全 文 ：人参总皂苷对骨髓造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究
王建伟 ,王亚平 ,王莎莉 ,姜　蓉⒇
(重庆医科大学基础医学院 重庆市生物化学与分子药理学重点实验室 ,重庆　 400016)
摘　要: 目的　探讨骨髓造血细胞的冷冻保存效果及人参总皂苷 ( TSPG )降低冷冻损伤的作用。 方法　以 5%二
甲基亚砜 ( DM SO) 为冷冻保护剂 ,采用逐步降温法将骨髓造血细胞在液氮中保存 3～ 5个月 ,复苏后应用台盼蓝
拒染法 、集落形成试验、 CD34+ 及细胞总数回收率等 ,测定骨髓造血细胞生物学活性的变化 ;将不同剂量的 TSPG
与复苏的骨髓造血细胞共培养 ,应用集落形成试验、 M TT比色分析法及流式细胞术等方法检测 TSPG对骨髓造血
细胞冷冻损伤可恢复性的影响。 结果　骨髓造血细胞在低温保存时一部分细胞会失去增殖能力 ,但这种损伤并不
与保存时间成正比。细胞复苏后 ,加入合适剂量的 TSPG ( 25μg /m L ) ,可明显提高冻存骨髓造血细胞的集落产率 ;
TSPG在一定浓度范围内 ( 25～ 50μg /m L) 能促进冻存骨髓造血细胞的增殖 ; TSPG ( 25μg /mL )能促进冻存骨髓
造血细胞进入细胞增殖周期。结论　 TSPG能促进冷冻骨髓造血细胞的复苏、增殖 ,提高骨髓细胞冷冻损伤的可恢
复性 ,对应用冻存骨髓造血细胞进行造血移植有一定意义。
关键词: 人参总皂苷 ;造血细胞 ;冷冻保存
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 04 0420 03
Effect of TSPG on recoverable ability from cryopreservation damage
of human bone marrow hematopoietic stem cells
WANG Jian-w ei , WANG Ya-ping , WANG Sha-li, JIANG Rong
( Basic Medical Co lleg e, Chongqing Univ ersity of Medical Sciences, Chongqing 400016, China )
Abstract: Object　 To study the ef fect o f cryopreserv ation on the abi li ty of hematopoietic stem cells
f rom human bone ma rrow and the action of to tal saponins o f Panax ginseng ( TSPG) to reduce thei r f reez-
ing injury. Methods　 Gradual cooling methods w ere used to place mononuclear cells ( MN C) in liquid ni-
trog en w ith 5% dimethylsulfoxide ( DM SO) for 3— 5 months. Af ter thaw ed, the bio logical properties of
MN C were moni to red, w hich included the mean trypan blue exclusion rate and the mean recovery ra te of
MN C, CFU-Mix , CD34
+
cell, a nd to tal cells; Thaw ed MN C were cultured wi th various concentra tions of
T SPG, the ef fect of TSPG on the recoverable ability f rom cryopreserv ation damage w ere detected by
colony-fo rming assay, co lorimetric M T T assay for cell prolifera tion and f low cy tometry. Results　 A frac-
tion of MN C lost thei r prolifera to ry abi li ty af ter thaw ed, but the damage w as not deteriorated w ith f reez-
ing time. TSPG ( 25μg /mL) could raise the colony production ra te of thaw ed hematopoietic stem cells;
T SPG ( 25— 50μg /mL) could raise the co lony production rate o f thaw ed h ema topoietic stem cel ls; TSPG
( 25— 50μg /mL) could improve thei r pro liferation; TSPG ( 25μg /m L) could also promo te the entray of
them into cel l prolifera to ry cycle. Conclusion　 TSPG could induce the proliferation of thaw ed hema to-
poietic stem cells and raise the po st-f reezing recoverable ability of hematopoietic stem cells.
Key words: to tal saponins of Panax ginseng ( TSPG) ; hematopoietic stem cells; cryopreserv ation
　　造血干细胞 ( hematopoietic stem cell, HSC)
移植正广泛用于治疗肿瘤、某些遗传性疾病和免疫
性疾病等。如何将 HSC进行有效的保存与复苏 ,降
低其冷冻损伤 ,这是造血干细胞移植治疗的关键技
术环节之一 ,也是实验血液学研究的热点内容。人参
皂苷是人参中主要的有效成分。 研究表明人参总皂
苷 ( to tal saponins of Panax ginseng, TSPG)是人
参促进血细胞生成的有效成分 [1 ]。 TS PG在体内外
均能刺激造血干细胞和造血祖细胞 ( C FU-GEMM ,
CFU-E, BFU-E, CFU-GM和 CFU-MK) 的增殖
分化。但 TSPG对冻存复苏的造血细胞作用如何尚
未见报道。本研究采用低温生物学技术 ,探讨骨髓造
血细胞在液氮中的冷冻保存效果及 TSPG提高冷
冻复苏造血细胞的增殖能力。
·420· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 35卷第 4期 2004年 4月
⒇ 收稿日期: 2003-09-12基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 38670880) ; 重庆市科委重点攻关课题 (渝科委计 [2000 ]25)作者简介: 王建伟 ( 1968— ) ,女 ,河北省博野县人 ,河北北方学院副教授 ,现在重庆医科大学攻读博士 ,主要从事中药药理与干细胞生物学研究。 Tel: ( 023) 68485050　 E-mail: w angjianw ei88@ sohu. com
1　材料与方法
1. 1　药品与试剂: T SPG重庆中药研究所惠赠 ,纯
度> 95% , IMDM培养液配成 1 mg /mL工作液 ,正
压滤过除菌。RPM I-1640与 IMDM培养基 ( Gibco ,
美国 ) ,聚丙烯低温冷冻管 ( Creiner,德国 ) ,二甲基
亚砜 ( DM SO,美国 ) ,淋巴细胞分离液 (上海试剂二
厂 ) ,马血清 ( HS,军事医学科学院提供 ) ,胎牛血清
( FBS, Sigma ) , CD34
+ 抗体 ( Santa Cruz,美国 ) ,
CD71+ 抗体 (中山生物试剂公司 ) , SCF、 IL-3、 GM-
CSF (军事医学科学院提供 ,终浓度分别为 100, 2,
50 ng /mL) , Epo ( Amgen公司 ,终浓度 2 U /mL)。
1. 2　骨髓造血细胞制备:取胸外科无血液疾病患者
切除的肋骨骨髓 ,涂片检查无造血系统疾病 ,淋巴细
胞分离液 ( Fico ll,相对密度 1. 077)分离单个核细
胞 ( MNC) ,过 4号针头 ,制成所需浓度 MNC悬液。
1. 3　 MNC的冷冻保存:冻存时临时配制冷冻保护液
(其中 DM SO及 FBS终浓度分别为 5% 及 20% )。
将 MNC ( 1× 107～ 5× 107 /mL) 加入到冷冻管 ,再加
等体积冷冻保护液。体系配制后在 4℃ 冰箱中平衡
30 min,依次转入 - 20℃ 冰箱、液氮冻存罐中的气
相空间 30 min,最后投入液氮 ( - 196℃ )中保存。
1. 4　 MNC的融冻与复苏:分别将冻存 3, 4, 5个月
的 MNC从液氮中取出 ,迅速置于 40℃ 水浴中复
温至全部融化 (约 2. 5 min ) , 用含 10% FBS的
IMDM 培养液缓慢稀释 10倍 ,进行 MNC和
CD34
+ 细胞计数及台盼蓝染色 , 1 500 r /min离心
10 min,弃上清液 ,用 IMDM洗 2次 ,加入含 10%
FBS的 IMDM培养液 ,制成所需浓度的 MNC悬
液 ,待测其他指标。
1. 5　 MNC的冷冻保存效果观察
1. 5. 1　 MNC计数: 在低倍镜下计数 MNC,计算
MNC的回收率。
MN C回收率 = 每管冻存后 MNC 总数 /每管冻存前
MNC总数× 100%
1. 5. 2　台盼蓝拒染试验计数: 0. 4% 台盼蓝生理盐
水溶液 9滴加细胞悬液 1滴 ,混匀 , 2 min后在显微
镜下计数 MNC拒染台盼蓝的存活细胞率。
1. 5. 3　早期髓系造血细胞集落 ( C FU-Mix )培养:
甲基纤维素体系中含 30% HS, 10%牛血清白蛋白 ,
SCF, IL-3, GM-CSF, Epo及 1× 106 /m L冻存前、后
骨髓 MNC, IMDM和 0. 9%甲基纤维素 ,每孔 0. 2
m L (含 MNC 2× 105 ) ,复种 3～ 5孔。培养 14 d计
数每孔 CFU-Mix数 ,每例取 3个孔集落的均数 ,计
算 CFU-Mix的回收率。
CFU-Mix回收率= 冻后 C FU-Mix 数 /冻前 CFU-Mix
数× 100%
1. 5. 4　 CD34+ 细胞计数: 将冷冻复苏前、后的
MNC悬液离心涂片 ,经 4%多聚甲醛固定及 PBS
冲洗后按 CD34+ 抗体试剂盒说明进行操作 ,苏木精
复染 ,高倍镜计数 2× 103个 MNC中所含 CD34+ 细
胞数 ,计算其回收率。
CD34+ 细胞回收率= 冻后 CD34+ 细胞数 /冻前 CD34+
细胞数× 100%
1. 6　 T SPG对 MNC冷冻可恢复性研究:将保存 5
个月的 MNC作为研究对象 ,进行以下实验。
1. 6. 1　 CFU-Mix培养:方法同 1. 5. 3项 ,实验组加
入不同剂量 TSPG ( 5～ 50μg /mL) ,对照组加等量
IMDM培养液 ,观察不同剂量 TSPG对冻存复苏
MNC的祖细胞集落形成的影响。
1. 6. 2　 TSPG对冻存 MNC增殖的影响:将复苏的
MNC ( 5× 105 /m L)单细胞悬液 100μL和等量的
不同稀释度的 TSPG ( 5～ 50μg /mL)加入 96孔细
胞培养板 ,每个稀释度设 4个复孔 ,对照组加细胞
悬液及等量培养基。培养 24 h ,加入 M TT ( 20μL /
孔 ) ,继续培养 8 h, 500×g离心 15 min,弃上清液 ,
加 DMSO 200μL /孔 ,待甲 颗粒充分溶解后 ,以自
动酶标读数仪 ( Bio-Rad E2550型 ,λ= 570 nm ) 测
定各孔吸光度 ( A )值 ,借以反映 TSPG对冻存复苏
MNC增殖的影响。 同样实验重复 3次。
1. 6. 3　细胞周期测定:复苏的 MNC ( 5× 105 /mL)
接种于含 10% FBS的 IMDM培养液中 ,加药组加
TSPG (终浓度 25μg /mL) ,对照组加等量 IMDM
培养液 ,培养 24 h, 0. 01 mo l /L PBS洗 2次 , 70%
冷乙醇固定。 碘化丙啶染色 ,流式细胞仪 FACS
Vantage ( Becton Dickinson Immunocy tometry Sys-
tem ,美国 )分析 ,每个样本测定 1× 104个细胞。数据
经计算机分析得出细胞周期各时相细胞数比例。
1. 7　数据处理:数据均用 x± s表示 ,采用 t检验。
2　结果
2. 1　冻存时间对 MNC活力的影响: M NC分别保
存 3, 4, 5个月后复苏 , MN C回收率、台盼蓝拒染
率、 CFU-Mix 回收率及 CD34+ 细胞回收率随保存
时间的延长有所下降 ,但差别不显著 ,见表 1。
2. 2　 TSPG对 MNC冷冻可恢复性研究
2. 2. 1　 TSPG对冻存 MNC CFU-Mix形成的影响:
实验表明 5～ 50μg /mL T SPG均可增加冻存 MNC
CFU-Mix产率 ,以 TSPG 25μg /mL组效果最显著 ,
见表 2 (以 2× 105 MNC形成 CFU-Mix个数表示 )。
·421·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 35卷第 4期 2004年 4月
表 1　冻存不同时间骨髓 MNC活性的变化 ( x± s , n= 8)
Table 1　 Change of MNC viabilit y af ter cryopreservated
for 3, 4, or 5 months (x± s, n= 8)
冻存
时间
M NC回收率
/%
台盼蓝拒染率
/%
CFU-Mix回收率
/%
CD34+ 细胞回收率
/%
3个月 97. 19±3. 07 86. 23±2. 55 66. 33±5. 04 90. 08± 4. 58
4个月 96. 32±4. 11 85. 17±3. 21 64. 01±4. 96 90. 02± 5. 52
5个月 94. 21±4. 28 83. 58±3. 62 63. 39±3. 57 89. 23± 4. 49
2. 2. 2　 TSPG对冻存 MNC增殖的影响: TSPG在
一定浓度范围内 ( 25～ 50μg /mL) 能促进冻存
MNC的增殖 ,见表 2。
表 2　 TSPG对冻存 5个月的 MNC形成 CFU-Mix
能力及其增殖的影响 (x± s , n= 8)
Table 2　 Ef fect of TSPG on format ion of CFU-Mix
and its proliferat ion of MNC cryopreser-
vated for 5 months (x± s, n= 8)
组　别 浓度 /(μg· mL- 1) CFU-Mix /个 A值
对照 0 　 73. 80± 6. 723 0. 355± 0. 021
TSPG 5 85. 40± 7. 910* 0. 374± 0. 009
10 96. 40± 10. 46* 0. 373± 0. 020
25 121. 4± 11. 22* * 0. 395± 0. 024*
35 104. 6± 8. 452* * 0. 390± 0. 027*
50 88. 80± 6. 790* 0. 387± 0. 005*
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs control group
2. 2. 3　 TSPG对冻存复苏 MNC增殖周期的影响:
经 TSPG刺激后 ,冻存复苏的 MNC处于相对静止
时相 ( G0 /G1期 )的比例减少 ,处于 S期的细胞比例
增多 ,与对照组相比差异显著 ( P < 0. 05) ,见表 3,
提示 TSPG能促进冻存复苏 MNC进入增殖周期。
表 3　 TSPG对冻存复苏 MNC细胞周期
分布的影响 (x± s, n= 8)
Table 3　 Effect of TSPG on distr ibution of cell
cycle of MNC (x± s , n= 8)
组　别 细胞周期分布 /%
G0 / G1 G2 /M S G2 / G1
对照 82. 59±3. 636 3. 323± 1. 142 14. 08± 2. 538 2. 007± 0. 115
TSPG 80. 87±4. 186 3. 830± 1. 425 15. 30± 2. 932* 1. 997± 0. 006
　　与对照组比较: * P < 0. 05
　　* P < 0. 05 vs cont ro l g roup
3　讨论
　　 DMSO是最常用的细胞冻存保护剂 ,具有快速
透过细胞膜、防止细胞内冰晶形成的特性。经典的造
血细胞冷冻方法以 10% DMSO作为细胞保护剂 ,但
由于 DMSO有一定毒性 ,降低冷冻保存液中 DM-
SO比例对冷冻后的复苏有重要意义。 Zhao等 [2 ]对
人胎儿肝脏 CD34+ 细胞的冷冻复苏研究发现 ,用
Dulbecco s代替 Iscove s培养基 , DM SO的需要量
可低于 10% ; Abrahamsen等 [3 ]研究表明 5% DM-
SO比 10% DMSO更能有效保存 CD34+细胞。本研
究以 5% DMSO作为冷冻保护剂 ,将骨髓造血细胞
在液氮中保存 3～ 5个月后 ,其 MNC回收率、台盼
蓝拒染率、 CD34+细胞回收率均大于 80% ,造血祖细
胞恢复率也大于 60% ,结果与文献报道一致 ,故建议
在临床应用中可采用 5% DM SO冻存造血祖细胞。
造血细胞冷冻损伤发生在冷冻和复温过程中 ,
与保存时间不成正比。 实验证实: 低温冻存长达
10～ 15年之久的脐血 ,其 CFU-GM 损失不超过
10%
[4 ]。 Kobylka比较了冻存 2～ 8周和 15年的脐
血 ,发现冻存 15年的脐血 MNC回收率仍可达
80% ( 64%～ 92% ) ,集落形成能力未见明显下
降 [5 ]。本实验观察冻存 3, 4, 5个月的 MNC,有一部
分细胞会受到冷冻损伤而失去增殖能力 ,但这种损
伤并不与保存时间成正比。
在探索理想的造血干细胞冷冻保存与复苏方法
的同时 ,如何提高复苏细胞的冷冻损伤可恢复性的
研究也是不容忽视的 ,但相关文献报道甚少 [6 ]。既往
研究发现 , TSPG能明显促进造血干 /祖细胞的增殖
与分化。因此推测 , TSPG也能促进冻存复苏的
MNC增殖 ,进而提高其冷冻损伤可恢复性。本实验
结果表明 TSPG可增加冻存造血细胞集落产率 ,提
示其能使部分受损的冻存造血祖细胞的生物学活性
得以快速恢复;一定浓度 ( 25～ 50μg /mL)的 TSPG
能够促进冻存 MNC的增殖 ;经 TSPG刺激后 ,处于
S时相的 MNC比例高于对照组 ,提示 TSPG能促进
冻存 MNC从相对静止时相 ( G0 /G1期 )进入细胞增
殖活跃时相 ,从而促进其增殖。但 TSPG的具体作用
机制尚待进一步探讨。此研究结果对造血干细胞移植
的临床治疗提供了有价值的实验依据。
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·422· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 35卷第 4期 2004年 4月