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Analysis of alkaloids by high performance capillary electrophoresis

高效毛细管电泳技术用于生物碱的分析



全 文 :中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年】2月·1889·
·专论与综述·
高效毛细管电泳技术用于生物碱的分析
张蕊,郭宝林+
(中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京100038)
摘要:综述了高效毛细管电泳用于生物碱类化合物的应用情况。介绍了毛细管区带电泳(CZE)和媵束电动毛细
管色谱(MECC或MEKC)2种模式应用于生物碱类化食物时各自特点和应用范围,分析了影响生物碱类成分分离
的主要因素,阐述了如何根据待分离化合物的特性建立并优化方法,还介绍了实验中存在的一些技术问题。
关键词:高效毛细管电泳}生物碱;毛细管区带电泳f胶束电动毛细管色谱
中豳分类号:R286.02 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2005)12—1889—04
Analysisofalkaloidsbyhighperformancec pillaryIectrophoresis
ZHANGRui,GU0Bao—lin
(InstituteofMedicinalPl nt,ChineseAcad myofMedicalSciencesandPekingUnion
MedicalCo lege,Beijiag100094,China)
Keywords:highperformancec pillaryelectrophoresis(HPCE);alkaloids;capillaryzonelectro—
phoresis(CZE);micellarelectrokineticcapillaryhromatography(MECC)
毛细管电泳又称高效毛细管电泳(HPCE),是一类以毛细
管为分离通道的电泳技术,主要依据样品各组分之间淌度(单
位电场下的电泳速度)的差异而实现分离。此项技术突出的特
点是应用范围广,不仅应用于生物大分子(肽、蛋白质、低聚核
苷酸和DNA片断等)的分析,而且也可应用于无机离子和一般
有机化合物的分离,如生物碱类、黄酮类、蒽醌类、有机酸类、香
豆素类及皂苷类等;此外,还可有效地分析手性化台物。
生物碱是一类具有多种生理活性的重要天然产物,目前
已发现超过10000种不同结构的该类化合物。其分析方法
目前主要是高效液相色谱法,但是组成复杂的样品如植物提
取物.容易造成色谱柱的污染,常需要进行复杂的前处理,有
时难以在较短时间内使各种组分达到有效分离;另外生物碱
中的一Ⅳ一基可与填料上的残余一SiOH基结合而造成峰拖尾,
使分离度变差。而HPCE分离效率高,是以毛细管为通道进
行分离,容易清洗,不存在污染问题,同时对样品预处理要求
低,而且HPCE进样体积小,一般为纳升级,使用样本量少}
另外,化学试剂用量少、价廉,也降低了分析成本,因此适用
于广泛的样本。HPCE方法本身需要分析带有一定电荷的物
质,而生物碱在结构上以含有氮原子为特点,氮原子上的孤
电子对能接受质子而显碱性,常携带正电荷,所以十分适用
于HPCE的分析。迄今报道的天然产物的HPCE的分析研
究中.也以生物碱类化合物为多。
HPCE具有十分多样的分离模式,生物碱类成分同其他
天然的次生代谢产物一样一般采用毛细管区带电泳(capil
laryzoneelectrophoresls,CZE)和胶束电动毛细管色谱(mi—
cellarelectrokineticcapillaryhromatography,MECC)两种
分离模式。
1 CZE和MECC分离原理简介
I.1 毛细管区带电泳:HPcE中最简单的、应用最广泛的一
种方式,毛细管内只充人缓冲溶液,分离过程中电渗流由毛
细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动起着主导
作用。由于常用的石英毛细管产生的电渗流方向是从正极指
向负极,一组化合物中,迁移方向与电渗流同向的阳离子迁
移最快,中性物质居中,而阴离子则因为其迁移方向与电渗
流反向而速度最慢。被分析物中各化合物带电荷数差别越
大,相对分子质量的差别越大,分离度越大,但所有的中性物
质彼此不能分离。
1.2胶柬电动毛细管色谱(MEcc或MEKC):结合了电泳
技术与色谱技术.也是HPCE中应用最广的方式之一。MECC
是唯一的既能分离中性组分又能分离带电组分的电泳技术。
其原理是在缓冲溶液中加人表面活性剂,如果表面活性剂的
浓度足够大,则表面活性剂单体就结合在一起,即长链疏水基
通过分子间的引力互相缔台在一起.亲水基朝向外,形成了一
个球体,称为胶柬。“足够大浓度”就是胶束的临界浓度。所有
的阴离子和阳离子表面括性剂形成胶柬后带电荷,前者带负
电荷,后者带正电荷。如常用的十二烷基硫酸钠为阴离子表面
活性剂,在电场作用下,其胶束的迁移方向与电渗流的方向相
反。但在中性和碱性条件下,电渗流的移动比胶束的迁移快,
器霎品羿潆05-蕊05(-129078),女,北京人,中国协和医科大学药用植物研究所研究生。T。l:62899732E州iI=血。h。。@126com
*通讯作者 郭宝林Tel;(010)62899732Email:guohoIinolo@yaho。COIncn
万方数据
·1890· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
这就迫使胶束最终以低于电渗流的速度较慢地向阴极移动。
在缓冲液中添加的表面活性剂具有吸附、增溶、形成胶束等功
能,因此增加了该模式分离化合物的范围。
在MECC系统中,存在着类似于色谱的两相,一是流动
的水相,另一是起到相对固定作用的胶柬相.溶质在这两相
之间分配,因为各组分在胶束中拥有不同的保留能力会产生
不同的保留值,从而将组分分离。中性组分是依据本身疏水
性的不同而达到分离的,在含阴离子表面活性剂的缓冲系统
中.其疏水性越强,与胶束间作用力就越强,留在胶束相中的
时间就越长,则迁移时间越长,反之越短。如果使用阳离子表
面活性剂,情况与上述相反。
2生物碱的HPCE分析
2.1分离模式的选择
2.1.1CZE模式:用于带电荷物质的分析,这些物质在一定
pH值的缓冲溶液中会发生质子化一去质子化作用和络合作
用,从而带有不同的净电荷数.进而以不同的迁移时间而分
离。在此模式下,对分离结果产生影响的最根本的两个因素是
电荷数和相对分子质量,而这二者中叉以电荷数更为重要。
通常情况下,质子化程度高的强碱性物质会先被检测
到、随后是中等碱性的物质,最后是弱碱性的物质。被分离的
生物碱成分如果具有较大的碱性差别很容易分离。季一
兵“]、陈永川嘲均用不同的缓冲条件很好地分离了麻黄中的
一级胺(去甲基麻黄碱)、二级胺(麻黄碱)、三级胺(甲基麻黄
碱);王桂芳等01分析了苦参中的苦参碱和氧化苦参碱,后者
的氮原子上有氧原子从而使电子云密度改变,二者的分离度
大于1.5。
除了与氮原子直接连接的基团影响生物碱带电荷数(碱性
强弱)外.其他因素还有:分子空间结构、缓冲溶液的pH值。
有些情况下,因为空问位阻、亲水性的差别。化舍物的分
子结构中不同的功能基会对氦原子的质子化程度产生影响,
从而改变物质电荷数;或者分子特定的几何结构使得其易与
缓冲液溶剂分子发生作用,从而改变自身电荷数,Jing等“1
分离了槐果碱(sophocarpine)和lehmannnine,二者的差别只
是驭键的位置不同,槐果碱中有a,D共轭酮结构,而lehmarl
nine的双键不形成共轭,于是二者具有不同的原子空间排
列,不同的分子形状,使得它们在缓冲液中的电荷数产生差
别而达到分离。
缓冲溶液的pH值一方面影响溶质组分的电离度,即影
响电荷数的多少;另一方面影响电渗流的大小,结果导致迁移
时间的变化”],所以是影响分离结果的关键因素。理论上说,
选择的缓冲液pH值为化台物的pKa士1。实际操作中发现,
由于pH值除控制化合物的有效淌度外,还影响着电渗甚至
化合物在管壁上的吸附水平,合适的pH值难蹦用公式计算,
就需要通过实验的摸索来选择最佳pH值。值得注意的是,石
英毛细管的化学稳定性高,可使用的pH范围在2~12。
Bo等01在分析阿托品和东莨菪碱时.为了选择最佳的
缓冲液pH值,首先用50ramol/L的磷酸盐缓冲液在不同的
pH值(6~9)下试验,结果显示pH值在6~8内.由于电渗
流加大。阿托品和东莨菪碱的迁移时间随pH的增加而缩
短IpH8~9时.二者的迁移时间又加大,原因是在高pH下.
尽管电渗流会增加,但是氮原子会发生低质予化作用从而导
致分析物的低迁移率。迁移时间过长会导致峰形变宽,在考
虑了分离度、峰形和分析时间后选定了pH为8,二者分别在
4.5和5.3min出峰。Ji等”3在分析小檗碱、巴马亭和药根碱
时采用了磷酸盐缓冲液,确定最佳pH值时发现在pH>7.5
和pHi6.5时均不能达到满意的分离度,而在pH7时完全
分离。陈亚飞等叫在分析复方石韦片中的槐果碱和苦参碱
(均为弱碱)时,曾选用过pH5.5和6.0,分离度均欠佳.后
采用pH5.75的缓冲液,可以达到良好的分离并同时改善了
峰形。袁炜等”1在分析槟榔中的槟榔碱(arecoline)和槟榔次
碱(arecaidine)时,由于二者在结构上的差异仅为氮原子间
位上的取代基不同,当pH在2~4时,槟榔次碱上的羧基的
电离倾向加大,其有效电荷呈减小趋势,因此迁移时间增大,
而槟榔次碱中酯基相对稳定.迁移时间略微增大但变化不
大,于是两样品分离度增加;当pH值增到4时,电渗流加
大,二者的迁移时间均缩短,分离度不再增加,此外发现两组
分的柱教与各自迁移时间的变化趋势相类似。所以选定pH
为3,2。总之,缓冲液的pH值是分离成败的关键因素。
由于影响电泳速度的因素为各组分的荷质比,如果电荷
数相同或相近,可因相对分子质量差别而分离,但待分离组
分相对分子质量的绝对差值相对于相对分子质量的比值(即
相对分子质量的相对差)要足够大才可达到分离。到目前为
止研究的生物碱类物质的相对分子质量范围是150~700。
如果带电荷数相同、结构类似、被分析的各组分的相对分子
质量又均在700以上,那么当相对分子质量绝对差别小于
50时,用CZE模式很难分离,应考虑选用MECC模式。
用一个具体的例子来说明各因素在CZE模式下对电泳
淌度、分离度的影响。Stockigt等““对15种吲哚类生物碱进
行了毛细管电泳分析,缓冲液条件是0.1mol/L醋酸铵(pH
3.1)一乙腈为lt 1,出峰顺序是禾碱(gramine,相对分子质量
174)。色胺(tryptanmine,160),蛇根碱(serpentine,348),鸭
脚木碱(alstonine,348),13-methylajmMine(341),柳叶水甘草
碱(tabersonine,336),长春碱(vinblastine,810),柯楠碱
(corynanthine,354),长春新碱(vineristine,824),rauflori
dine(382),阿马灵(ajmaline,326),yohimhinieacid(340),去
甲氧利血平(deserpidine,578),利血平(reserpine,608),萝美
木碱(rescinnamine,634)。出峰的一般规律是:低相对分子质
量、中等碱性的物质先被检测,如禾碱(属于季铵型生物碱)、
色胺(属于伯胺型生物碱);接着是中等相对分子质量、强碱
性物质,如蛇根碱和鸭脚木碱;再后面是中等相对分子质量、
中等碱性物质,如柯楠碱和raufloridine;最后是高相对分子
质量而弱碱性物质,如利血平和萝美木碱等。
值得注意的是.长春碱和长春新碱是二聚物,拥有相似
的结构,前者的吲哚环上的氮原子取代了甲基,而后者这个
位置氧化成了乙醛基,推测二者的淌度不同是因为长春新碱
的乙醛基上附加了水分子,从而导致了高溶解性和低荷质
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 891·
比}还有柯楠碱和yohimbinicacid,结构类似且相对分子质 碱不易得到满意的分离结果(MECC模式可部分解决水溶
量相差不大,但因为后者结构中C(16)上有部分解离的羧基 性差的问题,但作用有限),而且会导致不同程度的毛细管管
功能团,使得净电荷数少,导致了在分析时间上的较大差距} 壁吸附,甚至堵塞毛细管,可以通过添加有机溶剂来改善。
再有pmethylajmaline和阿马灵,如果假定在选的pH值的可选用 有机溶剂的种类受其对电解质溶解能力和本
缓冲液中完全质子化了,则相对分子质量高的应该比低的拥 身是否具有紫外吸收等因素的限制,常用的有甲醇、乙醇、乙
有较低的电泳淌度,但是口一methylajmaline中,在p咔啉结腈、丙酮、甲酰胺、尿素,其中以甲醇、乙腈、异丙醇使用较多。
构中的}氮原子上有取代的甲基,出现季铵结构,它阻止了 添加量的多少要根据被测物的性质而定,通常在5%~
氮原子与醋酸盐缓冲液中溶剂分子的相互作用,于是溶解度 25%,有时甚至完全采用有机溶剂作为缓冲溶液主体,即非
降低,荷质比增加;蛇根碱和鸭脚木碱,二者是差向异构,反 水毛细管电泳。在MECC模式下,有机溶剂一般在50%03以
式构型的蛇根碱使得分子呈扩展的形式因此降低了摩擦力, 下,否则可能引起胶束解体或造成其他不利影响。添加有机
相对于顺式的鸭脚木碱具有较高的电泳淌度。 溶剂会影响电流的稳定性,所以要使其与缓冲溶液充分混
从这个例子中可以看出,碱性大小在分离中的重要作 匀,也可以通过延长空白对照样品的分析时间来平衡系统。
用,同时也看到了分子结构对称性的影响(如二聚体)、不同 有机溶剂不仅可以对疏水性溶质起增溶作用,还可降低
的功能基团、分子的几何结构等都可能影响碱性,另外分析 电渗流、减小离子迁移速率、提高分离度和选择性,并且有改
物与溶剂分子的相互作用也会导致化台物电泳淌度的变化。 善峰形的作用,所以添加有机溶剂是可以考虑的优化条件之
2.1.2MECC模式:常用的表面活性剂如溴化十六烷基三 一。如纪秀红等“”在分析十大功劳属部分植物茎中生物碱
甲基铵(阳离子型)、十二烷基硫酸钠(SDS)、胆汁酸盐或去时(CZE模式)对缓冲液和甲醇的比例进行了选择:实验表
氧胆汁酸盐(阴离子型)中,用于生物碱分析时多选择SDS。明在2:1~3:4分离良好,甲醇比例再低,峰变宽,出现拖
SDS常用的浓度范围为0.02~0.15mol/L,其中以0.05尾;甲醇比例增大,峰变锐,同时各蜂分离距离加大,分析时
moI/L最常用(临界胶束浓度0.082mmol/L)嘲。间相应延长;甲醇比例再大,由于磷酸盐的溶解度降低,溶液
缓冲溶液的pH值同时影响电渗流、溶质的有效电荷以 变得不稳定。综合考虑的结果是缓冲液与甲醇的比例为2:
及溶质与胶柬的相互作用,常用的pH范围为6~9,过低则 1。陈亚飞”3等分析槐果碱和苦参碱时,考察了不同体积分数
胶束向正极迁移的速度可能超过电渗流,过高可能增大电渗 (0、10%、20%、30%)的异丙醇对出峰时间的影响,大于
流导致溶质还未完全分离就被洗脱出来。 20%时,出峰时间达20min以上;最后选定5%的添加量,lO
在中性或碱性条件下弱碱的溶解度低,有些强碱类物质 rain内出峰且分离度达到1.5。总之,加入有机溶剂产生的效
会与阴离子胶束(如SDS)之间有强烈的电荷作用而延长保果是多方面的,应该通过实验确定添加量。
留时间.对于碱性弱或几乎无碱性的化合物优先选用此模 2.3缓冲溶液的选择:缓冲溶液一般为无机钠盐类,如磷酸
式,如辣椒碱(capsaicin)和嘌呤类生物碱““。当然MECC也盐、硼砂、醋酸盐、碳酸盐等,最常用的是磷酸盐、硼砂、醋酸
可分离强碱性的生物碱,如防己碱、防己诺林碱““。 钠缓冲溶液体系,见表1。磷酸盐的紫外吸收低,pH值缓冲
在已报道过的文献中发现有些生物碱用CZE和MECC范围比较宽,pH=1.5~13较为常用,醋酸氨缓冲液因具有
两种模式均得到了很好的分离,如槐果碱、苦参碱、氧化苦参 挥发性,适于质谱联用技术;硼酸缓冲液适于含羟基或多羟
碱‰¨sj;小檗碱、巴马亭m3;吗啡、可待因、罂粟碱m““、莨 基化合物的分离;使用磷酸一硼砂混合缓冲系统时,尽量使两
菪碱、东莨菪碱m]。 种缓冲液的浓度相近或相等。许多化合物使用不同的缓冲系
2.2水溶性问题:在毛细管电泳分析时,水溶性较差的生物 统可达到良好的分离,但分离时间的长短有所差异。
裹1 HPCE主要应用的缓冲液体系
Table1 ApplledbuffersysteminHPCE
缓冲液类型 常用浓度范围/(mot·L一1)选用的pH值范围 分离对象
里西丁类和1种吲哚类生物碱E4一;乌头碱、次乌头碱、中乌头
碱、士的宁和番本鳖碱m]、雷公藤次碱m]
磷酸盐缓冲液0.02~o08 1.5~13 黄连中的主要生物碱[”]}阿托品、东茛菪碱、山莨菪碱、樟柳
碱[1t]}可待因、吗啡、罂粟碱;浙皿乙素、西贝素、西贝昔。213}苦
参碱、氧化苦参碱}防己碱、防己诺林碱[“]{茶碱、可可碱、咖
啡因Ⅲ3f血根碱、加里福尼碱、前鸦片碱、花菱草碱。23]I氲溴酸
东茛菪碱、溴丁东莨菪碱”“
硼砂缓冲液0.02~o.08 6~9 黄连中的主要生物碱Ⅲ];苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱[3];吗啡、
可待因,罂粟碱l例}月桂木姜碱、樟苍碱、异紫堇啡碱、渡耳定
等g种[26]
磷酸一硼砂混合0.ol~o.03 6~9 吗啡、可待因、罂粟碱等9种生物碱‘“3}吴莱萸碱等9种生物
缓冲系统 碱‘27]}辣椒碱、二氢辣椒碱m1、蓖菪碱、东莨菪碱、后马托品;
奎宁、奎尼丁、辛町宁、辛可尼丁~2“
万方数据
:!!!!: !兰竺!!竺:竺三:!!竺!::!:竺!::!:!!:竺竺!!兰!:!塑!!!!兰!!!
缓冲溶液的离子浓度通常要通过实验优化,不过一般电
导率高的磷酸盐、硼纱缓冲液的浓度可以在0.02~0.04
mol,L的基础上进行优化,一般不大于o.2mol/I一。王桂芳
等“3在分离槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱时.在pH相同的情
况下,摸索不同的硼砂缓冲液浓度.因为电渗流随着浓度的
增大而下降,所以三者的迁移时间都随浓度的增大而延长,
当浓度为o.06m01/L时分离结构和迁移时间最理想。Bo
等嘲在分析阿托品(Atr。pine)和东莨菪碱(sc。plamine)时,在
确定了最佳pH后,又在0.02~O.06m01/L的范围内优化缓
冲渡的浓度,考虑到分离度和分析时间,最后选定了o.05
mol/L的磷酸盐缓冲液,
2.4可优化分离的添加剂:为了得到良好的分离度、对称的
色谱峰,还有一些备选的添加剂。如Yn等“”分析槐果碱和
lehmannlne时,加入1%的HPr}cD时,分离度和峰形都得
到了明显的提高}Bo等分析阿托品和东莨菪碱时加入了
lo%四氢呋喃改善峰形,Song等“3分析10种生物碱时加入
了10%的四氢呋喃提高分离度。麻黄碱和伪麻黄碱是非镜像
异构物,在酸性缓冲液中均带正电无法分离,“u等o“利用
有光学活性的异亮氨酸与之结合,再配合钡离子使之具有不
同的移动速度达到分离}陈永川等“1使用了缬氨酸缓冲液使
=者达到分离。
2.5其他技术问题:在毛细管电泳分析过程中还有一些较
重要的因素会影响分离结果,如电压、温度、进样方式、毛细
管内径大小和毛细管长度。运行的电压主要影响分离度和分
离效率。从目前的统计来看,20、25kV常用,实验时可再根
据具体情况调整;温度多为室温;进样方式多选用压力进样,
主要是重现性和精密度较好;毛细管内径有50和75pm两
种规格,长度在30~80cm,多数情况下50~60cm就足以达
到满意的分离结果。
3结语
HPcE是一种高效、快速的分离、分析技术,不管毛细管
区带电泳还是胶柬电动色谱(MEKc或MEcc)都有其各自
的特点和适用范围,在生物碱测定中存在着巨大的研究潜力。
致谢:承蒙北京走学刘虎教授审改文稿。
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万方数据
高效毛细管电泳技术用于生物碱的分析
作者: 张蕊, 郭宝林, ZHANG Rui, GUO Bao-lin
作者单位: 中国医学科学院,中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100038
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2005,36(12)
被引用次数: 6次

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1. 韩丽君.钱传范 高效毛细管电泳在农药分析中的应用[会议论文]-2003
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6. 许庆平.王蕾.何友昭.XU Qing-ping.WANG Lei.HE You-zhao 毛细管区带电泳富集分离烟草生物碱[期刊论文]-
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9. 赵兴玲.王巍.曹秋娥 测定羟自由基的高效毛细管电泳研究[会议论文]-2006
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3.黄玉芝.房娟娟.李金.闫滨 高效毛细管电泳法测定清胃黄连丸中盐酸小檗碱含量[期刊论文]-中国药业 2011(19)
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5.李俊松.刘训红.蔡宝昌.张月婵.傅兴圣.尹娣 非水毛细管电泳测定黄连饮片中5种生物碱[期刊论文]-色谱
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6.阮磊.王艳红.文汉 高三尖杉酯碱注射液含量的毛细管电泳法测定[期刊论文]-中国农学通报 2008(5)


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