全 文 ：第 13卷第 5期
2007年 10月 　　　　　　　　　　　　　 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志Chinese Journal of Oto rhino laryngolo gy-Skull Base Surg ery　　　　　　　　　　　　Vol.13 No.5　Oct.2007
基金项目:江苏省高校自然科学研究指导性计划项目
(04KJD320120)。
作者简介:肖大江 ,男 ,副主任医师。
通讯作者:肖大江 , Email:zgc2003doctor@yahoo.com.cn.
·基础研究·
田基黄对人鼻咽癌细胞 CNE-2生长和凋亡的影响
肖大江1 ,朱国臣1 ,王晓岚2 ,张永胜1 ,吴四海1 ,袁　渊1
(1.南京医科大学附属无锡第二医院 耳鼻咽喉科 ,江苏 无锡　214002;2.江南大学医学院 药理学教研室 ,江苏 无
锡　214002)
　　摘　要:　目的　探讨田基黄对人鼻咽癌细胞 CNE-2 的抑制和凋亡作用 ,为其临床应用提供实验依据。方法
　SRB法检测田基黄对 CNE-2 细胞生长的抑制作用 , PI 分析细胞周期的变化 、Annexin V 检测细胞凋亡的发生。
结果　田基黄抑制 CNE-2 细胞的生长 , 引起细胞死亡;田基黄诱导 CNE-2 细胞发生凋亡和坏死;田基黄作用人鼻
咽癌细胞后 S 期细胞的比例增加 , G2/M 期细胞的比例减少。结论　一定浓度的田基黄可明显抑制人鼻咽癌细胞
CNE-2 生长 ,并诱导其凋亡 , 机制可能与阻滞细胞停留在 S 期有关。
关　键　词:田基黄;鼻咽肿瘤;细胞凋亡;CNE-2
中图分类号:R739.62　　　文献标识码:A　　　文章编号:1007-1520(2007)05-0337-03
Effects of Hypericum Japonicum Thunb on growth inhibition
and apoptosis of human nasopharyngeal
carcinoma cell line CNE-2 in vitro
XIAO Da- jiang , ZH U Guo-chen , WANG Xiao-lan , et al.
(Deptartment o f Otolaryngology , the A f f iliated Wu xi No.2 Peop les Hosp ital , Nanj ing Medical University ,
Wu xi 214002 , China)
　　Abstract:　Objective　To explo re the effec ts o f Hype ricum Japonicum Thunb(H JT)on cell g row th inhibition
and apopto sis o f human nasopha ryngeal carcinoma cell line CNE-2 in vitro.Methods　Grow th inhibition and
apopto sis of H JT on CNE-2 cells w ere measured with S RB assay and f low cy tome try r espectively.Results　The
gr ow th of CNE-2 was significantly inhibited by HJT in vitro , and the inhibition w as do se-dependent.HJT also
induced cell apopto sis and could cause CNE-2 cells to a rrest at S phase with the increase of its concentration.
Conclusion　H JT of definite concentra tion can evidently inhibit the g row th and induce the apoptosis of CNE-2.The
mechanism is likely to be a ssocia ted with the arre st cells at S phase of cell cycle.
Key words:Hype ricum Japonicum Thunb;Nasopha ryngea l neoplasms;Apoptosis;CNE-2
　　鼻咽癌是我国南方最常见的头颈部恶性肿瘤之
一 ,病理类型以低分化鳞状细胞癌多见 ,临床上以放
疗为主 ,晚期患者辅以化疗 。与传统的化疗药物相
比 ,天然抗肿瘤药物日益受到人们的关注[ 1] 。田基
黄是金丝桃属植物地耳草的全草提取物 ,国内研究
发现其对人舌癌细胞株 TSCCa、喉癌 Hep-2和宫颈
癌 Hela等有抑制生长作用 ,但对人鼻咽癌细胞作用
的报道罕见[ 2 , 3] 。本研究通过 SRB法检测细胞存活
率 、流式细胞仪分析细胞周期的变化 、检测细胞凋亡
的发生 ,观察田基黄对于人鼻咽癌细胞 CNE-2株的
抑制作用 ,以期为临床应用提供实验依据。
1　材料和方法
1.1　主要实验材料和仪器
人鼻咽癌细胞系CNE-2(中国科学院上海细胞生
物所),田基黄注射液(由江苏常州康普药业有限公司
·337·
　　
提供 ,以 1 g/ml计算), RPMI-1640(美国 Gibco BRL
公司),胎牛血清(杭州四季青公司),Sulphorhodamine
(SRB ,美国 Sigma 公司), PI(美国 Sigma公司), An-
nexin V凋亡检测试剂盒(美国 Biovision公司),流式
细胞仪(Beckman Coulter公司产品)。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　细胞接种于含 10%胎牛血清 、
100 IU/ml 青霉素和0.1 mg/ml链霉素的 RPM I-
1640培养基中 。细胞培养用 50 ml 培养瓶 , 置于
37℃、5%CO 2 培养箱在全湿条件下培养。
1.2.2　SRB法检测细胞存活率　将增殖良好并处
于对 数 生 长期 的 CN E-2 细 胞 制 成 浓度 为
1×104/100 μl的细胞悬液 ,接种于 96 孔板内 ,每孔
100 μl。预培养 24 h 后 , 每孔加入 25 mg/ml 、
50 mg/ml 、100 mg/ml、250 mg/ml 、500 mg/ml 不
同浓度的田基黄 100 μl/孔继续培养 48 h 。并设空
白对照(RPMI-1640 培养液)和正常对照(不加药
物 ,加等量生理盐水)。然后参照 Skehan s法 ,每孔
加入0.4%SRB 100μl ,室温下放置 30 min ,在酶联免
疫检测仪上测定 OD值 ,用空白对照调零 ,所用波长
509 nm 。计算出药物对细胞生长抑制率 ,生长抑制率
=(对照组OD值-实验组 OD值)/对照组 OD值×
100%。采用SPF 3.11软件 ,计算半数抑制率 IR50 。
1.2.3　PI 分析细胞周期　加入浓度为 25 mg/ml 、
50 mg/ml 、100 mg/ml 、250 mg/ml 、500 mg/ml的田
基黄 ,培养 48 h 后收集各瓶所有贴壁的细胞 , 70%
冷乙醇固定过夜 , PBS 洗 3 次后弃上清 , RnaseA
37℃水浴消化 30 min , PI避光染色 30 min ,上流式
细胞仪进行细胞周期分布的检测 ,软件分析结果 。
设田基黄浓度为 0 mg/ml者为对照组。
1.2.4　Annexin V-FITC/PI标记法检测细胞凋亡
率　加入浓度为 25 mg/ml 、50 mg/ml 、100 mg/ml 、
250 mg/ml 、500 mg/ml的田基黄 ,继续培养48 h后
收集各瓶所有贴壁的细胞 ,分别制备成0.5 ml PBS
单细胞悬液 ,先后加入 Annexin V 凋亡试剂盒中
A nnexin V-FITC 和 PI 各 5 μl , 室温下避光染色
10 min ,上流式细胞仪检测细胞凋亡率 ,软件分析结
果 。设田基黄浓度为 0 mg/ml者为对照组。实验
重复 4次。
1.3　统计学分析
所得数据经 SPSS 10.0 for Window s 软件处
理 ,结果用均数加标准差表示( x ±s)。数据用 t
检验进行统计学分析 , P <0.05表示差异有统计学
意义。
2　结果
2.1　田基黄对细胞生长的抑制作用
根据测得的 OD值 ,计算出田基黄在不同浓度
下对 CNE 细胞的抑制率 。田基黄取 25 mg/ml 、
50 mg/ml 、100 mg/ml 、250 mg/ml、500 mg/ml 浓
度时 ,CNE细胞的抑制率分别为(3.58±0.87)%、
(22.95±5.42)%、(53.86 ±10.67)%、(78.32 ±
11.37)%、(91.26±18.26)%。结果表明田基黄对
CNE 细胞生长抑制率均随着浓度的增加而增加。
田基黄的半数抑制率 IR50为97.3 μmol/L。田基黄
对 CNE-2的浓度-抑制率见图 1。
图 1　田基黄对 CNE-2 的浓度-抑制率
2.2　田基黄对细胞周期的影响
正常状态下的 CNE-2细胞大多数处于 G 1 期 ,
S期次之 ,G 2/M 期最少。田基黄处理后使细胞周
期发生明显变化 , S期细胞的比例增加 ,G 2/M 期细
胞的比例减少 ,且随着药物浓度的增加而逐渐明显
(表 1)。
表 1　田基黄对 CNE-2 细胞周期的影响
组别
(mg/m l)
细胞周期(%)
G 1 期 S期 G 2/M 期
0 67.9±8.4 19.9±3.2 12.2±3.6
25 66.5±7.5 27.5±4.9■ 6.0±2.8■
50 65.0±6.8 29.3±4.4■ 5.7±1.8■
100 62.7±5.7 32.1±5.7■ 5.2±1.0■
250 58.7±4.2 37.5±6.4■ 3.8±1.2■
　　注:■与对照组比较 , P <0.05
2.3　田基黄对细胞凋亡的影响
Annexin V-FITC/PI 染色将细胞分为四种属
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性 ,其中 I 象限(Annexin V -/PI+)为死亡细胞;II
象限(A nnexin V +/PI+)为晚期凋亡细胞;III 象限
(A nnexin V -/ PI-)为正常细胞;IV 象限(Annexin
V
+/PI-)为早期凋亡细胞。
田基黄处理后 II 、IV 象限的细胞数比例增多 ,
且随着药物浓度的增加而逐渐增加(图 2 ,表 2)。
图 2　田基黄对 CNE-2凋亡的影响(A 为对照组;B为 100mg/ ml组)
表 2　田基黄对 CNE-2细胞的 Annexin V 检测
组别(mg/ml) 象限(%)
I II III IV
对照组 2.23±0.54 1.25±0.46 95.55±8.47 0.97±0.23
25 2.05±0.65 4.14±0.59■ 90.56±8.56 3.25±0.42■
50 2.19±0.85 6.99±1.54■ 85.54±9.35 5.28±0.97■
100 2.46±0.98 11.69±2.49■ 77.30±9.48 8.55±1.82■
250 2.13±0.93 29.48±4.88■ 57.61±8.24 10.78±2.58■
500 2.76±1.24 44.61±19.45■ 41.29±6.89 11.34±2.23■
　　注:■与对照组比较 , P <0.05
3　讨论
　　国内研究表明 ,田基黄具有一定的抗肿瘤作用 ,
对人舌癌细胞株 TSCCa 、喉癌Hep-2和宫颈癌 Hela
等有抑制生长作用。但关于田基黄诱导肿瘤细胞凋
亡的报道少见[ 2 , 3] ,而凋亡已成为当今抗肿瘤药物
的研究热点 ,几乎所有的化疗药物在体外均可诱导
敏感的肿瘤细胞发生凋亡。本研究采用 Annexin
V-FITC/PI法发现 ,在体外条件下 25 mg/ml以上
的田基黄能引起鼻咽癌细胞 CN E-2发生凋亡 。
研究中还发现 ,当药物浓度达到 100 mg/ml以
上时 ,早期细胞凋亡率无明显变化 ,而晚期凋亡率和
细胞坏死率显著增高 ,这可能由于不同浓度的药物
对细胞产生了不同的抑制效应 ,低浓度时较易引起
细胞内部的改变而诱导凋亡 ,高浓度时药物的毒副
作用更易引起细胞坏死而非凋亡;还可能与本实验
药物作用时间较长 ,且体外培养体系中凋亡细胞不
能被吞噬而清除有关。这对于临床选择用药有一定
的指导意义。
同时 ,我们还发现不同浓度的田基黄作用于鼻
咽癌细胞 CNE-2后 ,可出现明显的细胞周期改变 ,
以S 期细胞的比例增加和G 2/M 期细胞的比例减少
明显 ,与对照组比较差异有统计学意义。表明田基
黄能干扰鼻咽癌细胞 CNE-2的细胞周期:将细胞阻
滞于 S期 ,不能进入 G 2/M 期 ,但影响细胞周期调节
的靶分子机制有待进一步研究。
参考文献:
[ 1] 　王承龙 , 邓雪娥 , 肖健云 , 等.紫杉醇对鼻咽癌上皮细胞株
HNE-1生长抑制和凋亡的影响[ J] .中国耳鼻咽喉颅底外科
杂志 , 2004 , 10(5):263-265.
[ 2] 　金辉喜 ,李金荣.田基黄对人舌癌细胞株 T SCCa 细胞毒作用
的研究[ J] .临床口腔医学杂志 , 1997 , 13(1):19-20.
[ 3] 　傅芃,田红丽 ,张卫东.田基黄的研究进展[ J] .药学实践杂志 ,
2004, 22(2):98-101.
(修回日期:2007-07-10)
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