全 文 ：丹参干叶片的 DNA提取
郭宝林 1, 2 ,林 生 1
( 1. 北京中医药大学 ,北京 100029; 2. 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所 ,北京 100094)
摘 要:目的 以丹参干叶片为材料 ,优选一种有效去除多酚类杂质的 DNA提取方法。方法 先用 PVP-40T与材
料共研碎 ,加预冷的提取缓冲液冰置 ,弃去上清液 ,沉淀用加 Vit C粉末 (调 p H= 6～ 6. 5)的 2× CT AB抽提缓冲液
提取。 结果 得到的 DNA可以很好地用于 PCR扩增。 结论 该方法适用于提取含多酚材料的 DN A。
关键词: DNA提取法 ;多酚 ;丹参干叶
中图分类号: R284. 2; R282. 1 文献标识码: B 文章编号: 0253 2670( 2002) 05 0418 03
DNA extraction of dried leaves of Salvia miltiorrhiza
GUO Bao-lin
1, 2
, LIN Sheng
1
( 1. Beijing Univ er sity o f TCM , Beijing 100029, China; 2. Institute of M edicinal Plant Developm ent ,
Chinese Academy o f Medica l Sciences & Peking Union Medica l Colleg e, Beijing 100094, China )
Key words: DN A ex traction; polyphenol; dried leaves of Salvia mil tiorrhiza Bge.
DNA的有效提取是分子生物学研究工作的前
提 ,植物 DNA提取大多使用新鲜幼嫩的材料 ,野外
采集时可将新鲜叶片或芽等用变色硅胶快速干燥 ,
防止细胞死亡过程中次生物质的释放和 DNA的原
位降解。在中药材研究过程中 ,样品来源多样 ,其中
已经降解的 DNA无法补救 ,但去除材料中特别是
老叶、老树皮、木质茎及根中所含的可能影响下一步
生化反应 (如限制性酶酶切或 Taq聚合反应 )的次
生物质则是至关重要的。如何去除存在于植物药材
中的多酚或多糖两类主要杂质 [1 ] ,到目前为止 ,还没
有方便实用的通用有效方法。
本课题组在进行丹参 Salvia m iltiorrhiza Bge.
道地性的 RAPD研究过程中 ,得到的是 40多个丹
参晒干叶片或晾干叶片 ,而且许多样本是老叶 ,其中
的多酚类化合物含量很多 ,常规方法提取到的 DNA
无法得到扩增产物 ,于是按文献报道的方法进行了
提取条件的摸索。
1 材料和试剂
晾干或晒干的丹参叶片 ,来源: 8-河南卢氏栽
培 , 22, 23-山东沂南栽培 , 38-河北承德栽培 , 43-山
西绛县栽培。参照样本: 2-四川中江栽培 ,采集幼叶 ,
变色硅胶快速干燥。
CT AB ( Amresco ) , SDS ( Biomo l ) ,尿素 ( Am-
resco ) , Vit C( Amresco) , PV P-40T( Sigma ) , EDT A
( Amresco ) ,β-巯基乙醇 ( Merck ) , Tris碱 ( Gibco ) ,
EB ( Sigma ) ,二硫苏糖醇 ( Boehringer) ,亚硫酸钠
( Amresco ) , Taq酶 (上海生工 ) ,随机引物 S17, S115
(上海生工 ) , dN T P(上海生工 ) , BSA (华美公司 ) ,
琼脂糖 ( Spanish ) ,其余试剂为分析纯。
基因扩增仪为 PE9600,电泳仪为 Bio-Rad
Power PAC 300。
2 方法和结果
2. 1 一般方法: CT AB法:参照文献方法 [ 2] ,其中 β-
巯基乙醇含量为 2%。
高盐低 pH法: 参照文献方法 [3 ]。
尿素法: 参照文献 [4 ] ,取药材 30 mg,液氮研磨
成粉末 ,加入提取液 ( 8 mol /L尿素 , 250 mmol /L
Tris-HCl, pH8. 0、 400 mmo l /L NaCl, 500 mmol /L
EDT A, pH8. 0、 0. 5%巯基乙醇 ) 600μL,混匀 ,室温
放置 5 min,纱网过滤 ,随即加入 1% SDS,室温放置
1 h,不断振摇 ,加入 20% PV P至终浓度为 6% ,然后
加入 0. 5体积的醋酸铵 ,混匀 ,冰上放置 30 min, 15
℃ 4 000 r /min离心 15 min,然后 12 000 r /min离
心 20 min,沉淀用 86%乙醇洗涤 1次 ,风干 ,适量水
溶解 ,再用等体积的苯酚 -氯仿 -异戊醇 ( 50∶ 49∶ 1)
抽提 , 8 000 r /min 15℃离心 10min,沉淀再用 86%
乙醇洗涤 1次 ,晾干 ,适量 TE溶解 , 4℃放置备用。
3种方法得到的总 DNA都呈浅黄色至深棕色 ,
除 2号样扩增良好外 , 8, 22和 23号样只有弱扩增 ,
38号样和 43号样颜色最深 ,无扩增 ,提示提取液的
·418· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002年第 33卷第 5期
收稿日期: 2001-07-03基金项目:国家自然科学基金重点资助课题 ( 39730500)
颜色深度 (含有较多多酚 )与扩增结果呈明显负相
关 ,文献报道去除多酚效果较好的高盐低 pH法不
奏效。
2. 2 去除多酚初选方法: 用 CTAB法作为基本方
法 ,针对样本 38号和 43号 ,添加一些抗氧化剂 ,防
止多酚转化为醌 ,与 DNA形成紧密结合 ,影响 Taq
酶的活性。
A处理: 提取液中将 β -巯基乙醇量增加为 4%
和 6% 。
B处理:提取液中加 Vit C干粉末。
C处理: 提取液中加亚硫酸钠干粉末。
D处理: 提取液中加二硫苏糖醇 ( DT T)干粉
末。
只有 B处理的 DNA提取液明显变浅 , 38号样
有很好的扩增 , 43号样 DNA提取液仍呈浅棕色 ,无
扩增 ,其他提取方法也无扩增 (见图 1) ,提示添加
Vit C是有效的去除多酚的方法 ,但 DNA的提取量
有所下降。
1, 3, 5-样本 38 2, 4, 6-样本 43
1, 2-B处理 3, 4-C处理 5, 6-D处理
图 1 初选方法扩增结果 (引物 S17)
2. 3 去除多酚优选方法:仍用样本 38和 43,在 B
处理的基础上进行方法优选。
E处理: 提取液中加 Vit C干粉末 ( 30 mg , 45
mg /0. 03 g干叶 )。
F处理:提取液中加 Vit C干粉末 ( 30 mg /0. 03
g干叶 ) ,用 3 mol /L的 NaOH调整 pH值为 6～
6. 5。
G处理:加 PV P-40T粉末 (干叶量的 10% ) ,与
干叶共同在液氮下研碎。加入 4℃预冷的提取缓冲
液Ⅰ ( 0. 25 mol /L NaCl , 0. 25 mol /L Tris-HCl , 50
mmol /L EDT A, pH= 8. 0) ,冰置 10 min, 7 000 r /
min离心 ,倾去上清液 ,然后加 Vit C干粉末 ( 30
mg /0. 03 g干叶 )于 2× CTAB提取液中 ,调 pH值
为 6. 0～ 6. 5。
提取液中 Vit C量加大 ,严重影响 DNA的提取
量 ,加至 45 mg /0. 03 g干叶时 ,提取液检验时只能
见到少量的 RNA,而 DNA几乎没有 (见图 2) ;调整
pH后 ,避免了 DNA的减少 ,但 43号样扩增仍不够
好 (见图 3) ;综合 PV P预洗法后 , 43号样品提取液
变成浅黄色 ,扩增良好 (见图 4)。
1-15 mg 2-22 mg 3-30 mg 4-45 mg(加 Vit C量 )
图 2 加 Vit C提取结果 (样本 43)
1～ 4-加 Vit C 22. 5 mg 5～ 8-加 Vit C 30 mg
1, 2, 5, 6为样本 43 3, 4, 7, 8为样本 38
图 3 加 Vit C扩增结果 (引物 S115)
1～ 4-引物 S17 5～ 8-引物 S115
1, 5-样本 43 2, 6-样本 38 3, 7-样本 23 4, 8-样本 22
图 4 处理扩增结果
最佳方法用 CT AB法提取了 40多份丹参样品
DNA,有一半以上样品的 DNA溶液无色或呈浅黄
色 ,但除四川中江的硅胶干燥幼叶片外 ,扩增效果很
不稳定 ,即多数样本用某些引物扩增时表现好 ,而另
外的引物则只有弱扩增或无扩增 ,或重复性不好 ,表
明 DNA提取液虽然颜色不深 ,酚类化合物的影响
仍存在。 全部样本用 G处理提取之后 ,都得到了清
晰的、可重复的扩增条带 (见图 4)。
·419·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002年第 33卷第 5期
3 讨论
DNA提取过程中多酚类物质的去除大多采取
两类手段 ,一类是加酚类的结合剂 ,如 PV P(聚乙烯
吡咯烷酮 )、 PV PP(聚乙烯聚吡咯烷酮 )、 PEG(聚乙
二醇 ) ;另一类是加抗氧化剂 ,如 Vit C、亚硫酸钠、
二硫苏糖醇、巯基乙醇、半胱氨酸等 ,防止酚类氧化
为醌类。本实验证明将两类方法组合起来可以有效
去除多酚类杂质 ,其中 PV P和 Vit C组合效果
最佳。
作者对 G处理去除多酚的有效性和通用性进
行了考察 ,试验提取了厚朴 Magnol ia of f icinalis药
材 (含有较多简单酚类 )、牛膝 Achyranthes bidentata
药材 (含有三萜皂苷、甾酮及多糖 )和干叶 (含鞣质 )
及木通科猫儿屎 Decaisnea insignis干叶 (含有大量
鞣质 ) ,并用随机引物和特异引物 (扩增 IT S序列 )
进行扩增 ,效果均很好 ,故而该方法可推荐为去除酚
类杂质的有效通用方法 ,而且 ,用 PV P-40T预洗的
过程中也可去除多糖类杂质 [5 ] ,所以也适用于含多
糖的材料 ,但该方法对 DNA提取量的影响及更广
泛的样本适用性还在考察中。
本实验发现的 CTAB法加 G处理可推荐为通
用提取方法 ,但使用该方法时应注意:① PV P和 Vit
C都以固体形式加入最好 ,不能事先配成储存液 ,否
则会与空气中的氧作用而失去效果。 ②丹参 DNA
提取时 PV P和 Vit C使用量分别为 0. 1 g /g和 1 g /
g (干材料 ) ,如果效果不好 ,二者可加倍量使用。 ③
PV P与样本共研后 ,要用预冷清洗液 ,并冰置一段
时间 ,也是防止氧化的手段。④加 Vit C后溶液的
pH值会下降至 4～ 5,这样的条件下 , C TAB提取效
果不佳 ,必须将提取缓冲液的 pH值调至近中性 6～
6. 5。
参考文献:
[ 1 ] 郭宝林 ,李家实 ,阎玉凝 . 中药材 DNA分子标记研究的技术
问题Ⅰ . 植物药基因组 DNA的提取 [ J ] . 中草药 , 2000, 31
( 12): 951.
[2 ] 顾红雅 ,瞿礼嘉 ,明小天 ,等 . 植物基因和分子操作 [ M ] . 北
京:北京大学出版社 , 1995.
[ 3 ] 邹喻苹 ,汪小全 ,雷一丁 ,等 . 几种濒危植物及其近缘类群总
DN A的提取和鉴定 [ J]. 植物学报 , 1994, 36( 7): 528-532.
[ 4] Tan S-L, Dos set t M , Katze M G. Ex t raction of g enimic DN A
suitab le for PCR analysis f rom d ried plant rhi zomes / roo ts [ J].
Bio Tech , 1998, 25( 5): 796-801.
[ 5 ] 邹喻苹 ,葛 颂 ,王晓东 . 系统与进化植物学中的分子标记
[M ] .北京:科学出版社 , 2001.
薄层扫描法测定烟叶中茄呢醇的含量
李 烈 1 ,马振元 2 ,钱秋霞 ,丛晓东2
( 1. 中国药科大学 ,江苏 南京 210038; 2. 山东省天然药物工程技术中心 ,山东 烟台 210405)
茄呢醇 ( solanesol , 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31,
35-九甲基 -2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34-三十六烷
九烯 -1-醇 )是茄科植物烟草 Nicot iana tabacum L.
中含有的萜类有效成分 ,具有抗菌、消炎和止血作
用 ,也是合成辅酶 Q10和 Vit K2的主要中间体 ,具有
很好的应用价值。 关于茄呢醇含量测定方法的文献
报道较少 ,国外报道中主要用气相色谱法测烟叶中
茄呢醇的含量 [1, 2 ]。茄呢醇沸点大于 300℃ ,需高温
色谱柱 ,条件较为苛刻 ,不易推广。 国内报道用
HPLC-示差折光检测仪来测定其含量 [3 ] ,示差折光
检测仪检测灵敏度较低 ,对流动相温度变化非常敏
感 ,可控性也差。本实验首次使用薄层扫描法对烟叶
中茄呢醇含量进行测定。
1 仪器与试药
CD-60型薄层扫描仪 (德国 DESAGA公司 ) ,
定量毛细管 ( 1μL, 2μL, CAMAG公司 ) ,烟草 (采
集自不同产地 ) ,茄呢醇对照品 ( Sigma公司 ,纯度>
99% ) ,高效薄层板 ( 100 mm× 200 mm ,青岛海洋化
工厂分厂 ) ,所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 对照品溶液的配制: 取茄呢醇对照品 28 mg,
精密称定 ,置于 50 mL容量瓶中 ,用正己烷定容 ,配
成浓度为 0. 56 mg /mL的对照品溶液。
2. 2 供供品溶液的配制:取 5 g烟叶 ( 30～ 40目 ,烘
干至恒重 ,山东临沂 ) ,精密称定 ,置于 50 mL三角
烧瓶中 ,精密加入 40 mL正己烷 ,超声 30 min,取上
清液 ,过滤 ,弃去初滤液 ,取续滤液 ,作为供试品溶液
备用。
·420· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002年第 33卷第 5期
收稿日期: 2001-09-25作者简介:李 烈 ( 1976～ ) ,女 ,重庆人 ,中国药科大学生药学专业 99届硕士研究生 ,研究方向为天然药物分析。
Tel: 13851470035 E-mai l: ju nesnow 76@ sina. com