癌
BEL-7402细胞的凋亡结果一致 [ 5]。 ( 2)青蒿琥酯直
接的细胞毒作用较强。台盼蓝拒染显示 10μmo l /L
青蒿素作用 48 h 后 ,死亡细胞达到 10. 4% , 1
μmol / l青蒿琥酯作用后死细胞达到 43. 6% ,说明药
物作用后细胞膜通透性增加 ,导致细胞死亡。由于青
蒿素类药物抗疟原虫的机制之一就是导致疟原虫膜
系损伤 [7, 8 ] ,那么在青蒿素类药物对肿瘤细胞的直接
细胞毒作用是否与其作用于细胞膜、导致膜系损伤
和细胞死亡相关 ,以及这种直接细胞毒作用是否随
着青蒿素内酯环第 12位上的羰基还原成羟基以及
增长该羟基链而增效 ,值得进一步研究。
致谢:感谢中国科学院药物研究所李英研究员
对工作的建议!
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通　　知
为了便于国际交流 ,本刊决定从 2003年第 1期起 ,文内的图题、表题、图注、表注及文后的参考文
献一律用中、英文两种文字表示。 请投稿时按以上要求撰写。
《中草药》杂志编辑部
·349·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 4期 2003年 4月