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蜜环菌激发子诱导猪苓细胞活性氧产生的信号途径
夏洪燕,郭顺星X
(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所, 北京　100094)
摘　要: 目的　阐明蜜环菌激发子诱导猪苓细胞活性氧的产生机制。方法　用 Luminol 化学发光法测定活性氧产
生量。结果　在猪苓细胞活性氧产生过程中, 含乙二醇双 (B-氨乙基) 四乙酸 ( EGTA ) 的缺钙培养基能抑制其活性
氧产生, 而加入钙,则可起促进作用。钙离子载体 A23187 单独可诱导含钙介质活性氧的产生,说明活性氧的产生有
钙离子的参与。蛋白丝酶抑制剂苯甲烷碘酰氟 ( PMSF ) 可以抑制活性氧形成。磷酯酶 C ( PLC) 的抑制剂硫酸新
霉素及磷酸肌醇磷酸酶的抑制剂氯化锂均可促进活性氧的产生。结论　猪苓细胞活性氧的产生与 Ca2+ 、蛋白磷酸
化有关。
关键词: 猪苓;活性氧; 激发子;钙离子
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 03 0249 03
Signal transduction pathway of active oxygen species in Polyporus
umbellatus induced by elicitor from Armillaria mellea
XIA Hong-yan, GUO Shun-x ing
( I nstitute of M edicinal Plant Development , CAMS & PUMC, Beijing 100094, China )
Key words : Polyporus umbellata ( Pers. ) Fr . ; act iv e oxygen species ( AOS) ; elicitor ; Ca
2+
　　活性氧 ( H2O 2 , O÷2 ,·OH) 是生物在有氧条件
下产生的毒性氧化剂[ 1]。动物吞噬细胞如多形核白
细胞能产生活性氧 ( O÷2 及 H2O2 ) [ 2] ,且其产生的活
性氧在抵御病原菌侵染过程中起重要的作用。
Schw ack 等[ 3]认为不同生物之间在建立共生关系初
期也会引起防卫反应, 但这种防卫反应能够被精确
地控制,以允许两种生物建立有效的共生体系。用来
源于外生菌根真菌 A manita muscar ia 和 H ebeloma
crustul inif orme 的激发子处理云杉细胞, 发现同来
源于病原真菌 H eterobasidion annosum 激发子处理
一样,均可诱导活性氧的产生。关于活性氧产生的信
号机制认为有 Ca2+及蛋白磷酸化的参与。但关于两
种真菌共生初期是否伴随着活性氧的产生及其产生
的机制和意义尚未见报道。猪苓、密环菌属特殊的菌
与菌共生关系, 对两者共生机制的研究仅限于解剖
学, 作者曾报道来源于蜜环菌的激发子可以诱导猪
苓活性氧产生[ 4] ,本实验旨在探讨其活性氧产生的机
制,从而为阐明猪苓与蜜环菌的共生机制奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　菌株来源:猪苓 Polyporus umbellatus ( Pers. )
F ries 菌株由本所真菌室提供。
1. 2　蜜环菌激发子:参考文献方法制备 [ 4]。
1. 3　猪苓菌丝细胞活性氧释放量的测定
1. 3. 1　将培养 3 周的猪苓菌丝细胞用试验介质洗
涤 3 遍, 试验介质组成: 2% 蔗糖, 1 mmol/ L
NaH2PO 4 , 1 mmol / L ( NH4 ) 2SO4 , 1 mmol/ L
M gSO 4 , 1 mmo l/ L CaCl2 , 25 mmo l/ L KNO3 ,
5 mmol/ L 2-[ N-吗啡]乙磺酸, 用 NaOH 调 pH 至
·249·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 3 期 2003年 3月
X 收稿日期: 2002-06-11作者简介:夏洪燕 ( 1973—) , 2001年毕业于中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,获理学博士学位。主要从事药用真菌生物技术研究工作。
* 通讯作者　T el: ( 010) 62899729　E-mail: sxguo@ hotm ail . com
7. 0。将洗涤后的菌丝细胞按 0. 5 g / mL 转至相同介
质中, 25 ℃, 120 r / min 振荡培养 90 min 后加入蜜
环菌激发子, 终浓度相当于 10. 8 mg/ mL 菌丝。
1. 3. 2　Lum inol 化学发光法测定活性氧: 仪器为
KH463A-自动定标器。参照 Glazener 等 [ 5] 配制
Lum inol 母液。反应体系组成: 1. 5 mL 猪苓悬浮液,
200 LL 激发子, 400 LL 20 mmol/ L K 3[ Fe( CN) 6] ,
260 LL 70 Lmol/ L Lum inol。在加入激发子后 90
min 测定活性氧产生量。去 Ca2+ 试验时,培养液中
不含 Ca2+ , 另含 1 mmol/ L EGT A。A23187, EG-
TA、硫酸新霉素、CaCl2与激发子同时加入,终浓度
分别为 20 Lmol/ L , 1 mmol / L , 3. 2 Lmol/ L 和 1. 5
mmol/ L , 氯化锂在加入激发子前 30 m in内加入。图
表中 E 指激发子。
2　结果与分析
2. 1　Ca2+ , EGTA 和 A 23187 对猪苓细胞活性氧
产生的影响: EGTA 可以螯合基质中的 Ca2+ ,向无
钙的猪苓细胞中加入 EGTA (终浓度 1 mmol/ L ) ,
可以减少但不能完全抑制活性氧的产生, 而外加
CaCl 2 则可以提高活性氧释放量 (图 1) , 说明胞外
Ca
2+内流可能参与了活性氧的释放。
图 1　EGTA 和 CaCl2对猪苓细胞活性氧产生的影响
Fig. 1　Effect of EGTA and CaCl2 on AOS in G. umbellata
　　A 23187 是电压依赖型的 Ca2+ 载体, 可以促使
胞外 Ca2+ 内流。从图 2可以看出单独加入 A23187
可以诱导活性氧产生, 但产生的量较单独加入激发
子少,而 A23187 与激发子同时加入, 在含 Ca2+ 悬
浮细胞中活性氧积累量基本与单加激发子持平。另
外,无论是单独加入 A23187, 还是与激发子同时加
入,含 EGTA 的悬浮细胞均较含 Ca2+ 的悬浮细胞
中产生活性氧少。
2. 2　PMSF 对猪苓活性氧产生的影响:苯甲烷磺酰
氟 ( PMSF) 是蛋白丝酶的特异性抑制剂,向激发子
处理后的猎苓菌丝细胞中加入 PMSF 可以抑制活
a-E　b-A23187+ EGT A　c-A23187+ CaCl2
d-E+ A23187+ EGT A　e-E+ A23187+ CaCl2
图 2　A23187 对猪苓细胞活性氧产生的影响
Fig. 2　Effect of A23187 on AOS in G. umbellata
性氧产生,抑制率约为 20%。
2. 3　硫酸新霉素和氯化锂对猪苓细胞活性氧释放
的影响:用 3. 2 Lmo l/ L 硫酸新霉素 (磷酯酶 C 的
抑制剂) 处理猪苓细胞后, 可以提高活性氧释放量
(图 3)。加入磷酸肌醇磷酸酶的抑制剂氯化锂也可
以提高活性氧释放,且活性氧释放量随氯化锂浓度
增加而增大 (图 4)。
图 3　硫酸新霉素对猪苓活性氧释放的影响
Fig. 3 Ef fect of neomycin sulphate on AOS in G . umbellata
图 4　氯化锂对猪苓活性氧释放的影响
Fig. 4 Eff ect of LiCl on release of AOS in G. umbellata
3　讨论
3. 1　Ca2+ 及蛋白磷酸化与活性氧产生的关系:用 1
mmol / L EGT A 处理猪苓细胞可以减少但不能完全
抑制活性氧的产生, 而外加 1. 5 mmo l/ L CaCl2 , 则
·250· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 3 期 2003年 3月
可以增加活性氧释放量,说明在活性氧产生过程有
钙离子的参与。用钙离子载体 A23187 进一步证实
了上述结论。向猪苓细胞中单独加 A23187 可以诱
导活性氧产生, 而 A23187 与激发子同时加入与单
独加激发子相比活性氧产生水平相当, 这与
Shaw acke 等[ 3]报道结果相一致: 即用 A23187 或
A23187 与激发子共同处理云杉细胞都可诱导活性
氧的释放。
在生物系统中, 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化协
同作用,共同完成胞内信号传递[ 6]。应用磷酸酶及蛋
白激酶的抑制剂是研究磷酸化与生物效应常用的方
法,如激酶抑制剂阻碍特定的反应,则磷酸酶抑制剂
可以激活该反应[ 7]。PM SF 是蛋白酶的抑制剂, 可以
抑制蛋白的脱磷酸化, 从而使被蛋白激酶激活的蛋
白保持磷酸化状态。不同蛋白酶抑制剂处理不同细
胞所得结果也不同, 用酵母激发子或带无毒基因的
Pseudomonas sy ringae pv gly cine 处理大豆悬浮细
胞,外加 PM SF 可以加强氧化迸发[ 8]。而蛋白酶
chymotrypsin 特定的抑制剂, 可以抑制被激活的人
类多形核白细胞[ 9, 10]。用不同的蛋白酶抑制剂处理
豚鼠腹膜巨噬细胞, 发现 PMSF、3, 4-双氯异香豆
素、n-甲苯磺酰-L -氨基联苯氯甲基酮、亮异蛋白酶
肽对活性氧的产生无影响, 而 4-( 2-氨乙基) 苯碘酰
氟可以抑制 O÷2 的产生, 认为 4-( 2-氨乙基) 苯磺酰
氟可能直接阻止 p47ph ox或 p67phox亚单位与催化亚单
位 cytb59 的结合,从而抑制 O÷2 的产生。本实验用
PM SF 处理猪苓细胞可以抑制 O÷2 的产生,其机制
可能类似于 4-( 2-氨乙基) 苯磺酰氟对豚鼠腹膜巨
噬细胞产生 O÷2的抑制。
3. 2　肌醇磷脂系统与活性氧释放的关系: Ca2+ 被认
为参与生物系统的防卫反应,胞内 Ca2+ 浓度增加来
源于胞外 Ca2+内流及胞内钙库的释放。位于质膜内
侧的磷酯酰肌醇二磷酸 ( PIP 2 ) 可在磷酯酶 C
( PLC) 的催化下水解产生 IP 3和 DG, 其中 IP 3可以
引起胞内钙库总动员, 促使钙库释放钙,从而提高胞
质钙浓度,引发生理效应。硫酸新霉素通过抑制磷酯
酶 C 活性而抑制 PIP 2水解为 IP3 ,从而导致细胞质
中 Ca2+浓度减少。而氯化锂则可抑制从磷酸肌醇向
磷脂酰肌醇转变,阻断磷酸肌醇的循环,从而影响胞
内 Ca2+ 库释放。一般说来,硫酸新霉素和氯化锂可
以抑制动物、植物细胞活性氧的释放,对猪苓细胞所
做的实验表明硫酸新霉素和氯化锂可以促进活性氧
的释放, 说明猪苓细胞中活性氧的释放途径与动物
和植物细胞不同。
蜜环菌与猪苓属特殊的真菌与真菌的共生关
系。蜜环菌激发子诱导猪苓活性氧产生可能象动植
物一样可以激活防卫基因表达并限制蜜环菌入侵范
围的扩大,对此仍待深入研究。
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葡　萄　籽　提　取　物
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