全 文 ：·药材·
三种内生真菌对铁皮石斛、金线莲生长影响的研究
高微微 ,郭顺星
(中国医学科学院 协和医科大学药用植物研究所 ,北京 100094)
摘 要: 目的 研究开唇兰小菇、石斛小菇、兰小菇等 3种小菇属内生真菌对兰科濒危药用植物铁皮石斛、金线莲
生长的促进作用。方法 采用植物无菌原球茎及试管苗与真菌进行双重培养 ,观测原球茎增殖及苗的生长情况。结
果 接种 3种内生真菌后 ,铁皮石斛苗的生长量高于对照 3～ 5倍 ,石斛小菇、兰小菇对铁皮石斛原球茎增殖也有
明显促进作用 (P < 0. 05) ;接种 3种真菌的金线莲苗 ,侧芽及侧根数均显著高于对照。结论 3种小菇属内生真菌
能够促进铁皮石斛幼苗生长 ,促进金线莲侧芽及侧根的萌发 ,对铁皮石斛、金线莲的成功栽培具有实际应用价值。
关键词: 内生真菌 ;铁皮石斛 ;金线莲 ;生长
中图分类号: R282. 21 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2002) 06 0543 03
Effect of three endophytic fungi on growth of Dendrobium candidum and
Anoectochilus roxburghii
GAO Wei-w ei, GUO Shun-xing
( Institute o f Medicinal Plant Development, Chinese Academy of M edical Sciences and
Peking Union Medical Co lleg e, Beijing 100094, China)
Abstract: Object To study th e promo ting effects of Mycena anoectochila, M. dendrobii and M. or-
chidicola on g row th of Dendrobium candidum Wall. ex Ldl. and Anoectochilus ro xburghii ( Wal l. ) Ldl.
Methods The pro toco rm and plant let o f D. candidum and A. roxburghii were g row n in dual culture w ith
endophytic fungi to observ e the prolifera tion of pro to co rm and the g row th of plant let. Results The
g row th of plantlet o f D. candidium , w hich w as inocula ted three endophytic fungi , increased ma rkedly 3-5
times mo re than those of the contro l one. M . dendrobii and M. orchidicola also promo ted multiplication on
pro tocorm of D. candidum (P < 0. 05) . Af ter inocula ted three endophy tic fungi , the prolifera tion of plant-
let , new buds and lateral roo ts o f A . roxburghii are get ting more than those o f the contro l one. Conclusion
Three endophy tic fungi , M. anoectochila, M. dendrobii , and M. orchidicola , could promo te the pla telet
g row th of D. candidum and increase the number of buds and roots o f A . roxburghii . It has g reat v alue fo r
culture o f D. candidum and A. roxburghii.
Key words: endophytic fungi; Dendrobium candidum Wall. ex Ldl. ; Anoectochilus roxburghii
(W all. ) Ldl. ; g row th
铁皮石斛 Dendrobium candidum Wall. ex
Ldl. 和金线莲 Anoectochilus roxburghii Wall. Ldl.
均为我国珍贵的兰科药用植物 ,由于长期掠夺性采
挖 ,野生资源遭到严重破坏 ,现已被列为国家重点保
护的珍稀濒危物种。由于兰科植物种子细小 ,萌发困
难 ,同时无性繁殖系数低 ,加上其生长发育需特殊的
生态环境 ,给此类药材大面积栽培造成很大困难。我
国已陆续报道了铁皮石斛、金线莲人工试管繁殖方
面的研究结果 [1～ 4 ] ,但试管苗出瓶问题一直没有得
到很好解决。在自然界中 ,几乎所有的兰科植物均与
真菌共生 ,依赖共生真菌为其提供营养。本文选择 3
种兰科植物的内生真菌 ,通过与无菌试管苗的双重
培养 ,研究共生真菌对铁皮石斛和金线莲生长的促
进作用 ,为开辟铁皮斛、金线莲人工栽培的新途径奠
·543·中草药 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs 2002年第 33卷第 6期
收稿日期: 2001-08-06
基金项目:高等学校全国优秀博士学位论文作者专项基金 ( 199950) ;国家自然科学基金 ( 39970018) ;高等学校博士点学科点专项科研基
金资助项目 ( 1998002337)
作者简介:高微微 ( 1963-) ,女 ,北京人 ,中国医学科学院协和医科大学药用植物研究所副研究员 ,硕士生导师 ,研究方向为中药新药研究
与开发。
* 通讯作者
定基础。
1 材料与方法
1. 1 植物材料: 铁皮石斛 D. candidum、金线莲
A. roxburghii均为通过组织培养得到的原球茎及
无菌试管苗。铁皮石斛苗株高 0. 7～ 1 cm ,金线莲苗
株高 2～ 3 cm。
1. 2 实验用菌: 03号菌为开唇兰小菇 Mycena
anoectochila, 05号菌为石斛小菇 M. dendrobii , 17
号菌为兰小菇 M. orchidicola,均为本实验室分离
鉴定。 使用之前先接种在平皿麦麸培养基上活化培
养 7～ 10 d,待长满后用于共生培养。
1. 3 植物及真菌双重培养基: 1. 0% 琼脂+ 1 /4
M S+ 0. 7% 蔗糖 ,装入 100 mL三角瓶 ,每瓶 40
m L, 120℃ 灭菌。
1. 4 内生真菌与植物的共生培养:将铁皮石斛、金
线莲的无菌试管苗垂直接种到双重培养基上 ,铁皮
石斛每瓶 2丛苗 ,每丛 5～ 10棵聚集在一起 ,苗丛
基部有部分原球茎 (团块直径 0. 5 cm) ,金线莲每瓶
3株苗 ,同时 ,将在平皿麦麸培养基上活化好的 3种
真菌 ,用打孔器打成大小相同的菌片 ,接种在距离苗
1. 5 cm处 ,石斛每个处理重复 5瓶 ,金线莲每个处
理重复 3瓶 , 25℃ ,每日光照 12 h条件下培养 ,定
期观察并记录苗和菌的生长情况 ,数据进行统计
分析。
2 结果
2. 1 内生真菌对铁皮石斛生长的影响: 结果见表
1。双重培养基上的 3种真菌以 17号菌生长最快。
在 7 d时 , 05号菌和 17号菌生长的菌丝已接触到
苗 ,这两个处理组的石斛苗生长量分别是对照的
3. 13和 5倍 ,其中 ,接种 05号菌的石斛原球茎增殖
了 1. 66倍 ,而对照原球茎无增殖 ; 03号菌 与苗之
间尚有一段距离 ,但接种 03号菌的石斛原球茎明
显增殖 ,苗的生长高于对照 3倍。 至第 35天时 ,对
照原球茎增殖明显 ,植株开始生长 ,而接种 3种菌
的未成苗的原球茎大部分被菌丝覆盖 ,不能继续增
殖 ,细胞破裂、死亡。此时 , 03号菌和 17号菌明显促
进已发育成苗的植株生长 ;接种 05号菌和 17号菌
新增苗数显著高于对照 ,说明这两种菌对试管苗的
分化有促进作用。
2. 2 内生真菌对金线莲生长的影响: 3种真菌对金
线莲苗生长的影响结果见表 2。接种 03号菌 (开唇
兰小菇 )、 05号菌 (石斛小菇 )的金线莲苗新芽、新
根的萌发数均显著高于对照。 接种内生菌的金线莲
苗 ,叶片大而伸展 ,茎粗明显高于对照 ,相比之下 ,对
照苗叶片小而卷曲 ,茎纤细 ,生长不如接菌苗健壮 ,
说明 3种菌均有壮苗的作用。05号菌促进侧芽增殖
的同时仍有壮苗作用 , 17号菌使茎增粗的原因与植
株生长量低是否有关尚待进一步研究。
表 1 3种内生真菌对铁皮石斛原球茎增殖及苗生长的影响
菌 株
7 d 35 d
苗平均增高
( mm)
新增苗数 原球茎增殖倍数
苗平均增高
( mm )
新增苗数 原球茎增殖倍数
对照 0. 40 0 0 1. 00 5. 00 1. 00
03 1. 20 0 0. 86 3. 20* 3. 33 0. 00
05 1. 25* 0 1. 66 1. 25 13. 33* 0. 00
17 2. 00* 0 0 2. 22* 10. 00* 0. 00
与对照组比: * P < 0. 05;原球茎增殖倍数 = 现原球茎团块的直径 -接种原球茎团块的直径 /接种原球茎团块的直径
表 2 3种内生真菌对金线莲茎芽增殖及生长的影响
菌 株
15 d 35 d
苗增高 /株
( cm)
新增芽数 /株 新根数 /株 苗增高 /株
( cm)
新增芽数 /株 新根数 /株 茎粗
( mm )
对照 0. 60 0 0 1. 00 5. 00 0 1. 2
03 0. 17* 0 0. 08 0. 70 0. 38 0. 15 1. 5
05 0. 00 0 0. 17 0. 23* 0. 33 0. 17 2. 3*
17 0. 33 0 0 0. 34* 0. 07 0 3. 0*
与对照组相比: * P < 0. 05
3 讨论
3. 1 双重培养: 实验所用的 3种小菇属真菌分别
分离自不同的兰科植物根 ,开唇兰小菇 ( 03)来自金
线莲 ,石斛小菇 ( 05)来自铁皮石斛 ,兰小菇 ( 17)
来自墨兰 ,郭顺星等鉴定并命名 [5, 6 ] ,范黎等报道了
兰小菇能够促进兰科植物种子萌发 [7 ]。有关内生真
菌促进兰科植物种子萌发的研究较多 [ 8, 9] ,对抽出绿
叶的兰苗的作用尚未见报道 ,我们通过反复试验 ,建
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立了兰科植物无菌试管苗与内生真菌双重培养方
法 ,使植物与有益真菌在一段时间内共同生长。实验
证明 ,这是一个研究内生真菌与兰科植物苗之间相
互作用的良好体系。
3. 2 3种菌对铁皮石斛生长的作用:在实验室的双
重培养条件下 , 3种内生真菌早期表现出对铁皮石
斛有促生长作用 ,此时 03号菌尚未接触到石斛苗 ,
已表现出对石斛原球茎增殖及苗的生长有明显促进
作用 ,原因可能是菌的代谢产物对石斛有一定的作
用。张集慧等 [10 ]从开唇兰小菇、石斛小菇和兰小菇
发酵液的乙酸乙酯萃取部分中分离出了 5种植物
激素 ,产生植物激素也是真菌促生长的机制之一。后
期菌丝生长旺盛 ,侵入原球茎后造成原球茎死亡 ,促
生长作用减弱 ,并有死苗现象 ,说明共生促生长是有
条件和相对的。
3. 3 3种菌对金线莲生长的作用: 金线莲的接种材
料 为单株试管苗 , 在不接种菌时 ,没有侧芽和侧根
萌出 ,接种 03或 05菌后 ,则明显有新侧芽和侧根萌
出 ,我们认为与菌产生激素有关。接种菌的金线莲苗
生长量均明显低于对照 ,原因可能是培养瓶中的营
养有限 ,菌生长消耗了部分营养 ,从而影响了植株的
生长。
大量研究已经证明 ,兰科植物与菌根真菌之间
的关系不是高度专一的 ,铁皮石斛和金线莲为两种
不同属、不同生态型的植物 , 3种菌对两种植物均有
促生长作用 ,说明它们对兰科植物的生物活性没有
明显的种属专化性 ,对这些内生菌的利用 ,无疑为促
进铁皮石斛及金线莲试管苗移载成活 ,提供了更多
的机会 ,也为其它兰科植物的栽培 ,提供了新途径。
参考文献:
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产生的植物激素 [ J ] . 中国医学科学院学报 , 1999, 21 ( 6):
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厚朴的任意引物 PCR指纹图谱分析
苏应娟 1 ,朱建明 1 ,王 艇 1* ,李雪雁 1 ,曾庆文 2 ,夏念和 2
( 1. 中山大学生命科学学院 ,广东 广州 510275; 2. 中国科学院华南植物研究所 ,广东 广州 510520)
摘 要: 目的 鉴别中药材厚朴、凹叶厚朴及其常见的伪品和混淆品。 方法 采用任意引物 PC R ( a rbit rarily
primed PCR, AP-PCR)技术扩增植物基因组 DN A样品。 结果 AP-PC R技术获得清晰可靠的 DNA指纹图谱 ,
根据琼脂糖凝胶上显示的 DN A带型差异可迅捷地区分厚朴、凹叶厚朴及其伪品、混淆品。结论 为应用 AP-PC R
技术在分子水平上鉴别中药材厚朴 ,保证引种的准确性奠定了基础。
关键词: 中药材 ;厚朴 ; AP-PCR
中图分类号: R282. 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2002) 06 0545 04
Fingerprint of arbitrarily primed polymerase chain reaction ( AP-PCR)
forMagnolia off icinalis
SU Ying-juan1 , ZHU Jian-ming1 , WANG Ting1 , LI Xue-yan1 , ZEN G Qing-w en2 , X IA Nian-h e2
( 1. School of Life Sciences, Sun ya t-set Univ ersity, Guang zhou Guangdong 510275, China; 2. South
China Institute o f Bo tany, Chinese Academy of Sciences, Guang zhou Guangdong 510520, China )
Abstract: Object To identify Magnol ia of f icinal is Rehd. et Wils. and M . biloba Rehd. et Wils. as
w ell a s thei r counterfei t s and easi ly confusable substitutes. Methods To tal genomic DN A samples of ten
·545·中草药 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs 2002年第 33卷第 6期
收稿日期: 2001-08-06
* 通讯作者