全 文 ：·药理实验与临床观察·
葡萄籽提取物原花青素诱导乳腺癌MCF-7 细胞脱落凋亡
韩　炯1 ,李　莹1 ,刘新平1,汪　云2,药立波1,俞　强3

( 1. 第四军医大学基础部 生物化学与分子生物学教研室, 陕西 西安　710032; 2. 西安市天行健天然生物制品有限公司,陕西
西安　710086; 3. 美国波士顿大学医学院肺研究中心,美国)
摘　要: 目的　检测葡萄籽提取物原花青素诱导乳腺癌 MCF-7 细胞脱落凋亡的作用。方法　采用 DNA ladder 检
测及软琼脂集落形成试验方法,观察乳腺癌 MCF-7 细胞对脱落凋亡的敏感性以及原花青素诱导其脱落凋亡的作
用。结果　M CF-7 细胞具有抗脱落凋亡的特性, 而 0. 1 mmol/ L 原花青素即可引起悬浮培养的 MCF-7 细胞凋亡。
表现为细胞染色质 DNA 断裂及软琼脂集落形成受阻。结论　原花青素可诱导乳腺癌 M CF-7 细胞脱落凋亡。
关键词: 葡萄籽; 原花青素; 肿瘤细胞; 脱落凋亡
中图分类号: R286. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 08 0722 04
Inducing effect of proanthocyanidin from seed of Vitis vinif era
on anoikis of breast cancer cells MCF-7
HAN Jiong
1
, L I Ying
1
, L IU Xin-ping
1
, WANG Yun
2
, YAO Li-bo
1
, YU Q iang
3
( 1. Depa rtment o f Biochemistr y and Molecular Biolog y, Four th M ilitary Medical Univer sity , Xian 710032,
China ; 2. Xian T ianxingjian Na tural Biolog ical Pr oducts Co . , L td, X ian 710086, China;
3. Resear ch Center of Pneumopat hy, Schoo l of Medicine, Boston Univer sity , USA )
Abstract: Object　T o study the induct ive ef fect o f proanthocyanidin f rom the seed of Vit is v inif er a L.
on anoikis o f breast cancer cells M CF-7. Methods　DNA laddering assay and sof t agar assay w er e used to
observe the sensit ivity o f MCF-7 cells to anoikis and the inductiv e ef fect of proanthocyanidins on anoikis.
Results　MCF-7 cel ls had the peculiar ity of anoikis resistance, and proanthocyanidins at concentrat ion of
0. 1 mmo l/ L could remarkably induce apopto sis of suspended MCF-7 cancer cells. The chromat in DNA
cleavage could be detected by agarose gel elect rophoresis and the cells po tential of forming colonies w as
suppressed. Conclusion　Proanthocyanidins f rom the seed of V . vinif era can induce ano ikis of the breast
cancer cell M CF-7.
Key words : seed of Vi tis vinif era L. ; pr oanthocyanidin; tumor cell; anoikis
　　正常来源的上皮或内皮细胞如果失去基质的支
持, 细胞会发生程序性死亡, 称之为脱落凋亡
( anoikis)。脱落凋亡的意义在于防止脱落的细胞种
植于其他地方继续生长。研究发现,很多肿瘤细胞从
瘤体上脱落后并不发生凋亡, 尤其是容易发生转移
的恶性肿瘤细胞, 可以迁徙到其他部位再次生长。这
种存在于某些肿瘤细胞的抗脱落凋亡现象, 被认为
是转移瘤发生的重要原因之一。因此,寻找能够诱导
具有抗脱落凋亡特性的肿瘤细胞发生脱落凋亡的药
物,对于肿瘤的治疗,尤其是转移瘤的治疗, 具有非
常重要的意义。本研究利用 DNA ladder 检测及软
琼脂集落形成试验方法, 观察葡萄籽提取物原花青
素对悬浮培养的乳腺癌 MCF-7 细胞的诱导凋亡作
用,为寻找抗肿瘤药物提供理论依据。
1　材料
1. 1　普通实验用材料: RPM I 1640 培养基购自德
国 Gibco 公司。新生牛血清购自杭州四季青生物制
品公司。琼脂粉购自北京百灵克公司 ( Sigma 分
装)。Poly-HEMA 购自美国 Sigma 公司。细菌培养
皿购自美国 Grainer 公司。其余细胞培养用耗材购
自荷兰 Nunc 公司,美国 Costar 及 Falcon 公司。
1. 2　药物:原花青素是由西安市天行健生物制品有
·722· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 8 期 2003年 8月

收稿日期: 2002-10-11基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30000067) ; 全军医药卫生重点资助课题 ( 01Z081)作者简介:韩　炯( 1970—) ,男,陕西西安人,讲师,博士,第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室博士生,主要从事肿瘤细胞信号转导及抗肿瘤药物的筛选。T el : ( 029) 3374516—11　E-mail: h an jon@ hotmail. com
* 通讯作者
限公司从葡萄 Vit is v inif er a L. 籽中提取而得, 纯
度大于 95%。用 DMSO 配成 50 mmol/ L 储存液,
分装, - 20 ℃ 保存。
1. 3　细胞系:乳腺癌 MCF-7 细胞系为本室保存。
狗肾脏上皮细胞系 MDCK 为美国波士顿大学医学
院医学与生物化学系俞强教授惠赠。细胞培养于含
10% 新生牛血清的 RPMI 1640培养基中。
2　方法
2. 1　细胞悬浮培养皿的准备[ 1] : 将 10 mg / mL 的
Po ly-HEMA 无水乙醇溶液 2 mL 加入直径 55 mm
细菌培养皿中,室温待其完全干燥,重复上述步骤一
次。使用前用 1×PBS 将平皿洗 4遍,置于超净台中
紫外照射消毒待用。
2. 2　细胞脱落凋亡特性的检测
2. 2. 1　DNA ladder 检测 [ 1] : 将培养的乳腺癌细胞
MCF-7 及阳性对照 MDCK 细胞分别用 0. 25% 的
胰蛋白酶进行消化, 制成约 0. 75×106/ mL 的单细
胞悬液。将 2 mL 细胞接种于 Po ly-HEMA 包被的
培养皿中,同时取 2 mL 接种于普通的细胞培养皿
中作为阴性对照。将细胞置于 37 ℃, 5% CO 2孵箱
中培养 15 h 后,分别离心收集细胞,加入 600
L 细
胞裂解液 ( 10 mmol / L T ris. Cl, pH 7. 6; 10
mmol/ L EDTA , pH 8. 0; 0. 5% T riton x-100) ,混
匀,冰浴 1 h 并间或振摇, 高速离心 5 min 后取上
清,分别用等体积 T ris 平衡酚、酚-氯仿各抽提一
遍,上清加入 2 倍体积的无水乙醇及终浓度为 0. 2
mmol/ L NaCl, - 20℃ 放置 1 h。高速离心 10 m in,
弃上清,加入 13
L T E ( pH 7. 4) 及 2
L RNase
( 10 mg/ mL) 充分溶解沉淀。0. 8% 琼脂糖凝胶电
泳,紫外灯下观察结果。
2. 2. 2　软琼脂集落形成实验:
制备底层琼脂:将
1% 琼脂粉凝胶微波炉化开后放置于 45 ℃ 水浴
中,温度平衡后与等体积 45℃ 预温的含 20% 新生
牛血清的 2×RPM I 1640 培养基混匀, 加入 6 孔板
中,每孔 4 mL,室温放置 1 h 以上,待其充分凝固。
剩余的琼脂粉-培养基混合物置于 42 ℃ 水浴中待
用。
制备顶层琼脂: 将 MCF-7 细胞及 MDCK 细
胞分别用 0. 25% 胰蛋白酶进行消化, 制备单细胞
悬液,并用正常培养基稀释到 2×103 / mL, 置室温
备用。取上述琼脂粉-培养基混合物 3. 0 mL 与 2. 0
mL 细胞悬液迅速混匀,取 2. 5 mL 铺于底层琼脂之
上,每个样品做一复孔。置室温待其充分凝固后,于
37 ℃, 5% CO2孵箱中培养两周,显微镜下观察集落
形成情况并计数。集落计数方法: 在镜下随机计数
10 个视野中的集落数, 取其平均数作比较。
2. 3　原花青素对悬浮培养的乳腺癌 MCF-7 细胞
的诱导凋亡作用
2. 3. 1　DNA ladder 检测:方法同 2. 2. 1。设立 3 个
样品组, 分别为空白悬浮对照组,悬浮加 DMSO 对
照组 (排除溶剂的影响) 以及悬浮加原花青素组。
原花青素的终浓度为 0. 1 mmol / L ,对照组 DMSO
的加入量与所加入的原花青素的溶剂量相当, 分别
于细胞接种后 12 h 加入。
2. 3. 2　软琼脂集落形成实验: 方法同 2. 2. 2。设
立 3个样品组, 分别为空白对照组, 加 DMSO 对
照组以及加原花青素组。原花青素的终浓度为
0. 1 mmo l/ L , 对照组 DMSO 的加入量与所加入的
原花青素的溶剂量相当,分别于细胞接种后 12 h
加入。
3　结果
3. 1　乳腺癌 MCF-7 细胞具有抗脱落凋亡的特性:
悬浮培养的 MCF-7 细胞相互之间聚集成比较致密
的团块,散在的细胞很少。相反,悬浮培养的 MDCK
细胞基本呈散在形式,所形成的细胞团也很小,并且
很疏松, 见图 1。DNA ladder 检测的结果显示悬浮
培养的 MDCK 细胞出现了凋亡特有的染色体
DNA 断裂,琼脂糖凝胶电泳显示有特征性的 DNA
ladder 出现。而悬浮培养的 MCF-7 细胞则没有这
种现象, 见图 2。软琼脂集落形成实验则显示,阳性
对照 MDCK 细胞无法在软琼脂上生长, 无细胞集
落形成; 而 MCF-7细胞则在软琼脂中生长良好, 镜
下可见有多个细胞集落, 见表 1。
A -贴壁细胞　B-悬浮培养细胞
A -at tached cell s　B-suspen ded cells
图 1　细胞脱落后的形态学表现
Fig. 1　Cytomorphological changes of cells suspended
·723·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 8 期 2003年 8月
表 1　原花青素对 MCF-7 细胞软琼脂集落
形成能力的影响 ( x±s, n= 10)
Table 1　Effect of proanthocyanidin on MCF-7
cells potential of forming colonies
in sof t agar ( x±s, n= 10)
组　别 剂量/ ( m mol·L- 1) 细胞集落数/ (个·视野- 1)
阴性对照 - 　　11. 5±2. 17
DM SO 对照 0. 4% 10. 8±1. 93
原花青素 0. 1 0. 2±0. 42*
　　与阴性对照组及加 DMSO 组比较: * P< 0. 01
　　* P < 0. 01 v s cont rol ad ded DM SO g rou ps
a-贴壁细胞　s-悬浮培养细胞
a-at tached cell s　s-suspended
cell s
图 2　细胞脱落后 DNA
ladder 检测
Fig. 2　DNA ladder assay
of cells suspended
3. 2　原花青素诱导乳腺
癌 MCF-7 细胞脱落凋亡
的作用: 在悬浮培养的乳
腺癌 MCF-7 细胞中加入
终浓度为 0. 1 mmol/ L 的
原花青素, 可见到多数细
胞失去了聚集成细胞团的
能力, 表现为单个散在分
布,见图3。DNA ladder 检
测则显示原花青素可诱导
悬浮培养的 MCF-7 细胞
凋亡, 表现出特征性的
DNA ladder,见图 4。
　　软琼脂集落形成实验
结果显示, 0. 1 mmo l/ L 原
花青素可明显抑制 MCF
图 3　悬浮培养的MCF-7 细胞加入原花青素后的形态学表现
Fig. 3　Cytomorphological changes of suspended MCF-7
cell treated with proanthocyanidin
-7细胞在软琼脂中的生长,其形成集落能力与对照
组相比显著下降,镜下每个视野中的细胞集落明显
少于对照组, 而 DMSO 则对细胞在软琼脂中的生长
无明显影响, 见表 1。
4　讨论
天然植物药以其疗效广泛、确切、毒性低,受到
国内外广泛的关注。近年来,关于中草药抗癌作用机
S-悬浮培养阴性对照
S+ D-悬浮培养加等
量 DMSO 对照　S+
P-悬浮培养加终浓度
为 0. 1 mmol / L 原花
青素
S-suspended cell as
negative cont rol　S+
D-supended cell w ith
DMSO as con trol　S
+ P-su spended cell
w ith 0. 1 mm ol / L as
f inal con cen tr at ion of
proanthocyanidins
图 4　DNA ladder
检测原花青素对悬
浮培 养的 MCF-7
细胞诱导凋亡作用
Fig. 4 　 Inducing-
apoptosis ef fect of
proanthocyanidins
detected by DNA
ladder assay on
MCF-7 cells
制的研究不断发展。一些中草药
复方或单味药的有效成分具有
诱导肿瘤细胞的凋亡的作用, 例
如莪术的提取物榄香烯、龙葵等
茄科植物的提取物澳洲茄边碱
以及桦木酸、丹参、姜黄素、儿茶
素、紫杉醇、槲皮素等植物药成
分均可诱导肿瘤细胞凋亡 [ 2]。原
花青素是一类多酚类化合物的
总称, 广泛存在于多种植物中,
尤其在葡萄籽及葡萄皮中含量
较高。因其在酸性介质中加热后
均可得到花青素 ( cyanidins) , 故
此而得名。科学实验证明, 原花
青素是一种强抗氧化剂, 其抗氧
化能力是维生素 C 的 20 倍, 维
生素 E 的 50倍,因此在抗衰老、
预防心脑血管病方面有广泛的
应用前景。在肿瘤的预防及治疗
方面,可能通过改变致癌物的代
谢过程而减少肿瘤的发生 [ 3]。另
外的研究则发现原花青素只对
某些肿瘤细胞有细胞毒作用而
对正常细胞有促进生长及存活
的作用[ 4]。
本研究初步检测原花青素
诱导乳腺癌 MCF-7 细胞脱落凋
亡作用。结果发现 0. 1 mmol/ L
原花青素可诱导悬浮培养的乳
腺癌 MCF-7 细胞发生凋亡, 表
现为悬浮培养性状的改变, 在原
花青素存在时,肿瘤细胞由原来
的聚集成团变为单个散在, 这一
现象的发生可能是肿瘤细胞黏
附分子表达水平下降的结果[ 5]。
而细胞之间相互聚集似乎正是肿瘤细胞在悬浮培养
时与正常上皮细胞相区别的形态学特征之一。这一
特性的失去可能是原花青素诱导悬浮培养乳腺癌细
胞发生凋亡机制之一。原花青素诱导乳腺癌 MCF-7
细胞脱落凋亡作用还表现在细胞染色质 DNA 断
裂, 琼脂糖凝胶电泳呈现特性的 DNA ladder 以及
在软琼脂中形成集落的能力显著下降。这些结果均
提示原花青素可直接诱导肿瘤细胞发生脱落凋亡,
但其作用机制有待进一步研究。
·724· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 8 期 2003年 8月
References:
[ 1]　Wei L , Yang Y, Yu Q. Tyr os ine kinase-dependent PI3-kinase
an d mitogen-act ivated protein -k inase-in dependent signaling
pathways prevent lung ad enocarcinoma anoikis [ J] . Cancer
Res, 2001, 61: 2439-2444.
[ 2]　Zh ou Z H , Song M Z, Yu E X, et al . Progres s on apoptosis
induction of cancer cells by Chinese tradit ional herbs [ J ] .
Foreig n Med S ci—Tr adi t Chin Med (国外医学·中医中药分
册) , 1998, 20( 3) : 3-6.
[ 3]　Sun Z G, Zhao W Z, Lu Y, et al . Inh ibitory effect s of
proan th ocyanidins f rom the s eed of Vi tis v inif er a on forming
of m icronucleus of mouse bon e marrow polys om ic red blood
cel ls induced by cyclophosph amide and study of it s mecha-
nism [ J ] . L i shi z hen Med Mater Med Res ( 时珍国医国药) ,
2000, 11( 5) : 386-387.
[ 4]　Ye X, Kr oh n R L, Liu W , et al . T he cytotox ic ef fect s of a
novel IH636 grape s eed p roanthocyanid in ext ract on cultured
h uman cancer cells [ J ] . Mol Cel l Biochem, 1999, 196( 1-2) :
99-108.
[ 5]　S en C K, Bagch i D. Regu lat ion of inducible ad hes ion mo-
lecule express ion in human endoth elial cell s by grape seed
proanthocyanidin ext ract [ J] . Mol Cel l Biochem, 2001, 216
( 1-2) : 1-7.
红花黄色素 A 在大鼠体内的药动学研究
刘月庆,李　康, 毕开顺

(沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳　110016)
摘　要: 目的　研究红花黄色素 A 在大鼠体内的药动学。方法　建立 RP-HPLC 法定量测定大鼠血浆中红花黄色
素 A 含量。色谱条件:色谱柱为 Hypersil ODS2 柱( 200 mm×4. 6 mm , 5
m) ; 流动相为甲醇-0. 2% 乙酸水溶液
( 24∶76) ;流速为 0. 8 mL / m in;核黄素为内标; 检测波长为 410 nm。健康大鼠禁食 24 h 后, 尾 iv 红花黄色素 A 生
理盐水溶液,测定不同时间的血药浓度。用 3P87 药动学程序对血药浓度-时间数据进行拟合。结果　大鼠 iv 红花
黄色素 A 后, 其主要药动学参数为: V c( 0. 30±0. 04) L / kg, CL ( 1. 12±0. 33) mL / mim, K e ( 0. 91±0. 19) h- 1, t1/ 2
( 0. 76±0. 10) h,曲线下面积 A UC ( 24. 97±4. 83) (
g·h) / mL。结论　红花黄色素 A 在大鼠体内呈一室开放模
型, 进入体内迅速分布,代谢消除也较快。
关键词: 红花黄色素 A; 反相高效液相色谱; 药动学
中图分类号: R286. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 08 0000 00
Pharmacokinetics of safflower yellow A in rats in vivo
LIU Yue-qing , LI Kang , BI Kai-shun
( School of Pharmacy , Shenyang Pharm aceutical Univ ersity, Shenyang 110016, China)
Abstract: Object　To study the pharmacokinet ics of saf flow er yellow A , a major ing redient in the
cr ude drug o f Car thamus tinctorius L. , in r ats in v ivo. Methods　RP-HPLC method w as set up used to de-
term ine the content of saf flow er y el low A in plasma of rat . The chromatog raphic condit ion included Hyper-
sil ODS2 column ( 200 mm×4. 6 mm , 5
m) ; the mobile phase consist ing of methano l-0. 2% acet ic acid
( 24∶76) ; the f low rate at 0. 8 mL/ min; the detect iv e w aveleng th at 410 nm. Ribof lavin was used as inter-
nal standard. Saff low er yellow A was injected into the rats through caudal vein, and its concentrat ions at
dif ferent time w ere determ ined in healthy rat af ter 24 h fast ing . The data were pr ocessed w ith the sof tw are
3P87. Results　The primary pharmacokinet ic parameter s were: V c( 0. 30±0. 04) L / kg , CL ( 1. 12±0. 33)
mL/ m in, K e( 0. 91±0. 19) h- 1 , t 1/ 2( 0. 76±0. 10) h, A UC ( 24. 97±4. 83) (
g·h) / mL, r espect ively in iv
saf flow er y ellow A to the rats. Conclusion　The saf flow er y ellow A in rats is f ited to one-compartment
model, and it is dist ributed and eliminated quickly.
Key words : saf f low er yellow A; RP-HPLC; pharmacokinet ics
　　红花系菊科红花属红花 Carthamus tinctorius
L. 的干燥花,是活血化瘀的传统中药。其活血通经、
祛瘀止痛功效在中药中具有一定的代表性。在现代
医学中是预防和治疗冠心病、心肌梗死和脑血栓等
中老年疾病的重要中药。研究表明,红花中起活血化
瘀作用的主要成分是红花黄色素[ 1, 2]。红花黄色素的
·725·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 8 期 2003年 8月

收稿日期: 2002-11-29作者简介:刘月庆( 1973—) ,男,安徽怀宁人,沈阳药科大学药物分析专业 2000 级研究生,研究方向:中药质量标准化研究。
* 通讯作者　Tel: ( 024) 2384371-3363　E-mail : ksbi@ mail. sy. ln. cn