全 文 ：缓解了心肌组织急性缺氧性损伤,该结果与 SY 缓
解超微结构缺氧性损伤的结果相吻合。文献报道
SY 可使微循环流速加快、毛细血管网开放数目增
加、心肌内毛细血管血流量增加,因而 SY 可能使毛
细血管扩张而致冠状动脉流量增加; 文献报道 SY
还可降低血浆中血管紧张素 Ò ( angiotensin- Ò,
AGT Ò) 活性, 因而推测 SY 亦可降低离体心脏局
部 AGT Ò 活性, 从而不同程度扩张冠状动脉、冠状
静脉, 改善微循环。因而 SY 可能通过扩张冠状动
脉改善微循环而改善心肌供血、缓解心肌缺氧性损
伤。
SY 使离体灌流心脏的心室肌组织 ATP 含量
呈升高趋势,缓解离体心肌线粒体肿胀,线粒体膜流
动性下降, 缓解 Langendorff 模型超微结构的损伤,
因而改善心肌能量代谢也可能为其缓解心肌缺氧性
损伤的重要机制之一。心肌缺血时组织发生能量代
谢障碍,使钠泵、钾泵及其他酶系统功能下降, 生物
膜通透性增加, 进而出现组织细胞的一系列病变。
SY 缓解细胞内 AT P 含量下降, 可能是由 SY 增加
氧、葡萄糖等物质供给(如通过缓解冠状动脉流量下
降)与 SY 直接缓解缺氧时线粒体磷脂双分子层结
构和功能的损伤共同作用结果。荧光探针直接标记
于线粒体内膜脂质区, 反映了内膜脂质区磷脂分子
各种运动状态的变化, 线粒体保温后[ 7, 8]发生肿胀、
膜流动性下降等变化,这与心肌缺氧时线粒体改变相
似。这时磷脂分子活动度降低、有序性增高, 膜蛋白
(如酶复合体) 侧向运动的微环境改变,可能会影响
呼吸链电子传递和磷酸化过程。SY 缓解心肌线粒体
混悬液中线粒体损伤的作用与大鼠离体心脏灌流实
验观察到的 SY 缓解心肌线粒体肿胀等作用一致。
SY 可缓解大鼠心肌缺氧性损伤, 改善心肌能
量代谢可能为其重要机制之一。心肌缺血是中医血
瘀证,心血瘀阻的重要病理改变,作为活血化瘀常用
药物,红花可通过多种机制缓解心肌缺血。本研究
对于进一步阐明红花活血化瘀的作用机制,指导红
花及其制剂开发及临床应用,具重要的理论及实际
意义。
References:
[ 1] Bai Y L, Ke M L, Liu J D. Ef fect of Carthamus tinctorius L.
on blood rheology and clinical symptom in coronary heart disease
pat ients [ J]1 R es Tradi t Chin Med (中医药研究) , 1991, ( 5) :
33-341
[ 2] Wang D J, Zhang P Y, Zhang P Q. Clinical report on therapeutic
ef fect of Car tham us tinctorius L . I nj ect io on coronary heart dis-
ease and analysis of 100 cases [ J]1 Shanxi Med J ( 山西医药杂
志) , 1997 ( 1) : 34-361
[ 3] Jin M , Li J S , Wang Y Q, et al . Gross saff low er yellow and it s
preparat ion and appl icat ion [ P]1 CN: 99123713. 7, 2002-05- 291
[ 4] Shi X Y. Method s of Medical Exper imen tal A nimals (医学动物
实验方法) [ M ] 1 Beijing: People. s Medical Publishing Hou-se,
19861
[ 5] Ye Y W, Li J Z, Wang Y C. Cl ini cal Exp erimental Diag nostics
(临床实验诊断学 ) ( Book 1) [ M ]1 1st ed. Beijing: People. s
Medical Publishing House, 19891
[ 6] Wang Q. Moder n Med ical Exper imen tal Methods (现代医学实
验方法) [ M ]1 1st ed. Beijing: People. s Medical Publishing
House, 19971
[ 7] Wang J F, Zhang R R, Lu X Y, et al . Protect ive ef fect of propyl
gallic acid on sw elling and lipid peroxidat ion of rat liver mitochon-
dria [ J]1 Acta Phar ma Sin (药学学报) , 1986, 21 ( 11) : 857-
8691
[ 8] Miao M Y, Zhu S H, S hi H P, e t al . E ffect s of inject ion sa- lvine
mitorrhize on the inner membrane damage of rat myocardial mito-
chondria follow ing hemorrhagic shock [ J]1 Basic Med S ci Clin
(基础医学与临床) , 1994, 14 ( 5) : 368- 3711
[ 9] Fang F D, Zhou L, Ding L, et al . Gener al Book of Techniques
in Modern Medical Exp eriments ( Book 1) ( 现代医学实验技巧
全书) [ M ]1 Beijing: Beijing Medical University & Peking Union
Medical University United Publishing House, 19951
西红花酸对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用
刘同征,钱之玉X
(中国药科大学 药理教研室, 江苏 南京 210009)
摘 要:目的 研究西红花酸对异丙肾上腺素 ( ISO) 致大鼠急性心肌缺血的保护作用及机制。方法 采用大剂量
ISO sc 诱导产生大鼠急性心肌缺血模型 ( ISO 30 mg / kg, 每日一次,连续 2 d) , 实验大鼠随机分为正常组、ISO 模型
组、阳性对照组和 3 个西红花酸给药组 ( 25, 50, 100 mg/ kg) ,测定心脏系数和血清中乳酸脱氢酶 ( LDH)、磷酸肌酸
激酶 ( CK ) 和丙二醛 ( MDA ) 含量, 观察心肌组织谷胱甘肽过氧化物酶 ( GSH-Px)、Na+ , K+-ATP 酶和 Ca2+ ,
Mg
2+
-ATP 酶活性及心脏病理改变,观察西红花酸的保护作用。结果 西红花酸能显著降低血清中 CK 和 LDH
#439#中草药 Chinese T raditional and Herbal Drugs 第 34 卷第 5 期 2003年 5月
X 收稿日期: 2002-08- 12作者简介:刘同征( 1978 ) ) ,男,现于北京大学临床肿瘤学院临床药理室工作,主要研究方向为抗肿瘤药物的开发研究。
* 通讯作者 T el: ( 025) 3222717
的释放;也能显著降低血清和心脏匀浆中 MDA 水平,心脏重量参数显示对心肌水肿有明显的抑制作用; 保护心肌
GSH-Px ; Na+ , K +-AT P 酶和 Ca2+ , Mg2+-ATP 酶活性; 心脏病理切片表明西红花酸对心肌坏死有显著的保护作
用。结论 西红花酸对 ISO 所致急性心肌缺血有显著的保护作用。
关键词:西红花酸; 异丙肾上腺素; 心肌缺血坏死; 丙二醛
中图分类号: R2861 2 文献标识码: A 文章编号 : 0253 2670( 2003) 05 0439 04
Protective effect of crocetin on isoprotereno-l induced myocardial injury in rats
LIU Tong-zheng, QIAN Zh-i yu
( Department of Pharmacology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
Abstract: Object T o study the protect ive effect of crocetin on myocardial ischemia induced by isopro-
terenol ( ISO) . Methods Myocardial ischemia w as induced by subcutaneous injection of ISO ( 30 mg/ kg for tw o
days, once a day) . The experimental animals w ere randomly divided into the normal group, ISO group, posit ive
control g roup and three crocetin groups ( 25, 50, 100 mg/ kg) . Cardiac indexes w ere examined. The level of
LDH, CK, MDA in serum were measured. The content of MDA, GSH-Px and the AT Pase activity heart and
mitochondria w ere assayed by colorimetric analysis. The histopatholog ical change of myocardia w as invest igated
by HE staining. Results Compared w ith the model group, crocetin can significant ly reduce the cardiac index-
es, obv iously decrease the level of MDA, LDH and CK in the serum . Crocet in can signif icantly increase the ac-
t ivit ies of Na+ , K+-ATPase; Ca2+ , Mg2+-APTase; GSH-Px. The histopatholog ical changes confirmed the
protective effects of crocet in on the myocardial injury. ConclusionCrocetin could alleviate the acute myocardial
ischem ia induced by ISO in rats.
Key words: crocetin ; isoproterenol ( ISO) ; myocardial ischemia necrosis; MDA
儿茶酚胺的大量产生与释放引起的心肌损伤是
心肌缺血、心衰等病理过程的重要发病因素之一, 异
丙肾上腺素 ( ISO) 为 B受体激动剂,连续大剂量应
用可诱发实验动物心肌梗死样损伤[ 1]。sc 大剂量
ISO ( > 10 mg/ kg) 导致的清醒大鼠心肌损伤,能模
拟人类心肌缺血性损伤[ 2]。现代许多研究表明, 大
剂量 ISO 引起的心肌缺血样损伤与氧自由基的产
生关系密切。一方面, 心肌缺血时儿茶酚胺可在缺
血区大量蓄积, 其代谢过程中可以产生大量的氧自
由基; 另一方面 ISO 可自动氧化并在氧化过程中产
生大量的超氧阴离子和过氧化氢;这些活性氧导致
心肌细胞膜发生脂质过氧化而引起损伤[ 3, 4]。
从西红花中已经提取分离出一些有效成分, 西
红花苷及其苷元西红花酸是主要的有效成分[ 5]。
西红花酸属于类胡萝卜素类化合物,具有不饱和共
轭多烯酸结构,与不同的糖结合形成其苷 ) ) ) 西红
花苷。实验证明西红花酸在体外具有很强的抗氧化
作用, 对 ISO 诱导的大鼠心肌缺血损伤是否具有保
护作用,是否通过抗氧化作用而达到这一保护作用
呢? 为解答这个问题,本实验以大剂量 ISO 诱导的
大鼠心肌缺血损伤为模型, 以血清 LDH , CK, MDA
为指标检测心肌损害程度,以心脏系数、心脏病理和
心脏匀浆 MDA 含量、GSH-Px 和 Na+ , K+-AT-
Pase; Ca2+ , Mg2+-ATPase 活性为指标观察心肌损
伤时氧自由基的产生及体内抗氧化系统的变化与心
肌损伤之间的关系,并进行了病理考察。
1 材料与方法
111 药品与试剂:西红花酸,本实验室精制,含量>
50%。异丙肾上腺素 ( isoproterenol, ISO) 为 Sigma
公司出品。考马斯亮蓝 G-250 为 Fluka 出品。Tris
为 B1M 进口分装。复方丹参片 ( 010504) , 广州粤
华药业有限公司产品。其他试剂均为国产分析纯。
AT Pase 测定试剂盒、MDA 试剂盒由南京建成生物
工程研究所提供。
112 仪器: 分析天平, 上海第二天平仪器厂生产;电
热恒温水浴锅、752分光光度计、XW80-A 旋涡混合
器,上海医科大学仪器厂生产; Eppendorf 5417R 冷
冻离心机。
113 动物: SD 大鼠, 雌雄各半, 体重 170~ 230 g,
由中国药科大学实验动物中心提供。
114 ISO 诱导心肌缺血模型制备及给药方法: 按照
Rona 等的方法略做改良,复制 ISO 急性心肌缺血
模型。大鼠按体重随机分为 6 组:正常组, 模型组,
西红花酸高、中、低剂量组及复方丹参组。西红花酸
组分别提前 ig 给药 5 d,每天 2 次,每次给药剂量分
别为 100, 50, 25 mg / kg。丹参组提前 ig 给药 7 d,
每天 2 次,每次给药剂量为 5 g/ kg (生药量) ,除正
常组以等量生理盐水 sc外,其余各组均 sc ISO (每
次 30 mg/ kg,每日 1 次,连续注射 2 d)。全部动物
在末次 sc ISO 后 24 h,摘眼球取血, 分离血清, - 20
#440# 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drugs 第 34 卷第 5 期 2003年 5月
e 保存待测。脱颈椎处死动物, 迅速取出心脏, 以
冰生理盐水洗去残留血液, 除去大血管、结缔组织,
滤纸吸干,称全心重。取心尖部位至 10% 福尔马
林溶液中固定, 用于病理学检查, 其余心脏减碎后,
以 10倍量 Tris-HCl ( pH 7. 4) 缓冲液在冰浴下制
成 10% 的心脏匀浆, 于 4 e , 1 000 g 离心 10 min,
弃沉淀,取上清进行各项酶学指标的检测。考马斯
亮蓝法测定蛋白含量以牛血清白蛋白为标准。
115 统计方法:所有数据均以 x ? s 表示, 数据间
显著性差异用 t 检验。
2 结果
211 西红花酸对心脏系数的影响: 与正常组比较,模
型组心脏系数 (心脏重/体重) 升高了 39172% ( P<
0101) ;复方丹参组心脏系数比模型组下降 7166%
( P< 0105) ;西红花酸高、中剂量组心脏系数分别比模
型组下降了 8147%, 7186% ( P< 0105)。
212 西红花酸对血清中 MDA, LDH , CK 的影响:
心肌细胞中富含 LDH , CK, 当心肌细胞受损后, 心
肌细胞膜完整性被破坏, 细胞内 LDH , CK 外漏, 释
放入血,因此血清 LDH , CK的含量可以反应心肌细
胞的损伤程度。同时心肌细胞膜脂质过氧化使得产
生的脂质过氧化产物 MDA 进入血液, 可以检测心
肌细胞膜过氧化的情况。与正常组比较, 模型组血
清 MDA, LDH , CK 分别升高了 52193%, 33146%,
69187% ;复方丹参组与模型组比较分别降低了
19151% , 12185% , 29137%。西红花酸高、中、低剂
量组与模型组比较分别降低了 20191% , 14153%,
37163% ; 20156% , 13128%, 35151%; 17154%,
11138% , 29113%。其中高、中剂量各项指标与模型
组比较有非常显著性差异 ( P< 0101) , 两者的保护
作用好于低剂量组。结果见表 1。
213 西红花酸对心肌匀浆 MDA; GSH-Px; Na+ ,
K+-ATPase; Ca2+ , Mg 2+-AT Pase 的影响: 大剂量
sc ISO 后,心脏组织 MDA 含量显著上升,相对于正
常组升高了 40% ( P< 0101) , 而 GSH-Px 与 Na+ ,
K+-ATPase; Ca2+ , Mg 2+-AT Pase 的活性下降, 相
对于正常组分别下降了 46% , 57%, 60% ,而西红花
酸各组对 ISO 引起的心肌组织 MDA 含量升高以
及 GSH-Px; Na+ , K+-ATPase; Ca2+ , Mg 2+-AT-
Pase 酶活性降低都有一定的逆转作用, 其中西红花
酸高、中剂量组的效果要好于低剂量组。结果见表
2。
214 病理改变: 心肌组织经 10% 甲醛溶液固定,
常规取材,脱水,石蜡包埋, 制片 ( 4 Lm 厚) ,HE 染
色,在光学显微镜下观察。正常组心内膜内皮完整,
间质结缔组织内未见炎细胞浸润, 无水肿及纤维结
表 1 西红花酸对 ISO引起的心肌缺血大鼠血浆中 MDA, LDH, CK水平及对大鼠心脏指数的影响 ( x ? s, n= 8)
Table 1 Effect of crocetin on level of MDA, LDH, CK in serum and cardiac
index of myocardial ischemia rats induced by ISO ( x ? s, n= 8)
组别 剂量/ ( mg#kg- 1) M DA/ ( nmol#mL- 1) LDH/ ( U#L- 1) CK/ ( U#L- 1) 心脏指数
正常 - 5163 ? 0155 3 114 ? 585 82180 ? 19144 3155 ? 1104
模型 - 8161 ? 1135 v v 4 156 ? 281 v v 141138 ? 40188 v v 4196 ? 0129 v v
西红花酸 100 6181 ? 0151* * 3 553 ? 499* * 88118 ? 22113* * 4154 ? 0134* *
50 6184 ? 0191* * 3 605 ? 512* * 91117 ? 12186* * 4157 ? 0134* *
25 7110 ? 0169* 3 683 ? 553* 100120 ? 24108* 4199 ? 0159
丹参 5 000 6193 ? 0169* * 3 622 ? 461* * 99186 ? 12155* 4158 ? 0133* *
与正常组比较: v v P < 0101; 与模型组比较: * P< 0105 * * P < 0101
v vP < 0101 v s normal group; * P < 0105 * * P< 0101 vs model group
表 2 西红花酸对 ISO所致心肌缺血大鼠心肌匀浆中 MDA 含量及 GSH-Px;
Na+ , K+-ATPase; Ca2+ , Mg2+-ATPase活性的影响 ( x ? s, n= 8)
Table 2 Effect of crocetin on level of MDA and activities of GSH-Px; Na+ , K+-ATPase; Ca2+ , Mg2+-ATPase
in myocardial homogenate of myocardial ischemia rats induced by ISO ( x ? s, n= 8)
组别 剂量/ ( mg#kg- 1) MDA/ ( nmol#mg- 1) Na+ , K+-ATPase/ ( U#mg- 1) Ca2+ , Mg 2+-ATPase/ ( U#mg- 1) GSH-Px/ ( U#mg - 1)
正常 - 3104 ? 0156 1145 ? 0129 1145 ? 0132 25100 ? 5178
模型 - 4125 ? 0149 v v 0163 ? 0121 v v 0158 ? 0118 v v 13144 ? 2164 v v
西红花酸 100 3137 ? 0137* * 0198 ? 0121* * 0191 ? 0122* * 18190 ? 5137*
50 2191 ? 0151* * 0192 ? 0119* 0187 ? 0120* * 18170 ? 6158*
25 3160 ? 0141* * 0192 ? 0127* 0182 ? 0122* 15175 ? 6144
丹参 5 000 3165 ? 0152* * 0192 ? 0113* * 0186 ? 0111* * 17199 ? 5159*
与正常组比较: v v P < 0101; 与模型组比较: * P< 0105 * * P < 0101
v vP < 0101 v s normal group; * P < 0105 * * P< 0101 vs model group
#441#中草药 Chinese T raditional and Herbal Drugs 第 34 卷第 5 期 2003年 5月
缔组织增生;心肌细胞横纹清晰, 核居中, 间质未见
血管扩张及炎细胞浸润; 心外膜内皮完整,无渗出物
被覆及炎细胞浸润。而模型组心内膜内皮不完整,
可见大片心肌细胞变性坏死, 间质内大量淋巴细胞、
巨噬细胞弥漫性浸润。西红花酸的高、中、低剂量组
心内膜内皮不完整, 可见散在心肌细胞变性坏死, 间
质内多少不等的淋巴细胞、巨噬细胞浸润,间质未见
血管扩张。丹参组情况与此类似。
3 讨论
ISO 可产生类应激反应, 过量可导致心肌坏
死[ 6]。在临床心绞痛发作及心肌梗死时常有明显
的应激反应。研究已经证实 sc 大剂量 ISO 所造成
的大鼠心肌梗死样损害的模型,其心电图演变、心肌
代谢改变及组织病理学 (包括超微结构) 变化均与
动脉粥样硬化大鼠和人类自然发生的急性心肌梗死
非常接近, 并对 ISO 引起的损伤机制提出相对缺血
缺氧学说,膜通透性改变、自由基损伤等观点, 因此
该模型在一定程度上比冠脉结扎模型更具有优越
性,更具有实际意义[ 7]。
在实验中观察到, 模型组的血清 LDH , CK 活
性,心肌 MDA 含量和心脏系数 (心脏水肿程度) 等
明显升高, 与正常组比较均有显著差异, 提示 ISO
导致心肌损伤时出现心肌细胞损伤,产生大量的自
由基诱发心肌细胞膜脂质过氧化增加, 同时观察到
心肌中 GSH-Px; Na+ , K+-AT Pase; Ca2+ , M g2+-
ATPase活性降低, 这表明 ISO 引起心肌损伤后, 心
肌抗氧化系统清除自由基的能力降低, 心肌能量代
谢障碍等。
心肌缺血期间产生的自由基引发生物膜脂质过
氧化损伤,是造成细胞膜上的 ATP 失活、离子转运
障碍的主要原因之一。近年的研究表明, 心肌肌膜
Na
+
, K
+
-ATPase 酶活性和 Na+-Ca2+ 交换活性对
维持细胞内钙浓度恒定也有重要的意义。Na+ ,
K+-AT Pase 酶活性下降会引起胞内 Na+ 超负荷,进
而使胞浆内 Ca2+ 超载。Ca2+ , Mg2+-ATPase 酶活
性下降则主要导致细胞内外 Ca2+ , Mg 2+ 分布失
衡,细胞内 Ca2+ 聚集, 同时由于 Na2+ , K+-AT Pase
酶受到抑制, Na2+-Ca2+ 交换下降, 细胞内 Ca2+ 超
载而导致心肌细胞受损, 甚至死亡。GSH-Px 是体
内重要的抗氧化酶, 对细胞结构和功能的完整具有
保护作用。冠心病患者随着病情的发展, MDA 升
高而 GSH-Px 活性降低, 并有研究表明在应激状态
下, GSH-Px 的消耗先于 MDA 的增加,过氧化反应
增强导致了 GSH-Px 活性的降低。
本实验研究发现西红花酸能够降低心肌缺血过
程中 MDA 含量,提高 Na+ , K+-ATPase; Ca2+ , Mg2+-
ATPase 的活性,提示西红花酸可通过减少脂质过氧
化,维持细胞膜的完整性而发挥保护作用。此外西红
花酸提高心肌组织中抗氧化酶 GSH-Px 的活性,从而
提高心肌细胞抗氧化损伤的能力。更为重要的是西
红花酸还可以显著的增加冠脉流量以及加强氧从心
肌非缺血区向缺血区域的扩散,以此对抗 ISO诱发的
交感兴奋、代谢增强而导致的缺血性损伤,改善心肌
缺血状态[ 7, 8]。由此可见西红花酸通过清除自由基、
抗脂质过氧化、稳定细胞膜和抗心肌缺血多种途径对
ISO诱导的大鼠心肌损伤起到良好的保护作用。西
红花酸与其他单纯的抗氧化比较具有明显的优势,是
一个很有前途的抗心肌缺血药物。
References:
[ 1] Rona G, Chappel C, Batazs T A. An infarction myocardial lesion
and other toxic man ifestat ions produced by isoproterenol in the rat
[ J]1 A rch Pathol , 1959, 67: 443-4681
[ 2] Nirmala C, Puvanakrishman R. Protect ive role of curcum in
against isoproterenol in duced myocardial infarct ion in rat s [ J]1
Mol Cell Biochem , 1996, 159 ( 2) : 85-931
[ 3] Blasing L E, Zipper J, Muschick P, et al . Absolute and relat ive
myocardial ischemia by isoproterenol overdosage [ J]1 Biomed
Biochim Acta, 1985, 44: S1641-S16491
[ 4] Kondo T, Ogaw a Y, Suglyama S . Mechanism of isoproterenol in-
duced myocardial damage [ J ]1 Cardiovasc Res, 1987, 21: 248-
2541
[ 5] Gao W Y, Zhu D Y. Review s of Crocus sat i v us L. ingredients
and related pharmacology [ J]1 Chin T radi t Her b Drugs (中草
药) , 1999, 30 ( 5) : 389- 3911
[ 6] Rona G, B outet M , Hut terner I. Repersut ion injury, a poss ible
link betw een catecholam ine-induced and ischem ia myocardial a-l
teration [ J]1 Ad v Myocardiaol , 1983, 4: 427-4391
[ 7] Wexler B C, Judd J T . Acute myocardial histopathology in
normal and arteriosclrot ic rat s during isoproterenol infarct ion [ J]1
Br J Exp Pathol , 1970, 51: 646-6521
欢迎订阅5中草药6杂志 2002年增刊
为了加快中药现代化的进程,交流中药指纹图谱研究的经验,讨论入世后我国中药产业面临的挑战和对策, 本刊在 2002
年 10 月底出版以/中药现代化0和/ 中药指纹图谱0 为主要内容的增刊。欢迎广大读者直接向5中草药6杂志编辑部订阅。定
价: 60. 00 元,另加 5. 00元邮费,款到寄刊。
本刊另有 1996 ) 2001 年增刊,欢迎订阅。 References:
编辑部地址:天津市南开区鞍山西道 308号
邮编: 300193 电话: ( 022) 27474913 23006821 传真: ( 022) 23006821 E-mail: zcyzzbjb@ tjipr. com
#442# 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drugs 第 34 卷第 5 期 2003年 5月