全 文 ：其芦荟素显色反应都位于维管束的大型薄壁细胞
内 ,后者是芦荟素的主要贮存场所 [7 ]。
我们对木立芦荟不同叶龄叶的比较解剖观察结
果表明 ,它们都由表皮、同化组织、储水组织和维管
束构成 ,其主要区别是维管束中大型薄壁细胞的大
小不同。植株上部的幼叶和成熟叶的维管束中 ,大型
薄壁细胞体积大 ;而植株下部老叶的维管束 ,其大型
薄壁细胞已萎缩 ,细胞体积小。 因此 ,大型薄壁细胞
占维管束横切面的百分比从上到下随着叶龄的增大
而减少。高效液相色谱测定结果表明 ,在同一株植物
中 ,木立芦荟从上到下随着叶龄的增大 ,其芦荟素的
含量逐渐降低。上述结果与 Chauser等对木立芦荟
和海莱芦荟 A . hereroensis的研究结果一致 [9～ 10 ] ,
也与沈宗根等对中华芦荟的研究结果相同 [ 7] ,沈宗
根等的研究结果还指出 ,中华芦荟植株从上而下不
同叶龄的叶中 ,其维管束的密度幼叶高 ,老叶低。结
合我们对木立芦荟同株上自上而下 13片叶结构的
比较解剖研究结果分析 ,木立芦荟从上到下不同叶
龄叶内芦荟素含量逐渐降低的原因可能与其贮存芦
荟素的结构—— 韧皮部内大型薄壁细胞 (也称芦荟
素细胞 )逐渐萎缩变小 ,以及单位面积内维管束数
量逐渐减少 ,从而芦荟素的贮存总面积减少有密切
关系。 关于黄海鸥在其书中叙述的芦荟从上到下随
叶龄增大芦荟素的含量的逐渐增高 [11 ] ,未见其文献
引证和原因分析 ,难以令人置信。根据以上研究结果
分析 ,木立芦荟植株上部的幼叶虽然芦荟素含量高 ,
但叶片小 ,总生物产量少 ,而下部老叶则芦荟素含量
低。因此 ,中部的成熟叶芦荟素含量较高 ,生物产量
大 ,为最佳采收部位。
致谢:芦荟素含量的测定是在孙文基教授的指
导下 ,由尚平工程师协助在西北大学生物医药省重
点实验室完成的 ,并得到李多伟副教授的帮助。
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四川麦冬自然居群间 RAPD分析
徐　柯 ,郑　鸣 ,曹　毅 ,蒋　彦 ,乔代蓉
(四川大学生命科学院 ,四川 成都　 610064)
摘　要: 目的　研究百合科植物麦冬 Ophiopogon japonicus及其同属植物沿阶草 O . bodinieri四川所产 10个居群
间的遗传多样性。方法　以 40个 10碱基随机引物进行 RAPD分析。结果　 11个有效引物扩增获得 515条 DNA
带 ,通过聚类分析 ,构建 DN A分子系统树图 ,确定了麦冬及沿阶草的居群及种间亲缘关系。 结论　 ( 1)供试样品间
遗传差异明显。具有丰富的遗传多样性 ,但是其遗传差异与地理分布联系并不紧密 ,而与形态差异联系较紧 ; ( 2)麦
冬与沿阶草之间存在着较大的遗传差异 ,亲缘关系较远。
关键词: 麦冬 ;沿阶草 ;遗传多样性 ; RAPD;聚类分析。
·648· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
收稿日期: 2001-06-11
基金项目:四川省重点项目
作者简介:徐　柯 ( 1979-) ,男 ,重庆市垫江县人 ,硕士 (在读 ) , 1996～ 2000年就读于四川大学生物系生物学基地班 ,毕业后在四川大学生
命科学院攻读硕士至今 ,攻读专业方向为微生物遗传 ,主要从事中药分子遗传学研究。 Tel: 028-85412842　　 E-mail: x k311
@ 263. net; xk 311@ sina. com
* 通讯作者
中图分类号: R282. 710. 03　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 07 0648 05
RAPD on natural populations inOphiopogon japonicus in Sichuan Province
XU Ke, ZHENG Ming , CAO Yi, JIAN G Yan, QIAO Dai-rong
　　 ( Co lleg e of Life Sciences, Sichuan Univ e rsity , Chengdu 610064, China )
Abstract: Object　 To assess th e genetic div ersi ty among ten na tural populations inOphiopogon japon-
icus ( L. f. ) Ker-Gaw l. and O. bodinieri Levl. ( Li liaceae) in Sichuan Province. Methods　 Fo rty random
decamer primers w ere screened for Random Ampli fied Polymophic DN A ( RAPD) f ragments. Results　
Based on cluster analy sis of 515 DN A bands amplified by 11 primers, a DN A molecular dendrog ram was
established, and the relationship of the populations and seeds between O. japonicus and O. bodinieri was
set up. Conclusion　 1. Distinct g enetic dif ferences and ex tensiv e genetic div ersi ty are presented among the
samples. The genetic dif ferences are related to morpho logical di fferences, but no t to geog raphic reg ions;
2. Qui te g enetic dif ferences are presented betw eenO. japonicus andO. bodinieri , i t suggests that they have
farther relationships.
Key words: Ophiopogon japonicus ( L. f. ) Ker-Gaw l. ; Ophiopogon bodinieri Lé v l. ; genetic div ersity;
RAPD; cluster analysis
　　麦冬 Ophiopogon japonicus ( L. f. ) Ker-Gaw l.
为百合科沿阶草属多年生草本 ,我国许多地区均有
分布。 主产于四川、浙江、湖北等地 ,具有养阴生津 ,
润肺清心的功能 ,是清热止咳的主要药物。 沿阶草
O. bodinieri Lé v l. 的块根亦是中药麦冬的来源之
一。由于其品种繁多 ,产地不同 ,有效成分不一 ,且无
有效成分标识 ,难以用传统方法进行道地性鉴定与
分类。
RAPD ( Random Ampli fied Polymo rphic
DN A) 是 90年代发展起来的分子标记技术 [ 2, 3] ,它
通过分析遗传物质 DNA经 PCR扩增后的多态性
来诊断生物内基因排布与外在形状表现规律 ,具有
灵敏性高 ,不受环境、发育数量形状遗传的影响的优
点 ,能客观地揭示供试材料间 DNA差异 ,且技术操
作简便、快速、省时、省力 [4～ 8 ]。 本研究利用 RAPD
技术 ,主要以四川产麦冬为研究对象 ,从分子水平分
析其居群间差异 ,物种遗传变异性和亲缘关系 ,为进
一步研究其有效成分含量与 DNA遗传标识对应关
系 ,建立一套完整实用的道地川产麦冬的分子鉴定
方法打下了基础。
1　材料和方法
1. 1　材料:研究包括四川境内各地所产麦冬及沿阶
草共 10个自然居群 (表 1)。
1. 2　方法
1. 2. 1　基因组 DNA的提取和检测: 采用 QIA-
GEN公司 Dneasy Plant Mini Ki t提取 , 0. 7% 的琼
脂糖凝胶电脉 ,经 EB (溴化乙锭 )染色后 ,在紫外
检测仪上观察其纯度并判别 DNA分子的大小及一
致性。
表 1　供试材料
序 号 种 类 来 源
1 沿阶草 Ophiopogon bodinieri 成都龙泉驿
2
　
麦冬 O. japonicus ( L. f. ) Ker-
Gawl. (小叶型 )
成都四川大学望江校区
　
3 麦冬 (大叶型 ) 成都四川大学望江校区
4 麦冬 四川大学华西校区
5 麦冬 成都中医药大学
6 麦冬 绵阳
7 麦冬 自贡
8 麦冬 峨嵋
9 连药沿阶草 O. bock ianus Diels 峨嵋
10 沿阶草 峨嵋
1. 2. 2　基因组 DNA的扩增: 所用 DNA扩增仪为
Fero Tec公司 TC-25 /H型扩增仪。所用随机引物为
Operon公司生产的 A, B两组共 40个引物 (表 2)。
PCR反应总体积为 25μL。其组成如下: 10× Buf fer
2. 5μL (含 500 mmol /L KCl , 100 mmol /L Tris-
HCl pH 8. 3, 15 mmol /L MgCl2 , 0. 1% 明 胶 )
dN T P 2. 5μL ( 1. 25 mmol /L ) ,基因组 DNA 1μL
(约 25 mg /L) , Taq聚合酶 2μL ( 1 U /μL) ,随机引
物 2μL, ddH2O 15μL。扩增程序:预变性 94℃ 3
min;然后每个循环: 94℃ 15 s, 36℃ 30 s, 72℃ 1
min, 45个循环后 ,于 72℃ 继续延伸 7 min。
1. 2. 3　引物筛选及 DNA多态性分析:用 1. 4% 琼
脂糖凝胶电泳分离基因组 DNA的扩增产物 ,
4 V /cm稳压电泳 , 0. 5 mg /L EB染色后在紫外检
测仪上观察扩增的多态性并记录 ,然后照相 (图 1)。
·649·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
“M”为 PCR分子标记 DL2000;“ 0”为不加 DN A模板的阴性对照 ;样品编号与表 1相同。
图 1　 11种有效引物的 PCR扩增图谱
1. 2. 4　数据的统计分析:按琼脂糖凝胶同一位置上
DNA带的有无进行统计 ,有带 (包括弱带 ) 记为
“ 1” ,无带记为 “ 0”。利用 Watson等 ( 1966)系数计
算出各物种 之间的遗传 距离 D = ( b+ c ) /
( 2a+ b+ c) ( a为两样品共有的带 , b、 c为两样品各
自的特异带 ) (表 3) ,再用最短距离法对其进行聚类
分析 ,并构建 DNA分子系统树图 (图 2) [1, 9, 10 ]。
2　结果及分析
2. 1　引物的筛选: 从 40个 10 bp随机引物中筛选
出了 11个有差异带的有效引物 (即在全部 10个样
品的基因组 DNA中均扩增出 DNA片段的引物 )
A15, 17, 19; B6, 7, 8, 10, 11, 18, 19, 20。这 11个有效
引物共扩增出 515条 DNA (图 1) ,其中 475条表
现出多态性 ,占总带数的 92. 23% ,平均每个引物扩
增出的多态带为 43. 18条。这表明麦冬及沿阶草种
间具有很高的多态性 ,遗传变异很大。
2. 2　聚类分析: 首先根据 Watson等 ( 1966年 ) 距
离系数 D= ( b+ c) /( 2a+ b+ c)计算得到 10个种
·650· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
间的遗传距离矩阵 (表 3)。遗传距离越大 ,种间亲缘
关系也就越远。
图 2　 10个自然居群的麦冬和沿阶草
分子系统树图 RAPD
在表 3的基础上 ,以最短距离法进行聚类 ,得出
10个种的 DNA分子系统树图 (图 2)。
表 2　引物序列
序号 序列 序 号 序列
A01 CAGGCCCT TC B01 GT TTCGCTCC
A02 T GCCGAGCTG B02 TGATCCCTGG
A03 AGTCAGCCAC B03 CA TCCCCCTG
A04 AATCGGGCTG B04 GGACTGGAGT
A05 AGGGGTCTTG B05 T GCGCCCT TC
A06 GGTCCCTGAC B06 T GCTCTGCCC
A07 GAAACGGGTG B07 GG TGACGCAG
A08 GT GACGTAGG B08 GT CCACACGG
A09 GGGT AACGCC B09 T GGGGGACTC
A10 GTGATCGCAG B10 CTGCTGGGAC
A11 CAATCGCCGT B11 GT AGACCCGT
A12 TCGGCGAT AG B12 CCT TGACGCA
A13 CAGCACCCAC B13 TTCCCCCGCT
A14 T CTG TGCTGG B14 TCCGCTCTGG
A15 T TCCGAACCC B15 GGAGGGT GTT
A16 AGCCAGCGAA B16 TT TGCCCGGA
A17 GACCGCT TGT B17 AGGGAACG AG
A18 AGGT GACCGT B18 CCACAGCAGT
A19 CAAACGTCGG B19 ACCCCCGAAG
A20 GT TGCGATCC B20 GGACCCTT AC
表 3　遗传距离矩阵
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0. 000 0
2 0. 395 3 0. 000 0
3 0. 555 6 0. 570 1 0. 000 0
4 0. 368 4 0. 447 5 0. 420 0 0. 000 0
5 0. 451 3 0. 504 6 0. 472 7 0. 592 9 0. 000 0
6 0. 340 4 0. 305 3 0. 567 0 0. 377 4 0. 454 5 0. 000 0
7 0. 337 4 0. 333 3 0. 607 8 0. 504 8 0. 190 6 0. 428 6 0. 000 0
8 0. 272 7 0. 318 7 0. 688 9 0. 536 8 0. 557 9 0. 225 2 0. 241 4 0. 000 0
9 0. 526 3 0. 570 1 0. 603 6 0. 543 8 0. 681 4 0. 580 0 0. 600 0 0. 600 0 0. 000 0
10 0. 504 6 0. 600 0 0. 312 5 0. 651 4 0. 666 7 0. 578 9 0. 603 6 0. 644 4 0. 578 0 0. 000 0
　　从图 2可以看出: 5, 7, 6, 8, 2这几个麦冬居群的
样品包括 1 (成都所采沿阶草 ) 遗传距离较近 ,组成
一大组 ;而 3, 10, 4这几个样品关系较近 ,构成另一
组 ;而 9 (连药沿阶草 )与其它种关系均较远。除样 1
(成都所采沿阶草 )与样 10 (峨嵋所采沿阶草 )外 ,
从分组情况看不出其与样品地理分布位置有密切关
系 ,例如: 5 (采自中医药大学的麦冬 ) 与 6 (采自绵
阳的麦冬 )间遗传距离很小 ,而 5与 3同为成都所
采样品 ,相互间遗传距离却很大。但是结合形态学特
征 ,可以看出聚类结果是与它们之间形态差异相关
的。第一组的几个样品均为叶片较小 ,植株较矮 ;而
第二组的几个样品从形态上看基本上都为叶片长
大 ,植株较高。另外 9 (连药沿阶草 )与其他样品间
差异较大 ,也是与它们的形态分类研究结果相一致
的。连药沿阶草其植株具有明显的茎 ,而其它几种植
株的茎均极短而不明显 ,所以尽管样 9与样 8,样
10均为峨嵋所采 ,其遗传差异仍很明显。从另一方面
来看 ,尽管麦冬与沿阶草之间的形态差异很小如 1与
2,但遗传差异却较大 ,用 RAPD可较好地区分。
3　讨论
RAPD分析存在一定限制 ,最大的限制因素就
是稳定性较差。在本研究中 ,我们通过梯度实验确定
了 RAPD反应的最佳条件 ,在此条件下的 RAPD
均较稳定 ,重复性还是相当好的。 特别是 RAPD分
析具有比其它 DNA技术简单易行 ,经济快速等优
点 ,在传统的形态学等分类基础上 ,将会为麦冬的系
统分类进化研究提供丰富资料。
另一方面 ,在进行种间和属间的亲缘关系研究
时 ,也应看到:因不同种或属间的扩增产物难以作同
源性分析 ,只能将带谱转化为数据 ,然后从相似性或
遗传距离上去分析亲缘关系 ,其结果可能与实际的
系统有差异 ,这是我们值得注意的一点。
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植物药材总 DNA提取
李晓波 1, 2 ,冯　波 2 ,张朝晖 3 ,王峥涛 2 ,徐珞珊 2
( 1. 上海交通大学药学院 ,上海　 200030; 2. 中国药科大学中药学院 ,江苏 南京　 210038; 3. 第二军医大学南京军医学院 ,江
苏 南京　 210099)
摘　要:目的　为获得高质量的 DNA,研究木质部较发达的根、根茎类以及茎木类药材的 DN A提取方法。方法　
总 DN A的提取过程包括用 T ris缓冲液洗净、 CT AB抽提和纯化。 结果　对升麻、 木、木香、乌药、芍药和木通等
进行了 DN A提取 ,能较好的去除色素、多糖等干扰 PCR物质。结论　本法使用常用试剂 ,成本低 ,易于推广 ,为药
材 DN A分子鉴别的应用奠定了基础。
关键词: DNA提取 ;中药材 ;升麻
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 07 0652 03
Isolation of total DNA from Plant Chinese medicinal materials
LI Xiao-bo
1, 2
, FEN G Bo
2
, ZHANG Zhao-hui
3
, WANG Zheng-tao
2
, XU Luo-shan
2
( 1. Schoo l o f Pharmacy, Shanghai Jiao tong Univ e rsity , Shanghai 200030, China; 2. College o f Chinese Ma teria Medica ,
China Pharmaceutical Univ ersity, Nanjing 210038, China; 3. Nanjing Milita ry M edical Colleg e,
Second M ilitar y Medical Univ e rsity , Nanjing 210099, China)
Abstract: Object　 To explo re the method for high-quali ty DN A ex tract from plant Chinese medicinal
materials containing developed xylem. Methods　 The process of DN A includes w ash w ith Tris-buf fer, ex-
tract wi th CY AB-buffer and purification mainly. Results　 Using this method, the total DN A was iso lated
f rom Cimicifugae foel ida L. , Arlia chinensis L. , Paeoniae lactif lora Pall. , Aucklandia lappa Decne. , Lin-
dera aggregata ( Slms) Ko stern. , a nd Akebia quinata Decne. etc. This method is preferable in removing
pigments, po lysaccharides, substance disturbing PCR. Conclusion　 In this pro cess, common reagents are
used, low er co st is of advantag e to popularize. This study provids the applying foundations for the DN A i-
denti fica tion of plant Chinese medicinal materials.
Key words: DN A ex tract; plant Chinese medicinal materials; Cim icif ugae foel ida L.
　　 DNA分子鉴别的第一步就是要获得高质量的
可作为 PCR模板的 DNA。药材不同于新鲜的动植
物材料 ,药材的干燥、加工、贮藏等过程均造成了
DNA不同程度的降解 ;同时药材中的蛋白质、多糖
以及多酚类化合物等都是影响 PCR成败的因素。
因此 ,针对不同药材采用不同的 DNA提取方法才
·652· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
收稿日期: 2001-11-06
基金项目:中国博士后科学基金 ( 1998年 )
作者简介:李晓波 ( 1963-) ,女 ,回族 ,博士 , 1991～ 1998年赴日留学攻读学位 ,主要从事生药学 ,分子生物学研究。 Tel: ( 021) 62933467
E-mai l: xbli@ mai l. sj tu. edu. cn