全 文 ：田基黄对人鼻咽癌细胞株 CNE-2细胞生长抑制的体外实验
肖大江 1 ,朱国臣 1 ,王亚平1 ,胡玉林 2
InhibitingefectofHypericumJaponicumThunbonhumannasopharyngealcarcinoma
lineCNE-2invitro
XIAODa-jiang1 , ZHUGuo-chen1 , WANGYa-ping1 , HUYu-lin2
1WuxiNo.2PeoplesHospital, AffiliatedwithNanjingMedicalUniversity, Wuxi214002, China;2DepartmentofOncology, WuxiNo.4
PeoplesHospital, Wuxi214062, China.
【Abstract】　Objective:TostudclytheinhibitingeffectsofHypericumJaponicumThunb(HJT)onhumannasopha-
ryngealcancerlineCNE-2.Methods:CNE-2 cellswereincubatedwithHJTatvariousconcentrationandtime,
cellgrowthinhibitionwasassessedbySulphorhodamineassay, cel-cyclekineticsandapoptosiswereanalyzedby
fluorenscencemicroscopyandflowcytometry.Results:ThegrowthofCNE-2 celswassignificantlyinhibitedby
HJTinadose-dependentandtime-dependentfashion.HJTcouldcauseCNE-2celscycletochange.Withthe
increaseofdrugconcentration, Sphasecelpercentageincreased.TheapoptosisrateofCNE-2 cellswas13.12%
afterincubationwith400mg/mlHJTfor48hours.Conclusion:HJTsuppressesthegrowthofCNE-2cellsinvitro
bycausingcel-cyclearrestandcellapoptosis.
【Keywords】HypericumJaponicumThunb;nasopharyngealcarcinoma;cellcycle;apoptosis
ModernOncology2008, 16(01):0015 ～ 0016
【摘要】　目的:观察田基黄对人鼻咽癌细胞株 CNE-2细胞的生长抑制作用 , 为其临床应用提供理论依据。
方法:将浓度为(0、25、100、400)mg/ml的田基黄与 CNE-2细胞作用(24、48、 72)h, 用 SRB法检测田基黄对
CNE-2细胞的生长抑制率 ,流式细胞仪分析细胞周期的变化 、检测细胞凋亡率 , 荧光显微镜观察细胞形态学
变化。结果:田基黄对 CNE-2细胞的生长抑制率随药物浓度和作用时间的增加而增大。流式细胞仪分析显
示田基黄将 CNE-2细胞明显阻滞于 S期。田基黄浓度为 400mg/ml作用 48小时 , CNE-2细胞的凋亡率为
13.12%, 荧光显微镜下观察有凋亡细胞存在。结论:田基黄能够抑制人低分化鼻咽癌细胞株 CNE-2细胞的
增殖 , 能使 CNE-2细胞阻滞于 S期 ,可诱导 CNE-2细胞发生一定程度的凋亡。
【关键词】　田基黄;鼻咽肿瘤;细胞周期;凋亡
【中图分类号】R739.63　　　【文献标识码】A　　　【文章编号】1672-4992-(2008)01-0015-02
　　鼻咽癌是我国南方最常见的头颈部恶性肿瘤之一 , 病理
类型以低分化鳞状细胞癌多见 , 临床上以放疗为主 , 晚期患
者辅以化疗。与传统的化疗药物相比 ,天然抗肿瘤药物日益
受到人们的关注 [ 1] 。田基黄是金丝桃属植物地耳草的全草
提取物 , 国内研究发现其对人舌癌细胞株 TSCCa、喉癌Hep-
2和宫颈癌 Hela等具有抑制生长作用。我们先前的研究表
明田基黄对人鼻咽癌细胞株 CNE-2细胞亦具有抑制生长
作用 [ 1～ 3] ,本实验拟通过进一步观察田基黄在体外条件下对
人低分化鼻咽癌细胞株 CNE-2细胞的影响 , 以探讨其在鼻
【收稿日期】　2007-06-18
【修回日期】　2007-07-26
【基金项目】　江苏省教育厅高校自然科学基金资助项目 (编号:
04KJD320120)
【作者单位】　 1南京医科大学附属无锡第二医院 , 江苏　无锡　
214002
2无锡市肿瘤医院(无锡市第四人民医院),江苏　无
锡　 214062
【作者简介】　肖大江(1965-), 男 ,江苏无锡人 ,副主任医师 , 主要
从事耳鼻咽喉头颈外科临床与科研工作。
咽癌治疗中的可能应用价值。
1　材料和方法
1.1　主要实验材料和仪器　
人鼻咽癌细胞系 CNE-2购于中国科学院上海细胞生
物所 , 田基黄注射液由江苏常熟制药厂提供(以 1g/ml计
算), RPMI1640购于美国 GibcoBRL公司 , 胎牛血清购于杭
州四季青公司 , Sulphorhodamine(SRB)购于美国 Sigma公司 ,
PI(碘化丙啶)购于 Sigma公司 , AnnexinV凋亡检测试剂盒
购于 Biovision公司 , 流式细胞仪为 BeckmanCoulter公司产
品。
1.2　细胞培养　
细胞接种于含 10%胎牛血清、100u/ml青霉素和 0.1mg/ml
链霉素的 RPMI1640培养基中。细胞培养用 50ml培养瓶 ,
置于 37℃、5%CO2培养箱在全湿条件下培养。
1.3　SRB法检测细胞生长抑制率 [ 4]
将增殖良好并处于对数生长期的 CNE-2细胞制成细
胞悬液 , 接种于 96孔板内 , 100μl/孔。预培养 24小时后 , 每
孔加入不同浓度的田基黄 100μl/孔:(0、25、100、 400)mg/ml,
继续培养(24、 48、72)小时。然后参照 Skehans法 , 每孔加入
·15·现代肿瘤医学　2008年 1月　第 16卷第 1期
0.4%SRB100μl,在酶联免疫检测仪上测定 A值 ,用空白对照
调零 , 所用波长 509nm。计算出药物对细胞生长抑制率。生
长抑制率 =(对照组 A值 -实验组 A值)/对照组 A值 ×
100%。
1.4 　荧光显微镜下观察细胞形态的变化　
药物浓度分别为(0、 25、100、 400)mg/ml作用细胞 48小
时后 , 收集各瓶所有贴壁细胞 , 分别制备成 0.5mlPBS单细
胞悬液 , 先后加入凋亡试剂盒中 AnnexinV和 PI各 5μl,室温
下避光染色 10分钟 ,置于荧光显微镜下观察并照相。
1.5　流式细胞仪检测
1.5.1　PI标记法分析细胞周期的变化　药物浓度分别为
(0、25、100、400)mg/ml作用细胞 48小时后 , 收集各瓶所有
贴壁细胞 , 70%冷乙醇固定过夜 , PBS洗 3次后弃上清 ,
RnaseA37℃水浴消化 30分钟 , PI避光染色 30分钟 , 上流式
细胞仪进行细胞周期分布的检测。
1.5.2　AnnexinV和 PI双染法分析细胞凋亡　药物浓度
分别为(0、25、 100、 400)mg/ml的细胞作用 48小时后 , 收集
各瓶所有贴壁细胞 , 分别制备成 0.5mlPBS单细胞悬液 , 先
后加入凋亡试剂盒中 AnnexinV和 PI各 5μl, 室温下避光染
色 10分钟 ,上流式细胞仪检测细胞凋亡率 , 软件分析结果。
1.6　统计学分析　
实验重复 4次。所得数据经 SPSS10.0 forwindows软件
处理 , 结果用 x±s表示 。数据用 t检验进行统计学分析 , P<
0.05表示差异有统计学意义。
2　结果
2.1　田基黄对 CNE-2细胞增殖的抑制作用
根据测得的 A值 ,计算出田基黄在不同浓度下对 CNE-
2细胞增殖的抑制率 , 结果显示田基黄对 CNE-2细胞的增
殖有明显抑制作用。结果见表 1。
表 1　田基黄对 CNE-2细胞的生长抑制率　　(%, x±s)
剂量(mg/ml) 观察时间(h)　24 　48 　 72
25 2.25 ± 0.45 3.58 ± 0.83 50.23 ± 3.84
100 18.47 ± 2.27 53.86 ± 3.21 85.21 ± 2.87
400 45.39 ± 2.61 89.58 ± 3.65 97.49 ± 1.87
2.2　田基黄作用后 CNE-2细胞形态的变化　
荧光显微镜下观察:对照组(0mg/ml组)细胞呈均匀一
致的低染 , 用药组细胞有三种情况:低染的正常细胞 、绿色的
早期凋亡细胞 、红色的晚期凋亡细胞和继发坏死细胞。随着
药物浓度的增加 , 后两种细胞的比例逐渐增多。
2.3　田基黄对 CNE-2细胞周期的影响　
正常状态下的 CNE-2细胞大多数处于 G
1
期 , S期次
之 , G2 /M期最少。田基黄处理后使细胞周期发生明显变化 ,
S期细胞的比例增加 , G2 /M期细胞的比例减少 , 且随着药物
浓度的增加而逐渐明显。见表 2。
表 2　田基黄作用 48小时对 CNE-2细胞周期的影响 (%, x±
s)
组别(mg/ml)G1 期 S期 G2 /M期
0 67.87 ± 8.14 19.93 ± 3.22 12.20 ± 3.62
25 65.09 ± 6.38 28.23 ± 4.41■ 6.68 ± 1.38■
100 58.47 ± 4.25■ 36.58 ± 5.12■ 4.95 ± 1.30■
400 49.74 ± 3.53■ 46.92 ± 4.21■ 3.34 ± 0.83■
■:与对照组(0mg/ml)比较 , P<0.05。
2.4　田基黄诱导 CNE-2细胞凋亡　
AnnexinV/PI染色将细胞分为四种属性 , 其中 I象限
(AnnexinV-/PI+)为坏死细胞;II象限(AnnexinV+/PI
+)为晚期凋亡细胞和继发坏死细胞;III象限(AnnexinV
-/ PI-)为正常细胞;IV象限(AnnexinV+/PI-)为早期
凋亡细胞。田基黄处理 CNE-2细胞 48小时后凋亡细胞和
坏死细胞比例增多 , 且随着药物浓度的增加而逐渐增加 , 尤
以凋亡细胞为主。结果见表 3。
表 3　田基黄作用 48小时对CNE-2细胞凋亡的影响 (%, x±s)
剂量
(mg/ml)
象限
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅴ
0 1.25±0.54 1.47±0.52 96.50±3.17 0.78±0.20
25 2.78±0.45■ 2.85±0.48■ 92.02±4.22 2.35±0.30■
100 4.29±0.52■ 4.68±0.64■ 87.91±4.32■ 3.12±0.38■
400 6.28±1.05■ 8.38±1.22■ 80.60±3.39■ 4.74±1.07■
■:与对照组(0mg/ml)比较 , P<0.05。
3　讨论　
国内的研究表明 , 田基黄具有一定的抗肿瘤作用 , 对人
舌癌细胞株 TSCCa、喉癌 Hep-2和宫颈癌 Hela等有抑制生
长作用 , 但在鼻咽癌细胞方面的研究罕见报道。本研究采用
较新的筛选抗癌药物的方法—SRB法 [ 4] , 结果显示田基黄对
体外培养的人鼻咽癌 CNE细胞的生长有明显的抑制作用 ,
且随着药物浓度的增高而逐渐增强;随着药物作用时间的延
长 , 其抑制作用越显著 ,即存在剂量和时间依赖性。
凋亡已成为当今抗肿瘤药物的研究热点 , 几乎所有的化
疗药物在体外均可诱导敏感的肿瘤细胞发生凋亡。本研究
采用的 AnnexinV/PI法是检测早期凋亡的敏感指标之一 , 流
式细胞仪结果显示在体外条件下 25mg/ml以上的田基黄能
引起鼻咽癌细胞株 CNE-2细胞发生一定的凋亡。荧光显
微镜下观察亦证实了这点。同时 ,研究也发现药物浓度增高
时 , 细胞坏死率的变化较细胞凋亡率的变化更显著 , 提示诱
导细胞凋亡和坏死同为田基黄杀伤鼻咽癌细胞株 CNE-2
细胞的机制 , 且以后者为主。
同时 , 我们也发现不同浓度的田基黄作用于鼻咽癌细胞
CNE-2后 ,可出现明显的细胞周期改变 , 以 S期细胞的比例
增加和 G2 /M期细胞的比例减少明显 , 与对照组比较差异有
统计学意义 , 表明田基黄能干扰鼻咽癌细胞 CNE-2的细胞
周期:将细胞阻滞于 S期 , 不能进入 G2 /M期 , 进而出现凋
亡 , 但影响细胞周期调节的靶分子机制有待进一步研究。研
究结果可能为田基黄在鼻咽癌临床治疗中的应用提供理论
基础 , 提示该药联合应用对 S期细胞敏感的药物 , 可能会取
得更好的疗效。
【参考文献】
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