全 文 ：葡萄籽原花青素的反相液相色谱-质谱分析
孙　芸 1 ,陶冠军 2 ,谷文英 1
( 1. 江南大学食品学院 ,江苏 无锡　 214036;　 2. 江南大学 分析测试中心 ,江苏 无锡　 214036)
摘　要: 目的　用反相液相色谱 -电喷雾质谱 ( RP-HPLC /ESI-M S)分析葡萄籽粗提物中低聚原花青素的组成。方法
根据质谱的准分子离子 [ M- H](m /z )检测其单体及低聚体。结果　初步检测出 3个单体、 7个二聚体及 3个三聚
体。 结论　表明 RP-HPLC /ESI-M S联用可以分析葡萄籽原花青素低聚体的基本组成。
关键词: 葡萄籽 ;原花青素 ;液相色谱 ;电喷雾质谱
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0493 04
Analys is of procyanidins in grape seeds by RP-HPLC /ESI-MS
SUN Yun
1
, T AO Guan-jun
2
, GU Wen-ying
3
( 1. Schoo l o f Food Science and Techno lo g y, Southern Yang t ze Univ ersity, Wuxi 214036, China;
2. Ana ly sis and Testing Center , Southern Yang tze Univ er sity , Wux i 214036, China )
Abstract: Object　 The analy sis o f o lig omeric procyanidins in crude g rape seed ex t racts was performed
by reversed-phase high-perfo rmance liquid ch romatog raphy w ith elect ro spray ionization mass spect rometry
( RP-HPLC /ESI-M S) . Methods　 Procyanidin monomer and o lig omers were identi fied according to the
mass o f the charged pseudomo lecular ion [M- H ]. Results　 Three monomers, sev en dimmers and three
t rimers were tentativ ely identi fied. Conclusion　 This study demonst ra tes the capabi li ty of the combination
o f RP-HPLC with ESI-M S to analy ze the composi tion of olig omeric pro cyanidins in g rape seed ex t racts.
Key words: g rape seeds; procyanidins; HPLC; ESI-M S
　　现代研究表明 ,葡萄籽原花青素是迄今为止所
发现的最有效的自由基清除剂之一 [1 ]。 葡萄籽原花
青素主要由 (+ ) -儿茶素、 ( - ) -表儿茶素、 ( - )-表
儿茶素没食子酸酯及其二聚、三聚、四聚……最高平
均聚合度达十五聚体组成 [2 ]。 各单体之间主要通过
4→ 6或 4→ 8键相连 ,葡萄籽中的原花青素由于聚
合度、单体及连接键的不同 ,结构非常复杂。因此 ,原
花青素的分析分离及结构表征比较困难。 目前从葡
萄籽中鉴定了 3种单体、 14种二聚体 (其中 6种为
没食子酸酯形式 )、 11种三聚体 (其中 3种为没食子
酸酯形式 )及 1种四聚体 [3 ]。
原花青素各低聚体及各同聚异构体之间极性相
近 ,一般较难分开。 其分离分析除了薄层色谱
( TLC)及毛细管电泳法以外 ,最常用的是 HPLC(紫
外或荧光检测 )。正相液相色谱法可以按原花青素相
对分子质量 (聚合度 )的不同将其分离 ,甚至可以检
测七聚体 [4 ] ,但不能区分同聚体中各异构体。反相色
谱则可以较好地分离单体及二、三聚体的某些异构
体 [5 ]。 原花青素的结构鉴定可用硫解法、质谱及
NM R。硫解法可以鉴定粗提物中原花青素的平均聚
合度及大致组成 (儿茶素、表儿茶素比例 ) [6 ] ,质谱法
可以提供各化合物的结构信息 ,特别是与 HPLC的
联用 ,成为复杂化合物在线分析及检测的强有力的
工具。电喷 雾质谱是一种大气压电离技术 ,易于与
液相色谱联用 ,作为一种软离子化技术 ,主要产生准
分子离子 ,碎片少 ,可以直接根据分子离子定性 ,特
别适用于多酚类物质的检测。 Hammerstone等用正
相液相色谱-电喷雾质谱联用成功地分离和定性分
析了可可及巧克力、苹果、花生等食品中原花青素单
体及低聚体的组成 [ 7 ]。 Fulcrand等则用反相色谱 -电
喷雾质谱分析了葡萄酒中的低聚原花青素 [8 ]。在用
反相液相色谱分析葡萄籽中低聚原花青素的组成
时 ,一般需要较长时间 ( 90～ 100 min)才能基本分
离 ,各成分的定性需要相应的对照品鉴定 ,而且由于
原花青素异构体数目繁多 ,一般液相很难分开 ,能得
到的异构体也仅有限的几种 ,命名葡萄籽中原花青
·493·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-09-23作者简介:孙　芸 ( 1974- ) ,女 ,山东莱芜人 ,博士研究生 ,研究方向为天然药食科学。
* 通讯作者　 Tel: ( 0510) 5879957　 E-mai l: Wygu@ sy tu. edu. cn
素的分析十分烦琐。而反相色谱 -电喷雾质谱联用作
为一种简便适用的方法在分析葡萄籽原花青素低聚
体方面的研究还很少 ,本实验采用 RP-HPLC-M S
分析了葡萄籽粗提物中的低聚原花青素 ,直接根据
各物质的分子离子或 ESI质谱信息定性 ,更简便地
对其低聚原花青素的组成作了初步的分析。
1　材料与方法
1. 1　仪器、试剂与样品: Waters Pla tform ZMD
4000液质联用仪 , Waters 2690液相色谱仪 (包括梯
度泵、自动进样器等 ) , W aters 966二极管阵列检测
器。甲酸 (分析纯 ) ,甲醇 (色谱纯 ) ,重蒸水。市售原
花青素产品 (纯度≥ 95% ) ,甲醇溶解 , 0. 45μm膜过
滤后 HPLC分析 ;葡萄籽提取液为干葡萄籽粉碎后
室温依次用甲醇、 80%甲醇、 70%丙酮提取 ,提取液
过滤 ,各滤液合并后 40℃旋转蒸发除去溶剂 ,剩余
水溶液用石油醚除去脂溶性成分 ,分离后蒸干水溶
液 ,固形物溶于甲醇 ,过 0. 45μm膜后用 HPLC-M S
分析。
1. 2　色谱及质谱条件
1. 2. 1　色谱条件:色谱柱 Zorbax XDB ( 5μm, 4. 6
mm× 250 mm);流动相 A: 1%甲酸 , B: 80%甲醇 -
1%甲酸 ,梯度洗脱: 0～ 5 min, 100% A; 5～ 50 min,
100A%→ 20% A+ 80% B,流速 1 mL /min。 柱温 30
℃ ,进样量 20μL,检测分流比 5∶ 1。
1. 2. 2　质谱条件: 扫描方式:负离子扫描 ( ESI,m /z
260～ 1 500) ,毛细管电压 4. 2 kV,锥孔电压 50 V ,
光电倍增器电压 650 V ,离子源温度 120℃ ,脱溶剂
气温度 300℃。
2　结果与讨论
葡萄籽中的原花青素含 3种单体: (+ ) -儿茶
素、 ( - )-表儿茶素及 ( - ) -表儿茶素没食子酸酯 ,相
对分子质量分别为 290, 290, 442,相应的 ES-准分子
离子 [M - H] m /z分别为 289, 289, 441。各单位之
间通过黄酮间键 C-C( 4→ 6或 4→ 8)键相连 ,形成原
花青素的二聚、三聚、四聚等各聚合体 ,相对分子质
量分别为 578(二聚 ) , 730(二聚单酯 ) , 882(二聚二
酯 ) , 866(三聚 ) , 1 018(三聚单酯 ) , 1 154(四聚 )等 ,
准分子离子 ( ES-)m /z分别为 577, 729, 881, 865,
1 017, 1 153……。本实验以负离子为选择离子检测
原花青素各低聚体。
由于葡萄籽提取液中杂质含量较高 ,干扰较大 ,
而且原花青素各成分之间极性相近 ,本实验采用的
液相色谱条件仅能较好地分离 3种单体及少数几种
二、三聚体 (图 1) ,但电喷雾质谱的选择离子则能将
几种低聚体区分开。 以下是根据各聚合体相对分子
质量进行选择离子的结果。
时间 t /min
图 1　葡萄籽提取液的液相色谱 ( A)
及总负离子流色谱 ( B)图谱
Fig. 1　 HPLC (A) and total negative ion current
chromatography ( B) of grape seed extract
单体的选择离子色谱检测出 3种单体 (峰 M1、
M2、 M3,出峰时间分别为 24. 42, 29. 92, 33. 66
min )。 研究表明 [3 ] ,葡萄籽中除 (+ ) -儿茶素、 ( - )-
表儿茶素及 ( - ) -表儿茶素没食子酸酯之外并没有
其他的单体结构。峰 M1、M2(m /z 289,儿茶素或表
儿茶素 )的紫外吸收光谱 (λmax 278 nm )和 ESI质谱
信息是一致的。提取液及 95%纯度样品的单体质谱
图中除分子离子外 ,均存在 m /z 579. 8的片段 ,属于
偶合离子 [M+ ( M - H) ]- 。根据报道 ,反相 HPLC
中 (+ ) -儿茶素在 ( - ) -表儿茶素之前出峰 ,可以推
测 M1为 (+ ) -儿茶素 , M2为 ( - ) -表儿茶素。峰 M3
(m /z 441)为 ( - )表儿茶素没食子酸酯 ,其紫外吸
收也在 278 nm产生最大吸收。 质谱中主要包括分
子离子 (m /z 441. 6)及由 ( - ) -表儿茶素没食子酸酯
失去没食子酰基形成的离子 (m /z 289. 5) ,由此可
以断定峰 M3为 (- ) -表儿茶素没食子酸酯。各峰的
ESI质谱图也表明 ,电喷雾质谱主要产生分子离子 ,
碎片很少。
反相 HPLC对异构体的分离能力较强 ,从 m /z
577选择离子色谱图和各峰的 ESI质谱信息可以较
清楚地检出 6种非酯二聚体 (峰 D1～ D6,出峰时间
分别为 20. 34, 21. 18, 21. 78, 23. 58, 25. 97, 26. 45
min,见图 2-A)。m /z 577峰的 ESI质谱图除了准分
子离子外 ,还提供了某些碎片信息 (图 2-a )。根据报
道 ,二、三聚体原花青素的碎片断裂方式主要包括
RDA反应 ( ret ro Diels-Alder反应 )及黄酮间连接
键的断裂 ,在黄酮骨架结构的 C-环上发生 RDA反
应后可能失去一个中性的 C8 H8O3结构 (相对分子
质量 152) ,形成的离子片段还可以进一步失去一分
·494· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
质荷比 m /z
　　　 A-非酯型二聚体　　　　 B-单没食子酸酯二聚体
　　　 a-峰 D1～ D6 b-峰 D7
　　　 A-nongalloyled dimers B-mon ogalleyled dimers
　　　 a-p eak D1- D6 b-peak D7
图 2　二聚原花青素选择离子色谱 ( A, B)
及其 ESI质谱图 ( a, b)
Fig. 2　 Selected ion chromatography (A, B) and
ESI-MS ( a, b) of procyanidin dimers
子 H2O。 Wollgast等 [ 9]在用 CID-M S-M S研究巧克
力原花青素及直接进样研究原花青素 B2(表儿茶素
4β→ 8表儿茶素 )质谱图的结果肯定了此反应的存
在。本实验中 m /z 577的碎片 ,m /z 425. 6及 m /z
407也验证了这一点。另外为了区分原花青素聚合
体中各个位置的黄烷醇结构 , Po rter [9 ]根据各单体
连接的键位置提出了一种命名法 ,将原花青素分子
分 为 T-unit ( to p ) , M-unit ( middle )及 B-unit
( base) , T-uni t仅以 C4键与其他单位相连 , M-unit
除 C4键 ,还存在 C6或 C8键 , B-uni t则以 C6或 C8
键与上端基团相连。据此 ,以失去一个单体单位为
例 ,原花青素各单位体之间键的断裂有两种可能:一
种是失去 T-unit ( C15 H12O6 )中性碎片 ,形成 m /z为
[M- 288- H ]-的离子。还可失去 B-unit ( C15H14O6 )
中性碎片 ,形成 m /z为 [M - 290- H]-的离子。显
然 ,图 2-a中 m /z 289. 5为二聚体失去 T-uni t的结
果。另外选择离子 m /z 729仅检测出一种二聚体单
没食子酸酯 (出峰时间 27. 77 min,见图 2-B) ,其
ESI质谱图中 m /z 729为准分子离子峰 (图 2-b) ,进
而失去没食子酰基 (相对分子质量 152) ,形成二聚
体负离子 m /z 577. 6,或失去一个 T-uni t形成 ( - ) -
表儿茶素没食子酸酯负离子 m /z 441. 6。
选择离子检测三聚体的结果由于杂质的干扰及
异构体数目增加 ,使化合物难以分开 ,仅几种含量较
高的三聚体较明显地表现出来 ( T1, T2, T3,出峰时
间分别为 22. 26, 26. 45, 28. 37 min,图 3-A) ,其 ESI
质谱碎片也主要是失去一个 T-unit形成的 (m /z
577. 8,图 3-a)。
质荷比 m /z
图 3　原花青素非酯型三聚体选择离子色谱图 (A)
及其 ESI质谱图 ( a)
Fig. 3　 Selected ion chromatography of nongalloyled
trimers of procyanidin (A) and its ESI-MS ( a)
本实验采用的 HPLC-M S方法在分析葡萄籽粗
提液时检测了 3个单体、 7个二聚体、 3个三聚体及
1个四聚体。而分析纯度> 95%的市售产品 ,可以检
测出 3个单体、 11个二聚体 (包括 3个二聚体没食
子酸酯结构 )及 8个三聚体 (非没食子酸酯结构 ) (图
略 ) ,这与杂质的干扰有关。葡萄籽提取液在 HPLC-
M S分析前能进一步纯化可以得到更好的结果。
另外从各聚合体的出峰时间来看 ,出峰时间与
聚合度之间没有必然的联系 ,单体结构和连接方式
的不同对原花青素各聚合体及异构体极性的影响更
大 ,使各成分的出峰次序相互交叉。更高聚合度的原
花青素 ,异构体数目更多 ,极性分布更复杂 ,在反相
色谱上无法分开。
·495·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
3　结论
本实验采用的 RP-HPLC /ESI-M S可以更简便
地分析葡萄籽低聚原花青素 ( DP1-3)的基本组成 ,
但由于各聚合体异构体数目繁多 ,其 ESI质谱行为
也很相近。除单体外 ,还未能对各异构体的结构作出
准确的鉴定。
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虎杖的水溶性成分研究
肖　凯 ,宣利江 ,徐亚明 ,白东鲁

(中国科学院上海生命科学研究院上海药物研究所 ,上海　 200433)
摘　要: 目的　研究虎杖的水溶性活性成分。方法　利用反相色谱的方法分离纯化 ,根据化合物的化学性质与光谱
数据鉴定其结构 ,并测试其生物活性。结果　虎杖根茎的 60%丙酮提取物中分得 6个化合物 ,确定其结构分别为白
藜芦醇 (Ⅰ ) ,云杉新苷 (白藜芦醇 -3-O -β -D-吡喃葡萄糖苷 ) (Ⅱ ) , 2, 3-二氢 -2-( 4′-O-β -D-吡喃葡萄糖基 -3′-甲氧基 -
苯基 ) -3-羟甲基 -5-( 3-羟基丙基 ) -7-甲氧基苯唑呋喃 (Ⅲ ) , 2, 6-二甲氧基 -p -苯 -1-O-β -D-吡喃葡萄糖苷 (Ⅳ ) , 5, 7-二
羟基 -异苯唑呋喃 (Ⅴ ) , 5, 7-二羟基 -异苯唑呋喃 -7-O-β -D-吡喃葡萄糖苷 (Ⅵ )。 结论　化合物Ⅲ ～ Ⅵ 为首次从该植
物中分得 ,化合物Ⅰ ～ Ⅵ 没有显示出 DN A裂解活性 ,化合物Ⅱ对 KB和 MCF-7细胞表现出较弱的细胞毒活性。
关键词: 虎杖 ;水溶性成分 ;生物活性
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0496 03
Studies on water-soluble constituents in rhizome of Polygonum cuspidatum
X IAO Kai , X UAN Li-jiang, XU Ya-ming , BAI Dong-lu
( Shanghai Institute of Ma teria Medica , Shanghai Institute fo r Biolog ical Sciences, CAS, Shanghai 200031, China)
Abstract: Object　 To study the chemical st ructures and bioactivity of the w ater-soluble consti tuents
f rom Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. Methods　 To isolate the constituents by reverse phase meth-
ods, and characterize thei r st ructures by the analysis of chemica l proper ty and spectral data. Results　 Six
compounds w ere iso la ted f rom the 60% aqueous acetone ex t ract f rom the rhizome of P. cuspidatum . Thei r
st ructures w ere elucidated as rev erat rol (Ⅰ ) ; piceid (Ⅱ ) ; 2, 3-dihydro-2-( 4′-O-β-D-g lucopyranosy l-3′-
methoxy-pheny l) -3-hydroxymethyl-5-( 3-hydroxypropyl ) -7-methoxybenzofuran (Ⅲ ) ; 2, 6-dimethoxy-p-
hydroquinone-1-O-β -D-g lucopyrano side (Ⅳ ) ; 5, 7-dihydroxy-isobenzofuran (Ⅴ ) and 5, 7-dihydroxy-
isobenzofuran-7-O-β -D-glucopy rano side (Ⅵ ) , respectiv ely. Conclusion　 Compounds Ⅲ - Ⅵ are iso lated
·496· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-10-18