全 文 ：聪圣胶囊对拟缺血再灌注大鼠
原代培养皮层神经细胞的保护作用
赵　玲 1 ,徐秋萍 2 ,李　林 1⒇
( 1. 首都医科大学宣武医院 药理研究室、北京脑老化重点实验室 ,北京　 100053; 2. 北京中医药大学 药理教研室 ,北京
100029)
摘　要: 目的　研究聪圣胶囊对大鼠原代培养皮层神经细胞拟缺血再灌注损伤的影响。 方法　采用血清药理学和
流式细胞仪的方法 ,观察聪圣胶囊含药血清对缺糖缺氧 ( 3 h )拟缺血再灌注 ( 0, 3, 6, 18 h)损伤神经细胞乳酸脱氢
酶 ( LDH)漏出及神经细胞凋亡率的影响。结果　聪圣胶囊含药血清 ( 2, 4, 8 g /kg)可抑制缺糖-缺氧 3 h再灌 ( 0,
3, 6和 18 h )引起的神经细胞内 LDH的释放。降低缺糖 -缺氧 3 h再灌 18 h导致的凋亡细胞率。结论　聪圣胶囊
可减轻缺血性脑损伤。
关键词: 聪圣胶囊 ;神经细胞 ;脑缺血再灌注 ;细胞凋亡
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 02 0144 03
Effects of Congsheng Capsule on cultured rat cerebral
cortical neurons after ischemia-reperfusion.
ZHAO Ling1 , X U Qiu-ping2 , LI Lin1
( 1. Depa rtment o f Pharmacolog y , Beijing Key Labora to ry fo r Brain Aging , Xuanw u Hospita l of Capital Univ er sity o f Medical
Sciences, Beijing 100053, China; 2. Depar tment of Pha rmaco lo gy , Beijing Univ er sity o f TCM , Beijing 100029, China )
Abstract: Object　 To investigate the pro fectiv e effects of Cong sheng Capsule ( CSC) on cultured cere-
bral cortical neurons af ter cerebral ischemia-reperfusion in o rder to study the anticerebral i schemia effect of
CSC. Methods　 Drug-containing serum was used to study the protectiv e ef fect of CSC on neurons dam-
aged during hypo g lucos and hypoxia ( 3 h) /reoxygenation ( 0, 3, 6, 18 h ) , the demage to neurons was re-
f lected by the increase in activi ty of lactate dehydrogenase ( LDH) released f rom cel ls into culture medium
and the changes of apoptosic cells w hich w ere studied by f low cy tometry. Results　 The serum preparation
o f CSC ( 2, 4, 8 g /kg ) a t tenuated neuronal damage during hypo glucos and hypoxia ( 3 h) / reoxygenation
( 0, 3, 6, 18 h ) by decreased LDH and changes in apoptosic cell numbers. Conclusion　 CSC has protectiv e
ef fects on cerebral i schemic damage.
Key words: Cong sheng Capsule; neuron; cerebral i schemia-reperfusion; apoptosic cell
　　聪圣胶囊来源于王永炎院士的临床经验方 ,功
能为益肾养肝、活血化浊、健脑增智 ,临床主治脑血
管病后出现的老年期血管性痴呆。本室前期工作表
明 ,本方具有缩小大鼠大脑中动脉阻断后脑梗死面
积 ,改善神经功能缺失症状 ,减轻脑水肿 ;改善早老
龄小鼠脑缺血再灌注致血管性痴呆模型的学习记忆
障碍程度 ,提高脑血流量等作用。本研究拟进一步探
讨聪圣胶囊对拟缺血再灌注损伤大鼠原代培养神经
细胞的保护作用。
1　材料与方法
1. 1　药品与试剂: 聪圣胶囊实验用浸膏系按处方
(制首乌、荷叶、漏芦、肉苁蓉、地龙 )制成 ,由吉林省
辽源市亚东药业股份有限公司提供 ,批号为:
970606。阳性对照药喜得镇片 ,由瑞士山德士药厂与
国营天津华津制药厂合作生产 ,批号 971166。多聚
赖氨酸 (相对分子质量 150 000～ 300 000) , N AD,
PI ( propidium iodide)和 RNase A均为 Sigma产
品。 Tris、高糖、低糖 DMEM 培养基 ,为 Gibco产
品 ;胎牛血清、马血清为 Hyclone产品 ;其他药品与
试剂均为市售分析纯。
·144· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月
⒇收稿日期: 2002-07-26基金项目: “九· 五”国家攻关课题 ( 96-906-09-03)作者简介:赵　玲 ( 1972— ) ,女 ,辽宁沈阳人 ,助理研究员 ,博士 , 1996年毕业于辽宁中医学院中医系 ,获医学学士学位 ,同年考入北京中医药大学 ,攻读硕士学位 ,导师为徐萍教授 ,在读期间获准硕博连读 , 2001年获医学博士学位 ,研究方向为脑缺血的发病机制和脑缺血与 AD的相关因素分析及中药的影响。
1. 2　动物: Wistar大鼠 ,雄性 ,体重 180～ 200 g,合
格证号为〈医动字〉第 01— 3008号。 24 h内新生鼠 ,
均由中国医学科学院动物中心繁育场提供。
1. 3　仪器: FACS-420型流式细胞仪 ,美国 B. D. 公
司产品 ; 400R低温离心机 ,德国 Heraeus产品 ;
RCO-3000T-5V CO2培养箱 ,美国 G. S产品; SHZ-
82型水浴恒温振荡器 ,江苏省太仓医疗器械厂生产。
1. 4　方法
1. 4. 1　药物血清的制备方法:正常 Wistar大鼠 ,随
机分为 5组。正常组、聪圣胶囊 2, 4, 8 g /kg组、喜得
镇 0. 6 mg /kg组。每日给药 2次 ,第 5次给药后 2 h
颈总动脉取血 , 4℃ 保存 4 h后 3 000 r /min离心
20 min,取血清 , 56℃ 灭活 30 min,过滤除菌 ,分
装 , - 20℃ 贮存。
1. 4. 2　神经细胞原代培养及缺糖 -缺氧诱导神经细
胞拟缺血再灌注损伤模型的建立:取新生 24 h内大
鼠脑皮层 ,依 Murphy[ 1]的方法进行神经细胞培养 ,
培养至 10 d时 ,吸去原培养液 ,用无糖 Ea rle s液
( mmo l /L ): NaCl 116. 4, KCl 5. 4, CaCl2 1. 8, Mg-
SO4 0. 8, NaH2 PO4 2. 6, NaHCO3 26. 2, Hepes 20. 1,
pH 7. 4洗 2遍 ,加入无糖 Ea rle s液 ,放缺氧罐中通
入 95% N2和 5% CO2 30 min,正常对照组及缺糖缺
氧损伤组置 37℃ 恒温培养箱中继续培养 , 3 h后取
出 ,换高糖 DMEM ,并恢复氧供以模拟动物的缺血
再灌状态。正常对照组用含葡萄糖 5. 5 mmol /L的
Earle s孵育。药物血清及正常血清在缺糖缺氧处理
的同时及过程中加入 ,浓度为 10% 。
1. 4. 3　神经细胞损伤的检测:以培养神经细胞释放
LDH的量作为定量评价细胞损伤的指标。分别于缺
糖-缺氧 3 h再灌 0, 3, 6和 18 h取上清液 ,测 LDH
含量 ,然后置培养细胞于 - 20℃冰箱中超过 5 h,冻
融后同法测定总 LDH含量。 细胞损伤程度以培养
细胞释放的 LDH和总 LDH 活力的百 分比
( LDH% )表示。
1. 4. 4　凋亡细胞计数:神经细胞培养 10 d后 ,建立
“缺血再灌注”模型 ,缺糖缺氧 3 h再灌 18 h后收集
细胞计数凋亡细胞。药物血清分别于换 Ea rle s液
和高糖 DM EM的同时加入。 收集细胞悬液 , 1 000
r /min离心 5 min,弃上清 ,沉淀用 70% 乙醇悬浮 ,
4℃冰箱内固定 12 h以上。取固定后的细胞用 0. 01
mo l /L PBS ( pH 7. 4)洗 2遍并悬浮之 ,加入终浓度
为 20 mg /L RNase A, 37℃ 恒浴 45 min,再加入
PI染液至终浓度为 50 mg /L,摇匀后 4℃ 避光冷
藏 1 h,经尼龙网过滤 ,在 FACS 420型流式细胞仪
上计数 10 000个细胞 ,测定各期 DNA含量并计算
凋亡细胞所占比例。
2　结果
2. 1　聪圣胶囊对 LDH释放的影响: 神经细胞缺
糖-缺氧 3 h再灌 0, 3, 6和 18 h, LDH漏出量增加 ,
尤以“缺血再灌”后 LDH升高更加明显 ,与正常组
相比有显著性差异。 这与坏死细胞数和凋亡细胞数
的增加呈正相关 ,说明细胞损伤程度随缺血再灌时间
的延长而加重。不同剂量的聪圣胶囊药物血清和喜得
镇药物血清均可明显降低 LDH的漏出量 ,见表 1。
表 1　聪圣胶囊对缺糖缺氧损伤神经细胞 LDH漏出率的影响 ( x± s )
Table 1 Ef fect of CSC on intracellular LDH release in cultured rat cortical neurons induced by hypoglucose /hypoxia (x± s )
组　别　 剂　量
/ ( g· kg- 1) n
LDH /%
0 h 3 h 6 h 18 h
正常　　 　 - 10 　　　 21. 4± 7. 4* * 　　　 28. 0± 5. 7* * 　　　 29. 0± 4. 2* * 　　　 35. 0± 8. 0* *
模型　　 　 - 10 28. 8± 3. 8 43. 0± 5. 0 62. 0± 9. 0 66. 0± 5. 0
喜得镇　 6× 10- 4 10 22. 5± 10. 0 35. 4± 6. 6* 50. 0± 6. 0* * 56. 0± 7. 0* *
聪圣胶囊 2 10 31. 2± 12. 5 38. 6± 7. 1 57. 5± 8. 8 62. 0± 1. 1
4 10 24. 1± 10. 0 25. 2± 8. 6* * 55. 6± 8. 4 57. 0± 7. 0* *
8 10 17. 3± 6. 9* * 22. 5± 5. 4* * 43. 4± 2. 2* * 52. 0± 3. 0* *
　　　与模型组相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs model g rou p
2. 2　聪圣胶囊对神经细胞凋亡的影响:细胞发生凋
亡以后 ,活化的核酸内切酶将染色质 DNA切割成
许多相对分子质量很低的小片段 ,这些小片段由于
相对分子质量低 ,可以从细胞中扩散出去 ,使细胞内
DNA含量降低。经 PI染色后 ,在流式细胞仪上分
析细胞 DNA各期含量 ,可见在正常细胞 G1峰前面
出现一个 DNA含量减少的“ G1亚峰” ,该峰的出现
被认为是细胞发生凋亡的标志之一。在亚峰前出现
的颗粒为坏死细胞活细胞碎片。本实验结果显示缺
糖-缺氧 3 h再灌 18 h可诱导神经细胞出现“ G1亚
峰” ,经流式细胞仪计数、分析 ,凋亡细胞所占比例是
17. 36% ,聪圣胶囊 4, 8 g /kg和喜得镇 0. 6 mg /kg
含药血清可明显降低缺糖 -缺氧 3 h再灌 18 h导致
的凋亡细胞比例 ,见表 2。
·145·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月
表 2　聪圣胶囊对缺糖缺氧损伤神经细胞
凋亡细胞计数的影响 ( x± s, n= 2)
Table 2　 Ef fect of CSC on apoptotic cell numbers induced
by hypoglucose /hypoxia (x± s, n= 2)
组　别　 剂　量 / ( g· kg- 1) 凋亡细胞率 /%
正常　　 　 - 　　　 7. 57± 3. 12
模型　　 　 - 54. 65± 13. 49
喜得镇　 6× 10- 4 5. 90± 0. 16
聪圣胶囊 2 20. 78± 11. 86
4 16. 65± 7. 30
8 15. 06± 1. 81
3　讨论
　　中药复方由于其成分复杂 ,给体外实验尤其是
细胞培养研究带来诸多不便 ,相当多的体外实验结
果不能和体内实验结果相吻合 ,也不被临床疗效所
证实。造成这些现象有多种原因 ,可能是①非生理环
境的影响 ;②缺乏有效成分 ;③无效成分产生假象 ;
④体外实验的方法存在误差。近年来一些学者采用
了中药含药血清体外实验的方法 ,即在动物口饲中
药一段时间后采血、分离血清 ,用给药后的血清代替
药物的粗提物进行体外实验的一种药理实验方
法 [2～ 4 ]。本实验即采用了这种给药方法。此种方法更
接近于中药复方作用于细胞的体内过程 ,在一定程
度上克服体外实验方法中存在的不足 ,但由于各个
复方成分在体内的代谢过程、半衰期和有效血药浓
度不同 ,使得含药血清制备技术的规范化研究成为
一切研究的基础和关键 ,国内外尚未有这方面的系
统报道 ,因此 ,本研究参照国家自然科学基金重点项
目《中药复方体外试验方法学研究》课题组提出的
《中药含药血清体外实验操作规程》建议草案 ,采用
给药 5次 ,即每日早晚各给药一次 ,连续 2 d,第 3
天早上给药后 1～ 2 h采血的方法制备含药血清 [5 ]。
脑组织对缺血缺氧非常敏感 ,寻找有效的抗缺
血缺氧性脑血管疾病药物极为重要。 应用整体动物
实验研究药物更接近动物的实际情况 ,但往往容易
受到某些因素如脑温、血压、药物本身的副作用及血
脑屏障通透性等因素的影响。使用体外培养神经细
胞的方法可得到相对均一的细胞群体 ,排除上述因
素的影响 ,来研究神经细胞对缺血缺氧性刺激的直
接反应。本研究采用 Goldberg等的方法 [ 6] ,以低糖
低氧损伤原代培养皮层神经细胞的方法模拟在体脑
缺血再灌模型 ,观察聪圣胶囊含药血清的抗脑缺血
再灌作用。
乳酸脱氢酶 ( LDH)是一种细胞内标志酶 ,其
化学和生物性质十分稳定 ,通常情况下神经细胞内
的 LDH漏出很少 ,而受损神经元由于膜通透性的
改变 , LDH释放量明显增加 ,测定培养液中的 LDH
累计释放量是一种简单而且能够定量评价神经元损
伤程度的方法 [7, 8 ]。本实验表明 ,神经细胞缺糖-缺氧
3 h再灌 0, 3, 6和 18 h, LDH漏出量明显增加 ,尤
以缺糖 -缺氧再灌后 LDH升高更加明显。不同剂量
的聪圣胶囊药物血清和喜得镇药物血清可明显抑制
缺糖 -缺氧诱导的神经细胞内 LDH释放 ,提示聪圣
胶囊对缺糖-缺氧诱导的神经细胞损伤有明显的保
护作用。
细胞凋亡是一种生理性调节机制 ,不仅在正常
生理发育中存在 ,而且在某些病理状态下也可发生 ,
许多神经退行性疾病如 Alzheimer s disease ( AD)、
Parkinson s diease ( PD)、脑缺血损伤、癫痫等的发
生均与神经细胞凋亡有关 [9, 10 ]。 本研究以原代培养
大鼠新生鼠脑皮质神经细胞为研究对象 ,利用缺糖-
缺氧诱导神经细胞凋亡的发生 ,观察聪圣胶囊含药
血清对凋亡的抑制作用。 结果表明聪圣胶囊含药血
清可以降低神经细胞凋亡率 ,具有抗凋亡作用。
综上所述 ,聪圣胶囊具有保护神经细胞缺糖 -缺
氧性损伤的作用 ,此作用与其脑保护作用有关。
References:
[ 1]　 Murph y T H, Barabau J M . Glutamate toxici ty in immatu re
cortical neurons p recedes development of glutamate receptor
currents [ J] . Dev B rain Res , 1990, 57: 146-150.
[2 ]　 Liu C H, Liu C, Liu P, et a l. Study on a seropharmaco-
logical meth od fo r an ef fectiv e anti fib rotic fo rm ula [ J] . Chin
J E xp Trad it Med Form (中国实验方剂学杂志 ) , 1998, 4
( 2): 16-19.
[ 3 ]　 Zhang Q H, Ch en K J. Evaluation on serum ph armacology
and i t s application in s tud y of Chin es e h erbal medicine and
composi te recipe [ J] . Chin J Integrated Tradi t Chin West
Med (中国中西医结合杂志 ) , 1996, 16( 3): 131.
[ 4]　 Cui X L, He Y Z, Gao Y J, et al . Study on a serum-pharma-
colog y m ethod of a Chinese medical formula-1 [J ]. Chin J
Exp Tra dit Med Form (中国实验方剂学杂志 ) , 1998, 4( 2):
13-15.
[ 5]　 Li Y K, Wu J Y. Th e dis cus sion of“ ordinary meth od” of ob-
taining s erum in serum pharmacology m ethod [ J] .Ch in Phar-
macol B ull (中国药理学通报 ) , 1999, 15( 6): 569-570.
[ 6 ]　 Gold berg M P, St rass er U, Dugan L L. N europrotect ive
Agen ts an d Cerebral Ischem ia [M ] . San Dieg o: Academic
Press Limi ted, 1997.
[7 ]　 Koh T Y, Choi D W. Quanti tative determination of glu ta-
mate mediated cortical neu ronal injury in cell culture by lac-
tate deh ydrogenas e ref flux ass ay [ J] . J N eurosci Meth ,
1987, 20: 83-90.
[8 ]　 Han Y, Wu D, Xiao X, et al . Protection agains t ischemic in-
ju ry in primary cul tu red as trocytes of mouse cerebral co rtex
by bis ( 7 )-tacrin e, a nov el an ti-Alzheimer s agent [ J] . N eu-
rosci Let t , 2000, 288( 2): 95-98.
[9 ]　 Wu J F, Wang J, Su D, et al . Nerve grow th factor p revents
apoptosi s induced b y N -methyl-D-aspartate and h ypoxcia /
h ypoglycemia in cultured cereb ral cort ical neu rons [ J ]. Chin
Pharmacol B ull (中国药理学通报 ) , 1999, 15( 1): 80-83.
[10 ]　 Stahl S M . Apop tosi s: Neu ronal death by design [ J ]. J Cl in
Psychiatry , 1997, 58( 5): 183-184.
·146· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 2期 2003年 2月