全 文 ：·药理实验与临床观察·
菊花倍半萜烯内酯诱导人鼻咽癌细胞毒性和凋亡的研究
林忠宁 1 ,林育纯 1 , SHEN Han-ming2 , YAN G Cheng-feng2 , ONG Choon-nam2
( 1. 中山大学公共卫生学院 ,广东 广州　 510089; 2. Depa rt o f Community , Occupationa l and Family Medicine, Faculty of
Medicine, MD3, Na tiona l Univ ersity o f Singapo re, Singapo re 117597)
摘　要: 目的　评价菊花倍半萜烯内酯类化合物 ( SLs) 对鼻咽癌的抗肿瘤作用。 方法　采用 SLs 的活性成分
pa r theno lide ( PN )为受试物作用于人鼻咽癌高分化细胞株 CN E1,检测细胞毒性和诱导性凋亡指标 ,进行时间 -效
应和剂量 -效应作用观察。结果　 10～ 100μmol /L的 PN作用 6～ 36 h后与阴性对照组比较 , CNE1细胞乳酸脱氢
酶 ( LDH) 漏出率明显增加、细胞计数减少、细胞增殖抑制率升高 (P < 0. 05) ;细胞出现凋亡特征形态学改变 ,
TUNEL阳性细胞、 Sub G1亚群细胞百分数增加 ,细胞失贴壁率明显增高 (P < 0. 05) ;上述指标与 PN剂量存在明
显相关 (P < 0. 05)和时间循序变化。结论　 PN可通过对人鼻咽癌细胞毒性作用和诱导细胞凋亡发挥其抗肿瘤作
用 ,提示 PN具有化学预防意义。
关键词: 倍半萜烯内酯 ;鼻咽肿瘤 ;抗肿瘤作用 ;细胞凋亡
中图分类号: R979. 1; R739. 63　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 10 0909 04
Study of sesquiterpene lactones in plants of chrysanthemum on inducible cytotoxicity
and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma
LIN Zhong-ning
1 , LIN Yu-chun
1 , SHEN Han-ming
2 , YAN G Cheng-feng
2 , ONG Choon-nam
2
( 1. School of Public Health, Sun Ya t-sen Univ er sity , Guang zhou 510089, China; 2. Depar tment of Community,
Occupa tional and Family Medicine, Faculty o f Medicine, MD3, Na tiona l Univ ersity o f Singapo re, Singapo re 117597)
Abstract: Object　 To investig ate the po tential antitumor ef fects of sesquiterpene lactones ( SLs) in
the plants of ch rysanthemum on human nasopha ryngeal carcinoma ( N PC) . Methods　 Parthenolide ( PN) ,
the activ e component of SLs, wa s used as tested substance and exposed to N PC cell line CN E1. Cell toxici-
ty and apopto sis indexes w ere determined a t time-ef fect and do se-ef fect study. Results　 Compared w ith
negativ e contro l, there w ere signi ficant ly increasing o f lacta te dehydrogenas LDH leakage and cell prolifer-
ation inhibi tion ra tio as w ell a s remarkable decrease in cel l number, respectiv ely in PN g roups t rea ted w ith
10-100μmol /L PN for 6-36 h ( P < 0. 05) . There w ere high levels o f TUN EL posi tive cell and SubG1 of
cell cycle percentag e, and significant increase in cell detachment ratio (P < 0. 05) , w hi le coupled wi th the
cha racteristic apopto tic mo rpholog y changes in PN treated g roups. The above indexes show ed evident rela-
tiv e PN dose (P < 0. 05) and ci rculatory changes in time o rder. Conclusion　 It indica tes that PN could in-
duce cy to to xici ty and apopto sis in exposed CN E1 cell, which co rrela ted wi th i ts anticancer and chemopre-
vention ef fects on N PC.
Key words: sesqui terpene lactones; nasopharyngeal carcinoma ( N PC) ; antitumor effects; apoptosis
　　一些芳香类草本植物如菊花等含有倍半萜烯内
酯类化合物 ( sesqui terpene lactones, SLs) ,长期以
来被传统中医药学用于发热、关节炎和偏头痛等的
治疗 [1 ]。现代研究证实 SLs的主要生物活性成分是
parthenolide ( PN) ,从欧洲艾菊 ( feverfew )等提取
的 PN可抑制血小板释放 5-羟色胺、抑制白三烯 B4
和血栓恶烷 B2的生成 ;近来已有关于 PN应用的
文献报道和二项美国专利局登记 [ 2] ;最近的研究还
证实 PN能提高人乳腺癌细胞对化疗药物的敏感
性 [3 ]。鼻咽癌 ( nasopha ryngeal carcinoma , N PC)在
广东地区的发病率之高尤为突出 ,是广东省重点防
治的恶性肿瘤之一 ,因此筛选具有抗肿瘤作用的天
然药物用于开展 N PC的化学预防具有重要的意
义。本研究采用 PN作为 SLs的受试物作用于人鼻
·909·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 10期
收稿日期: 2002-03-13基金项目:国家自然科学基金资助 ( No. 30070649) ;广东省自然科学基金资助 ( No. 001369) ;中华医学基金会 ( CMB)基金资助项目作者简介:林忠宁 ( 1968-) ,男 ,福建惠安人 ,讲师 ,硕士 ,研究方向环境毒理学 , 2000年前往新加坡国立大学开展肿瘤病因和化学预防研究。 Tel:
( 020) 87331596; E-mai l: lin zn@ gzsums. ed u. cn
咽癌细胞株 ,探讨其对 N PC的抗肿瘤作用。
1　材料
1. 1　细胞株: 人鼻咽癌高分化细胞株 CN E1由中
山医科大学肿瘤研究所提供。传代培养后取第 10～
40代细胞用于本研究。
1. 2　受试物:倍半萜烯内酯类化合物 parthenolide
( PN ) , C15 H20O3 ,相对分子质量 248. 3,分子结构见
图 1, Sigma公司产品 ,从欧洲艾菊 ( fev erfew )等提
取 ,纯度≥ 90%。溶于二甲基亚砜 ( DM SO, Sigma)
配制成 100 mmol /L贮存液 , - 30℃ 保存 ,临用时
现加入培养体系中达到所需终浓度 ,其中 DM SO终
浓度均低于 0. 025% 。
图 1　 parthenolide
分子结构图
1. 3　试剂: RPM I1640培养基、
青 -链霉素 ( P& S)、 0. 25% 胰酶:
Gibco BRL公司产品 ;胎牛血清
( FBS): HyClond公司产品 ; DM-
SO、肿瘤坏死因子-α ( TN F-α)、
放线菌素 D ( ActD)、噻唑蓝
( M TT)、碘化丙啶 ( PI): Sigma
公司产品。 TUN EL分析 (荧光标记 )试剂盒: Roche
公司产品 ;特异性乳酸脱氢酶 ( LDH)诊断试剂盒:
Abbot t Labo rato ries产品。
1. 4　仪器: 流式细胞仪: Coul ter Epics Elite ESP;
紫外可见分光光度计: UV 1600, SHIMUDZU,日
本 ;自动生化测定仪: Abbot t V P,法国 ;超声细胞破
碎仪: MicrosonTM ,美国 ;全自动酶标仪: Model
3550, BIO-RAD;激光扫描共聚焦荧光显微镜系
统: SM 410, Zeiss;低温离心机: Eppendof;低温高速
离心机: Sigma;层流超净工作台 ;恒温 CO2培养箱:
SAN YO,日本 ;显微镜: Olympus,日本。
2　方法
2. 1　细胞培养和处理: 在含 10% FBS、 1 000 U /
m L青霉素和 100 mg /L链霉素的 RPM I1640完全
培养基 ( CM )中传代培养 ;胰酶消化后 ,取细胞 (活
性> 95% )置于 37℃、 5% CO2饱和湿度培养过夜至
80% 细胞融合。分组给予如下受试物处理:阴性对
照组加等量培养基 ;阳性对照组为 ActD (终浓度 5
mg /L)预处理 30 min后加入 TN F-α (终浓度 15
μg /L ) ; PN作用组加入 PN 贮存液至终浓度为
10～ 100μmol /L进行剂量 -效应关系观察。 各组按
设计分别作用不同时间后检测如下指标进行时间 -
效应关系观察。
2. 2　细胞毒性指标检测
2. 2. 1　 LDH漏出率 [LDH leakage(% ) ]测定:按
Shen HM等报道方法用试剂盒在自动生化测定仪
上测定 [4 ]。 具体操作: 2× 105细胞置 24孔培养板
( N UNC公司 )处理 1～ 24 h后 ,取培养基 100μL
用于测定漏出细胞外 LDH ( eLDH) ,然后超声裂解
细胞 , 4 000 r /min离心 ( 4℃ )后取上清测定细胞
总 LDH ( tLDH)。结果计算 LDH漏出率。
LDH漏出率 (% ) = eLDH /tLDH× 100%
2. 2. 2　细胞增殖功能测定:采用噻唑蓝颜色反应法
( M T T法 )略为改进 [5 ]。 105细胞置 96孔培养板
( NUN C公司 )处理 ,终止前 4 h加 M TT ( 5 g /L )
继续培养 ,至加入细胞裂解缓冲液 ( 50% DM F,
20% SDS, pH4. 6)终止反应。用全自动酶标仪读取
λ595 nm吸光度值 ( A ) ,计算肿瘤细胞增殖抑制率。
抑制率 (% ) = 100- 处理组 A /阴性对照组 A×
100% 。根据 Bloiss法计算剂量效应作用的半数抑
制浓度 ( IC50 )。
2. 2. 3　细胞计数:上述细胞毒性检测的同时 ,平行
进行细胞计数 ,进行细胞生长情况观察。
2. 3　细胞凋亡指标检测
2. 3. 1　 TUN EL分析: 106细胞置 25 cm2培养瓶
( N UN C公司 ) 处理 12, 24, 36 h后 ,刮取细胞 ,用
TUN EL试剂盒荧光标记细胞 ,流式细胞仪检测
10 000个细胞 ,用 WinMDT2. 3软件分析 ,记录阳
性细胞频数和分布直方图 ,测得 TUNEL阳性细胞
百分数 (% )。每份样本均用共聚焦显微镜同时平行
检测确定阳性细胞 ,观察细胞标记状态和形态 ,并拍
摄成像。
2. 3. 2　细胞失贴壁率 (% )测定: 基于本研究中
TUN EL分析和共聚焦分析结果发现失贴壁细胞几
乎均为 TUN EL阳性细胞 ,参照文献测定处理 24 h
后失贴壁细胞百分率。失贴壁细胞百分率 (% )= 失
贴壁细胞数 /总细胞数× 100% ,作为凋亡测定的定
量参数之一。
2. 3. 3　 SubG1亚群细胞 (% )测定: 106细胞置 25
cm
2培养瓶处理 36 h后 ,刮取细胞 ,用 PI标记细胞 ,
流式细胞仪检测和进行细胞周期分析 ,记录细胞周
期各亚群细胞的频数和分布直方图 ,测得其中
SubG1亚群细胞百分数 (% )。
2. 3. 4　细胞形态学观察: 细胞处理后 ,进行上述指
标检测的同时 ,平行进行细胞形态学观察。
2. 4　统计分析:结果用 SPSS10. 0软件进行 ANO-
V A的组间比较和相关分析。
3　实验结果
3. 1　 PN诱导 CN E1细胞毒性作用研究
·910· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 10期
3. 1. 1　 LDH漏出率 (% )的时间-效应关系观察:见
表 1。细胞 LDH漏出率随 PN作用时间的增加在 6
h后明显升高 (各时点与阴性对照组比较均 P <
0. 05) ,存在明显的时间 -效应关系 ( r= 0. 965 0,
P < 0. 01)。
表 1　 PN诱导 CNE1细胞 LDH漏出率的时间效应关系
组　别　　 作用时间 ( h) LDH漏出率 (% )
对照 12 2. 34± 0. 23
ActD 12 44. 30± 4. 30* *
24 51. 16± 1. 46* *
PN作用组 1 2. 27± 0. 26
( 75μmol /L) 3 2. 70± 0. 25
6 4. 45± 0. 86*
9 6. 85± 1. 57* *
12 25. 46± 4. 02* *
24 46. 07± 0. 85* *
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
3. 1. 2　 PN诱导 CN E1细胞毒性的剂量效应关系
观察:见表 2。 PN作用后各剂量组 ( 10～ 100μmo l /
L )细胞增殖抑制率在 12和 24 h均显著增加 ( P <
0. 05) , IC50分别为 42. 35和 29. 56μmol /L; 24 h细
胞 LDH漏出率明显升高 ; 24 h细胞计数则明显减
少 ;上述指标均存在明显的剂量-效应关系 ( P <
0. 01)。
3. 2　 PN诱导 CN E1细胞凋亡研究:细胞形态学观
察结果表明 ,阴性对照组 CN E1细胞呈贴壁生长 ;
阳性对照组和受试物作用组可见不同程度的细胞数
减少、形态变圆、细胞膜皱缩有折光、细胞失贴壁而
悬浮。
细胞凋亡指标检测结果见表 3, PN作用后各剂
量组细胞 TUN EL阳性率随暴露时间和作用剂量
增加而增高 ,在 24 h后中、高剂量组 (> 25μmol /
L)均高于阴性对照组 ; SubG1亚群在> 50μmo l /L
的 PN暴露 36 h后升高。与阴性对照组比较 , 24 h
细胞失贴壁率明显升高 (各剂量组均 P < 0. 05) ;上
述指标均存在明显的剂量 -反应关系 ( P < 0. 01)。
4　讨论
表 2　 PN诱导 CNE1细胞毒性的剂量效应关系
组　别　　 剂　量
(μmol /L)
LDH漏出率
(% )
M TT增殖抑制率 (% )
12 h 24 h
细胞计数
(× 105 /mL)
对照组 - 3. 73± 0. 12 0. 00± 0. 55 0. 00± 0. 33 4. 13± 0. 55
ActD - 51. 16± 1. 47* 43. 52± 2. 70* 84. 31± 0. 24* 1. 11± 0. 03*
PN 10 5. 70± 0. 29* 0. 64± 1. 99 2. 83± 2. 30 2. 90± 0. 13*
25 6. 47± 0. 37* 10. 11± 1. 38* 21. 03± 3. 01* 1. 95± 0. 07*
50 22. 93± 0. 38* 46. 38± 3. 04* 98. 01± 1. 53* 0. 83± 0. 03*
75 46. 07± 0. 85* 82. 65± 2. 94* 97. 59± 1. 16* 0. 86± 0. 05*
100 61. 51± 1. 47* 94. 19± 0. 36* 99. 76± 1. 47* 0. 69± 0. 04*
PN剂量相关性 (r ) 0. 986 1# # 0. 949 4# # 0. 940 0# # - 0. 881 8# #
　　　　 ANOV A分析的 SNK检验与对照组比较: * P < 0. 05;　与 PN剂量相关性的 Pears on s检验: # # P < 0. 01
表 3　 PN诱导 CNE1细胞凋亡指标检测
组　别 剂　量
(μmol /L)
TUN EL阳性率 (% )
12 h 24 h 36 h
SubG1
(% )
细胞失贴壁率
(% )
对照组 　 - 3. 05 5. 55 6. 45 13. 50 　 0. 49± 0. 07
ActD 　 - 25. 66 51. 53 86. 73 12. 66 100. 00± 0. 00
PN 10 3. 12 5. 86 8. 56 13. 62 　 3. 46± 0. 64* *
25 3. 05 12. 39 14. 94 16. 84 24. 25± 0. 80* *
50 5. 84 20. 04 48. 23 22. 62 83. 33± 0. 50* *
75 13. 82 58. 02 86. 03 27. 98 91. 29± 0. 54* *
100 18. 79 72. 08 94. 75 55. 24 98. 18± 0. 10* *
r 0. 965 8# # 0. 969 0# # 0. 982 0# # 0. 918 3# # 0. 927 3# #
　　 ANOV A分析的 SN K检验与对照组比较: * * P < 0. 01
　　与 PN剂量相关性的 Pears on s检验: # # P < 0. 01
　　草本植物菊花和茼蒿在民间用于治疗发热等多
种疾病已有一个多世纪的历史 [ 1]。进一步研究表明 ,
这些植物的提取物—— SLs具有抗炎症和抗微生物
的特性 ,通过对 5-羟色胺释放抑制作用分析提示
PN是 SLs中最活跃而且能独立发挥作用的主要成
分之一。 已知 SLs结构标志是一个类异戊二烯
( isoprenoid) 环系统和一个内酯环 ,这二个结构共
同形成一个反应性 Michael系统 ,成为亲核底物的
靶位点 ;其中 PN含有一个 α-甲叉 -γ-内酯 ( MGL)
和一个环氧化物 (见图 1) ,这些部位可与生物分子
亲核基团 (如巯基 )交互作用。
目前 SLs在医疗上的应用日益受到关注 ,欧洲
药物学家已广泛采用欧洲艾菊 (又名小白菊或雏菊 )
和使用含 PN的植物药物治疗偏头痛 ,临床试验证
实能有效地降低发生的频率和严重程度。美国专利
局也已有二项 PN应用的专利 ,包括 Brucker D
等 [2 ]使用含 PN的 Feverfew TW制成鼻咽喷剂 ,用于
缓解偏头痛和抗痉挛作用 ,例如缓解月经期痛性痉
挛或助消化作用 ; Hw ang DH等 [6 ]使用 SLs用于治
疗严重感染性疾病 ,其依据是 SLs可用于抑制早期
的炎症后细胞因子 ,改善败血症休克和其他严重的
感染性疾病。
已有报道含 SLs植物提取物也有抗肿瘤作用 ,
·911·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 10期
其中 PN能抑制多种肿瘤细胞 DNA合成和细胞增
殖 ,提示 PN可能具有抗癌作用 [7 ]。研究表明 PN对
多种恶性细胞的抗肿瘤效应与其细胞毒作用和细胞
增殖抑制效应有关。报道 FeverfewTW提取物和纯
PN对体外小鼠纤维肉瘤细胞株 ( MN-11)和人淋
巴瘤细胞株 ( TK6)有细胞生长抑制作用。然而 ,有
关 SLs对人鼻咽癌细胞的作用国内外尚未见报道。
本研究通过系统地检测 PN诱导的 CN E1细胞毒
性和细胞凋亡:首先 ,阐明了 PN具有有效的细胞毒
效应 ,表现在 PN暴露的早期 ( 6 h)即出现 LDH漏
出率显著增加 ,呈时间效应和剂量效应关系 ,在作用
的后期 ( 24 h)甚至低浓度 PN( 10μmol /L)也可导
致 LDH漏出增高 ;其次 ,细胞增殖功能检测显示在
PN作用的中期 ( 12 h) ,较低浓度 ( 25μmol /L )作
用已显著抑制肿瘤细胞的增殖 ,并随时间和剂量呈
明显增加 , 12和 24 h的 IC50分别为 42. 35和 29. 56
μmo l /L;第三 ,凋亡指标和特征性凋亡细胞形态学
改变等检测 ,证实 PN作用可明显诱导 CN E1细胞
凋亡并存在时间和剂量 -效应关系 ,在 PN作用的后
期 ( 24 h ) 和晚期 ( 36 h ) ,中、高剂量组 (> 50
μmo l /L) TUN EL阳性细胞、失贴壁细胞百分比和
细胞周期 SubG1亚群均显著增加 ,结果表明凋亡是
PN作用引起肿瘤细胞死亡的主要形式。
综上所述 ,一方面 ,人鼻咽癌细胞株 CN E1对
草本植物菊花等的倍半萜烯内酯类化合物的主要活
性成分 PN的细胞毒效应敏感 ,并发现 PN诱导
CN E1细胞凋亡 ;另一方面 ,上述结果存在时间循序
性改变和剂量效应关系 , PN在一定剂量范围内
( 10～ 100μmol /L )诱导的细胞膜完整性的破坏以
及由此引发的细胞增殖抑制出现早 ,提示 PN诱导
的细胞凋亡与介导细胞毒效应有关。对临床应用倍
半萜烯内酯衍生物和开发中草药植物新药进行鼻咽
癌的化学预防提供有用的信息。
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( 2): 126-129.
黄芪注射液和白术提取部位对小肠上皮细胞移行的影响
张子理1 ,陈蔚文 2
( 1. 深圳市第二人民医院 ,广东 深圳　 518035; 2. 广州中医药大学脾胃研究所 ,广东 广州　 510405)
摘　要: 目的　观察黄芪注射液 ( Hi) 及白术提取部位 ( B1、 B4、 B9、 B13)对小肠上皮细胞 ( IEC-6) 移行的影响 ,探
讨其粘膜修复的机制。方法　 IEC-6接种于 6孔培养板 , 72 h后损伤细胞 ,并加入不同剂量的 Hi、 B1、 B4、 B9和 B13
溶液 100μL,空白组加等量 D-PBS,阳性对照组加表皮生长因子 ( EGF) ,加药后 24, 48和 72 h观察细胞移行。结
果　 B4、 B9、 B13和 EGF均明显促进细胞移行 ,与对照组比较 24, 48和 72 h 均具有显著性差异 (P < 0. 01) ,但
B4、 B9、 B13作用不如 EGF强。 B1和 Hi对细胞移行无明显促进作用 ,与 EGF比较 24, 48和 72 h均具有显著性差
异 (P < 0. 01)。 B13和 Hi配伍应用后 ,对 IEC-6细胞移行具有协同促进作用 ,与对照组、 Hi和 B13组比较 24, 48
和 72 h均具有明显差异 (P < 0. 05～ 0. 01)。 结论　 B4、 B9、 B13通过促进细胞移行在小肠粘膜损伤修复过程中发
挥作用 ,可能是白术粘膜保护和修复作用的物质基础。 B13和 Hi配伍应用对细胞移行具有协同促进作用。
关键词: IEC-6细胞株 ;移行 ;黄芪注射液 ;白术提取物
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 10 0912 04
·912· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 10期
收稿日期: 2002-04-22基金项目:国家自然科学基金 ( No. 39970906) ;国家重大基础研究计划 ( 973) (NO. G 19990544) ;广东省自然科学基金 ( No. 990354)及广东省千百十人才工程基金项目 ( No. 9953)作者简介:张子理 ( 1963-) ,男 ,甘肃人 ,教授 ,主任医师 , 1986年 7月毕业于兰州医学院医疗专业 , 2002年 7月获广州中医药大学中西医结合临床专业博士学位 ,主要从事中西医结合临床、教学及科研工作 ,出版学术著作 3部 ,发表论文 40余篇。
* 通讯作者: E-mail: pw xh@ gzh t. cm. edu. cn.