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射干中异黄酮成分清除自由基的作用
秦民坚 ,吉文亮 ,刘　峻 ,赵　俊 ,余国奠
(中国药科大学中药学院 ,江苏 南京　 210038)
摘　要: 目的　研究射干 Belamcanda chinensis中分离的 4种异黄酮类成分清除 O2÷ ,· OH和 H2O2自由基的能
力。方法　采用生物化学发光法测定。结果　射干根茎中分离得到的异黄酮成分野鸢尾苷元 ( irg enin,Ⅰ ) ,鸢尾苷
元 ( t ecto rigenin,Ⅱ ) ,鸢尾苷 ( tecto ridinⅢ ) , 5, 6, 7, 4′-四羟基-8-甲氧基异黄酮 ( 5, 6, 7, 4′-tetrahydroxy-8-men-
thoxyisoflav one,Ⅳ ) 均具有清除自由基的作用 ,其中鸢尾苷元对 O2÷ ,· O H和 H2O2氧自由基清除作用的能力最
强。 结论　射干根茎中的 4种异黄酮类成分具有清除自由基的作用。
关键词: 射干 ;异黄酮 ;自由基 ;生物化学发光法
中图分类号: R286. 75　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0640 02
Scavenging effects on radicals of isoflavones from rhizome of Belamcandae chinens is
QIN Min-jian, JI Wen-liang , LIU Jun, ZHAO Jun, YU Guo-dian
( Co lleg e of Chinese Materia Medica, China Pharmaceutical Univ ersity, Nanjing 210038, China )
Key words: rhizome o f Belamcandae chinensis ( L. ) DC. ; isof lav ones, radical; bio chemiluminescence
　　近年研究发现 ,中草药中某些有效成分具有清
除自由基的作用。 例如甘草中甘草酸和甘草次酸具
有不同程度的抑制 O2÷的作用 [1 ] ,云芝糖肽和灵芝
多糖具有清除活性氧的作用 ,与其提高机体免疫能
力和防癌抗癌机制有关 [2 ]。 不同的天然产物对不同
类型的自由基清除效果各异 ,机制各不相同 ,所以应
建立不同的自由基模型来评价药物的抗氧自由基活
性。本实验采用邻苯三酚 -鲁米诺 ( luminol )-碳酸缓
冲液 ( pH 10. 2) ,邻菲罗啉 -Cu2+ -抗坏血酸 -H2O2 ,
H2O2-鲁米诺 ( luminol) -碳酸缓冲液 ( p H 9. 5) 3个
产生活性氧和化学发光体系 ,检测射干 Belamcanda
chinensis ( L. ) DC. 中 4种异黄酮单体成分清除
O2
÷ 、· OH和 H2O2的作用 ,为射干类中药筛选自由
基清除剂提供一条有效的途径。
1　仪器与试剂
1. 1　仪器: SHG-C生物化学发光测量仪 (上海上
立检测仪器厂 ) ,分析天平 (上海天平仪器厂 ) ,
PHS-25型酸度计 (上海雷磁仪器厂 ) ,旋涡混合器
(上海环宇仪器厂 )。
1. 2　试剂: 无水碳酸钠 (天津化学试剂厂 ,优级
纯 ) ,碳酸氢钠 (上海虹光化工厂 ,分析纯 ) ,乙二胺
四乙酸二钠 ( EDT A) (上海化学试剂总厂 ,标准
纯 ) ,焦性没食子酸 (邻苯三酚 ) (遵义第二化学厂 ,
分析纯 ) , 3-氨基邻苯二甲酰肼 (鲁米诺 , luminol,
Sigma公司 ) , NaH2 PO4· 2H2O (南京化学试剂厂 ,
分析纯 ) , Na2HPO4· 12H2O (上海试剂二厂 ,分析
纯 ) ,四硼酸钠 (硼砂 ) (太仓化工二厂 ,分析纯 ) , 1,
10-菲罗啉 (邻菲罗啉 ) (上海试剂三厂 ,分析纯 ) ,
CuSO4· 5H2O (合肥工大化学试剂厂 ,分析纯 ) ,
30% 过氧化氢 (上海桃浦化工厂 ,分析纯 )。
·640· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-09-21基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30170103) ; 江苏省自然科学基金资助项目 ( BK97085)
2　实验方法
2. 1　样品准备: 实验所用异黄酮野鸢尾苷元 ( ir-
genin,Ⅰ ) , 鸢尾苷元 ( tectorigenin,Ⅱ ) , 鸢尾苷
( tecto ridin,Ⅲ ) , 5, 6, 7, 4′-四羟基 -8-甲氧基异黄酮
( 5, 6, 7, 4′-tet rahydroxy-8-menthoxyisof lav one,
Ⅳ )均从射干 B. chinensis ( L. ) DC. 根茎中分离 ,
并经质谱、核磁共振、红外光谱等确定结构 , HPLC
法测定纯度均在 98% 以上。
2. 2　邻苯三酚 -鲁米诺 -碳酸缓冲液 ( p H 10. 2)体
系检测 O2÷清除能力:向测量管中加入 10μL待测
样品 (或 10μL甲醇作空白 ) ,再加入 1× 10- 3mo l /
L邻苯三酚溶液 20μL,放入反应池中。 原位注入
970μL鲁米诺 -pH 10. 2碳酸缓冲液混合液 ( 1∶ 2)
启动发光 (反应总体积为 1 mL) ,记录发光强度。
2. 3　邻 菲罗啉 -Cu2+ -抗坏 血酸 -H2O2体 系检
测· OH清除能力: 向测量管中依次加入 50μL待
测样品 (或 50μL甲醇作空白 ) , 1× 10- 3 mo l /L Cu-
SO4溶液 50μL, 1× 10- 3 mo l /L抗坏血酸溶液 20
μL, 1× 10- 3 mo l /L邻菲罗啉溶液 50μL, 0. 15 mo l /
L H2O2溶液 50μL,放入反应池中。 原位注入 780
μL pH 9. 24, 0. 05 mo l /L硼砂溶液启动发光 (反应
总体积为 1 mL) ,记录发光强度。
2. 4　 H2O2 -鲁米诺 -碳酸缓冲液 ( p H 9. 5) 体系检
测 H2O2清除能力:向测量管中加入 50μL待测样品
(或 50μL甲醇作空白 ) , 0. 15% H2O2溶液 50μL,
放入反应池中。原位注入 900μL鲁米诺 -( pH 9. 5)
碳酸缓冲液混合液 ( 1∶ 7)启动发光 (反应总体积
为 1 mL) ,记录发光强度。
2. 5　发光抑制率的计算:生物化学发光法测定自由
基时 ,一定浓度范围内发光强度 ( CL) 与自由基的
数量呈相关关系 ,故可用 CL表示自由基的产生量。
清除自由基的物质可以降低 CL,根据 CL下降可以
判断物质清除自由基的能力。
发光抑制率= (对照 CL-样品 CL) /对照 C L× 100%
以发光抑制率为纵坐标 ,样品浓度为横坐标 ,绘
出发光抑制曲线。一般用发光抑制率为 50% 时的
浓度 ( IC50 ) 来衡量样品对自由基的清除能力。 IC50
值越小 ,表明样品清除自由基的能力越强。
3　结果
　　射干根茎中分离得到的单体化合物清除自由基
作用见表 1,其中以Ⅱ对 O2÷ ,· OH和 H2O2清除效
果最好、活性最强 ,Ⅰ 对 H2O2清除能力很好 ,Ⅲ对
· OH清除能力也较强 ,Ⅳ对· OH也有清除作用。
4　讨论
　　从表 1、图 1和表 2可以看出 ,射干中分离出的
异黄酮类化合物清除自由基的能力和其结构相关 , A
环 8位碳上的甲氧基化和 7位碳上的 O糖苷化降低
了 O2÷和 H2O2自由基的清除能力 , B环 4′和 5′位碳
上的甲氧基化降低了· OH自由基的清除作用。
表 1　射干中异黄酮类化合物清除
自由基的作用 ( x± s , n= 2)
　 Table 1　 Scavenging eff ects of isoflavones
in B. chinensis on radicals ( x± s , n= 2)
化合物 自由基清除能力 IC50 / ( mg· mL
- 1 )
O2÷ · O H H2O2
野鸢尾苷元 2. 181± 0. 007 - 0. 365± 0. 121
鸢尾苷元 0. 380± 0. 021 0. 184± 0. 009 0. 263± 0. 032
鸢尾苷 - 0. 239± 0. 057 1. 687± 0. 135
5, 6, 7, 4′-四羟基-
8-甲氧基异黄酮 - 1. 259± 0. 036 -
　　“ - ”表示该化合物无清除此类自由基的作用
　　“ - ” indicate that th e compound has no ef fect on th e radical
表 2　射干中 4种异黄酮的结构
Table 2　 Structure of four isof lavones in B . chinensis
化合物 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7
野鸢尾苷元 H OCH3 O H OH OCH3 OCH3 H
鸢尾苷元 H OCH3 O H H O H H H
鸢尾苷 H OCH3 Og lu H O H H H
5, 6, 7, 4′-四羟基 -
8-甲氧基异黄酮 H H O H OH O H H OCH3
图 1　射干根茎中异黄酮母核结构
Fig. 1　 Structure of isof lavones
nucleus in rhizomes of
B. chinensis
　　实验中发现 ,异
黄酮类化合物具有较
好的清除自由基作
用。已有研究表明 ,黄
酮类化合物具有抗自
由基 [3, 4 ]、抗氧化、抗
菌、抗病毒、抗炎症等
多种生理活性及药理
作用 ,而射干类药物
相对于文献报道的其他一些含有黄酮类化合物的中
药 ,其整体清除自由基能力更强 ,其中鸢尾苷元
( tectorig enin)为很有开发前景的抗氧化剂。
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·641·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月