全 文 ：立了兰科植物无菌试管苗与内生真菌双重培养方
法 ,使植物与有益真菌在一段时间内共同生长。实验
证明 ,这是一个研究内生真菌与兰科植物苗之间相
互作用的良好体系。
3. 2　 3种菌对铁皮石斛生长的作用:在实验室的双
重培养条件下 , 3种内生真菌早期表现出对铁皮石
斛有促生长作用 ,此时 03号菌尚未接触到石斛苗 ,
已表现出对石斛原球茎增殖及苗的生长有明显促进
作用 ,原因可能是菌的代谢产物对石斛有一定的作
用。张集慧等 [10 ]从开唇兰小菇、石斛小菇和兰小菇
发酵液的乙酸乙酯萃取部分中分离出了 5种植物
激素 ,产生植物激素也是真菌促生长的机制之一。后
期菌丝生长旺盛 ,侵入原球茎后造成原球茎死亡 ,促
生长作用减弱 ,并有死苗现象 ,说明共生促生长是有
条件和相对的。
3. 3　 3种菌对金线莲生长的作用: 金线莲的接种材
料 为单株试管苗 , 在不接种菌时 ,没有侧芽和侧根
萌出 ,接种 03或 05菌后 ,则明显有新侧芽和侧根萌
出 ,我们认为与菌产生激素有关。接种菌的金线莲苗
生长量均明显低于对照 ,原因可能是培养瓶中的营
养有限 ,菌生长消耗了部分营养 ,从而影响了植株的
生长。
大量研究已经证明 ,兰科植物与菌根真菌之间
的关系不是高度专一的 ,铁皮石斛和金线莲为两种
不同属、不同生态型的植物 , 3种菌对两种植物均有
促生长作用 ,说明它们对兰科植物的生物活性没有
明显的种属专化性 ,对这些内生菌的利用 ,无疑为促
进铁皮石斛及金线莲试管苗移载成活 ,提供了更多
的机会 ,也为其它兰科植物的栽培 ,提供了新途径。
参考文献:
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厚朴的任意引物 PCR指纹图谱分析
苏应娟 1 ,朱建明 1 ,王　艇 1* ,李雪雁 1 ,曾庆文 2 ,夏念和 2
( 1. 中山大学生命科学学院 ,广东 广州　 510275; 2. 中国科学院华南植物研究所 ,广东 广州　 510520)
摘　要: 目的　鉴别中药材厚朴、凹叶厚朴及其常见的伪品和混淆品。 方法　采用任意引物 PC R ( a rbit rarily
primed PCR, AP-PCR)技术扩增植物基因组 DN A样品。 结果　 AP-PC R技术获得清晰可靠的 DNA指纹图谱 ,
根据琼脂糖凝胶上显示的 DN A带型差异可迅捷地区分厚朴、凹叶厚朴及其伪品、混淆品。结论　为应用 AP-PC R
技术在分子水平上鉴别中药材厚朴 ,保证引种的准确性奠定了基础。
关键词: 中药材 ;厚朴 ; AP-PCR
中图分类号: R282. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 06 0545 04
Fingerprint of arbitrarily primed polymerase chain reaction ( AP-PCR)
forMagnolia off icinalis
SU Ying-juan1 , ZHU Jian-ming1 , WANG Ting1 , LI Xue-yan1 , ZEN G Qing-w en2 , X IA Nian-h e2
( 1. School of Life Sciences, Sun ya t-set Univ ersity, Guang zhou Guangdong 510275, China; 2. South
China Institute o f Bo tany, Chinese Academy of Sciences, Guang zhou Guangdong 510520, China )
Abstract: Object　 To identify Magnol ia of f icinal is Rehd. et Wils. and M . biloba Rehd. et Wils. as
w ell a s thei r counterfei t s and easi ly confusable substitutes. Methods　 To tal genomic DN A samples of ten
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收稿日期: 2001-08-06
* 通讯作者
plant species w ere ampli fied by arbi t ra rily primed PCR ( AP-PCR) . Results　 Ten samples w ere distin-
guished through their amplified DN A banding pat ter ns on the agarose gels af ter elet ropho resis, so as to
di fferentia te the counterfei ts and easily confusable substi tutes o f M . of f icinalis and M. biloba. Conclusion
　 AP-PCR is useful fo r identifying M. of f icinal is a t mo lecula r level, as well as v aluable to gua rantee intro-
ducing o riginal plant co rrectly.
Key words: Chinese medicinal ma terials; Magnol ia of f icinalis Rehd. et Wils; arbi t rari ly primed poly-
merase chain reaction AP-PCR
　　厚朴是我国重要的传统中药材。 药用正品是厚
朴 Magnol ia of f icinal is Rehd. et Wils和凹叶厚朴
M. biloba ( Rehd. et Wils. ) Cheng的干皮、枝皮与
根皮。由于药材长期供不应求 ,商品不断出现厚朴的
代用品或伪品 ,曾报道有 6科 30余种植物的树皮
作厚朴药用 [1 ]。
AP-PCR技术是由 Welsh领导的小组在 PCR
基础上发展起来的一项旨在获得基因组 DNA指纹
图谱的技术 [2 ] ,近年来在中药材的鉴定中得到较为
广泛的应用。本文尝试使用 AP-PCR技术对中药材
厚朴的正、伪进行区分 ,供参考研究。
1　材料与方法
1. 1　材料:本实验共采集植物样品 10种 ,分别是:
1. 厚朴 M . of f icinal is Rehd. et Wils. 2. 凹叶厚朴
M. biloba ( Rhed. et Wils) Cheng 3. 玉兰 M. de-
nudata Desr. 4. 望春玉兰 M. biondii Pamp. 5. 武
当玉兰 M. sprengeri Pamp. 6. 紫玉兰 M. lil if lora
Desr. 7. 山玉兰 M. delaviayi Franch 8. 桂南木莲
M. chingii Dandy 9. 红花木莲 M. insignis (W all)
Bl 10. 鹅掌楸 Liriodendron chinense ( Hemsl. )
Sarg。原植物皆采自中国科学院广州华南植物园 ,由
曾庆文高级工程师鉴定 ,凭证标本皆存于该园。
1. 2　主要试剂:提取植物基因组 DN A用十六烷基
三甲基溴化铵 ( C TAB)、 Tris (三羟甲基氨基甲
烷 )、β -mercaptoetheno l (β -巯基乙醇 )购自 SIGM A
公 司 ; 标准 分子 量 λDN A /HindⅢ 购 自 美国
Promega公司 ( 21 226, 7 421, 5 804, 5 634, 4 878,
3 530 bp) ;琼脂糖 ( Agarose )购自 Gene公司 ; Taq
DN A聚合酶、 dN T Ps、超纯水等购自上海生工生物
技术和服务公司 ,引物由上海生工生物技术和服务
公司合成 ;λDNA /Eco rRI+ HindⅢ DN A Ladder
( 21 227, 5 148, 4 973, 4 268, 3 530, 2 027, 1 904,
1 584, 1 375, 947, 831, 564, 125 bp ) 购自华美
( SABC)生物工程公司 ;其它试剂均为国产分析纯
试剂。
1. 3　仪器: Gene Amp PCR System 2400 ( Perkin
Elmer Corporation ) ; Ul t raspec 2000 UV /Visible
Spectrophotometer ( Pha rmacia Bio tech ) ; TGL-
16G台式高速离心机 (上海医用分析仪器厂 ) ; DK-
8D型电热恒温水槽 (上海医用恒温设备厂 ) ; PAC
3000电泳仪 ( Bio-Rad corpo ration) ;水平电泳槽
(北京东方仪器厂 )。
2　实验方法
2. 1　植物 DNA提取与纯化:从每种植物的 3个个
体中共取新鲜叶片材料 1 g ,置于已经灭菌的研钵
中 ,加液氮迅速研磨成粉末 ,分装于 4个 1. 5 mL的
Eppendorf管中 ,每管加入 1 mL- 20℃ 预冷的丙
酮 ,快速上下颠倒 6～ 7 s, 8 000 r /min离心 10min,
弃上清液 ,重复 1次。每管加入 60℃ 预热的 2%
CTAB提取液 1 mL,充分混匀 , 60℃ 水浴 4 h ,其
间每隔 0. 5 h上下翻动浮板 1次。0℃预冷 500μL
氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)抽提 10 min, 15 000 r /min离
心 10 min,取上清 ,重复 1次。取上层水相加入 2 /3
体积 4℃ 预冷异丙醇 ,轻轻混合 , - 20℃静置沉淀
过液。5 000 r /min离心 5 min,可见管底有半透明沉
淀 ,弃上清液 ,取沉淀。每管加入 800μL 70% 4℃
预冷乙醇 , 0℃ 冰盒中上下颠倒漂洗 20 min, 3 000
r /min离心 10 min,弃上清 ,重复 1次。取沉淀于干
净的 0. 5 mL Eppendo rf管中 ,开管盖置干燥器中
干燥 1 h。 50μL T E ( pH8. 0)溶解沉淀。
采用北京原平生物技术公司的 Glass-milk Ki t
纯化 DNA。 50μL DNA溶液中加入 3倍体积的溶
胶液 ,混匀。加入 10μL玻璃奶 ,混匀 ,室温静置 5
min。离心 8 000 r /min数秒 ,吸弃上清液。加 125μL
漂洗液 ,用加样器吸漂洗液将玻璃奶冲散均匀 ,离心
弃上清液 ,重复 2次。 加入 TE ( pH 8. 0) 20μL混
匀 , 60℃ 水浴 5 min,离心 15 000 r /min数秒 ,回收
上清 ,重复 1次 ,可得纯化后 DNA溶液 40μL。
2. 2　 AP-PCR扩增: 在 Gene Amp PCR System
2400上进行扩增 ,反应体系总体积为 25μL,其中:
引物 2μmo l /L,模板 DNA 1. 0 ng /μL, dN T Ps每种
各 200μmo l /L, Mg Cl2 2. 5 mmol /L, 10× buffer ( 10
mmol /L KCl , 10 mmol /L Tris HCl , 0. 1% Tri ton
X-100, pH 8. 3) 2. 5μL 1. 125 unit Taq DN A聚合
·546· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
酶。每组反应均设不含模板 DNA的空白对照。
扩增程序为: 95℃ , 3 min 20 s预变性 ,随后进
行 45个循环: 94℃ , 1 min; X℃ , 1 min; 72℃ 1
min;最后 72℃ , 6 min完全延伸一个循环。其中 X
℃ 根据每一种引物的理论退火温度减低 8℃～ 12
℃ ,见表 1。
表 1　 AP-PCR所用引物的序列与退火温度
引物编号 引物序列 ( 5′-3′) 退火温度℃
AP-1 CGA TTT AAA GCT GGT GT 40
AP-2 CAT GTA CCT GCA GTA GC 42
AP-3 CTT TCC A TA CTT CAC AA 40
AP-4 ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT 50
AP-5 TTA CGA GCT TGC ACA CAA GC 50
AP-6 ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT 50
AP-7 CCT TCA TTA CGA GCT TGC ACA 52
AP-8 CAT TTC TTC ACA TGT ACC TGC 50
AP-A CAT CGG A TC CAC CAC GTC 46
AP-B GCT TCT CAA GCA GGA CCT 44
AP-C CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 54
AP-D AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GAA 54
AP-E TAC GG T GGC GGA GCG CAG CA 52
AP-F CTG G TC AAG GCA CAA GAG AT 48
M G-1 CA T CTG CAG AAC TAG TCG GAT GGA G TA GAT 54
M G-15 ATC TGG GTT GCT AAC TCA ATG 50
2. 3　 PCR扩增产物检测: PCR扩增产物使用
1. 5% 的琼脂糖凝胶电泳检测样品扩增情况 ,于
254 nm手提紫外灯下观察并拍照 (图 1)。
2. 4　数据分析: 任意 2个样本间的相似度指数
( F ) , F= 2NXY / (NX+ NY ) ,其中 NX、 N Y分别是样
本 X、样本 Y 扩增出的 DNA片段总数 , NX Y是样本
X 和样本 Y 共有的 DNA片段数。进一步计算出任
意 2个样本间 1-F遗传距离系数并通过 U PGMA
法聚类 ,构建树系图 (图 2)。
1-厚朴 2-凹叶厚朴 3-玉兰 4-望春玉兰 5-武当玉兰
6-紫玉兰 7-山玉兰 8-桂南木莲 9-红花木莲 10-鹅掌
楸 M -λDN A /EcoRI+ HindⅢ DNA Ladder
图 1　 AP-PCR指纹图谱
3　结果
使用 16个上海生工公司合成的长短不一的随
机寡核苷酸链引物对 10种基因组总 DNA样品进
行任意引物 PCR扩增 ,共获得可区分的 DNA扩增
片段 657条 ,其中多态性片段 497条 ,占总数的
75. 6% (表 2)。
4　讨论
表 2　厚朴与其它样品 AP-PCR扩增片段比较
引物 N XY /( NX+ NY )
1V S 2 1V S 3 1VS 4 1V S 5 1V S 6 1VS 7 1V S 8 1V S 9 1VS 10
多态性带数 /
扩增总带数
AP-1 3 /8 2 /8 2 /8 3 /8 3 /8 2 /6 1 /7 1 /8 3 /10 29 /39
AP-2 3 /6 3 /8 2 /8 3 /9 4 /9 2 /8 4 /8 4 /8 2 /7 29 /39
AP-3 5 /11 3 /9 3 /11 1 /8 2 /9 2 /9 3 /9 2 /8 2 /8 32 /42
AP-4 3 /9 2 /9 2 /9 2 /9 2 /9 3 /10 1 /9 1 /10 3 /10 34 /44
AP-5 3 /7 3 /8 3 /8 3 /9 3 /9 4 /10 3 /8 3 /9 0 /6 42 /42
AP-6 2 /5 1 /4 1 /4 1 /5 1 /4 1 /4 1 /4 1 /6 0 /3 23 /23
AP-7 3 /8 3 /8 3 /8 3 /8 2 /8 2 /8 2 /7 2 /7 2 /10 20 /40
AP-8 5 /12 3 /10 2 /8 3 /12 2 /12 3 /9 2 /10 4 /13 3 /11 39 /49
AP-A 4 /8 2 /7 2 /7 2 /7 3 /8 2 /7 3 /7 2 /7 1 /6 23 /22
AP-B 3 /7 2 /6 2 /7 2 /8 2 /7 3 /9 2 /8 2 /8 2 /8 30 /40
AP-C 2 /4 2 /5 2 /5 2 /5 2 /5 2 /6 2 /7 2 /5 1 /4 20 /30
AP-D 3 /7 2 /8 2 /7 2 /6 2 /8 2 /5 1 /6 2 /9 1 /7 29 /39
AP-E 4 /9 3 /8 3 /8 2 /8 2 /8 2 /7 2 /8 2 /7 2 /7 20 /30
AP-F 5 /10 3 /11 3 /12 3 /10 3 /10 3 /9 3 /11 3 /11 2 /9 33 /43
MG-1 3 /11 3 /12 3 /14 3 /13 3 /15 3 /12 3 /14 2 /12 2 /10 45 /65
MG-15 1 /2 0 /3 0 /4 0 /5 1 /5 0 /4 0 /4 0 /4 1 /4 29 /29
　　注: ( 1)表中样品编号为: 1-厚朴 2-凹叶厚朴 3-玉兰 4-望春玉兰 5-武当玉兰 6-紫玉兰 7-山玉兰 8-桂南木莲 9-红花木莲 10-鹅掌揪
( 2) NXY是两样品共有扩增片段数 , NX+ NY是两样品总扩增片段数
·547·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
图 2根据 AP-PCR数据 ,使用 1-F 距离系
数、 U PGM A法聚类分析产生的树状图
　　本实验使用的 AP-PCR技术对厚朴及其伪、混
品所进行的鉴定具有快速准确、直观方便等特点。厚
朴 Magnolia of f icinal is、凹叶厚朴 M . biloba与其余
8个样品之间存在着明显的 DNA指纹差异 (图
1)。利用这些差异可以帮助直接鉴别厚朴、凹叶厚朴
及其伪品、混淆品。
聚类分析结果 (图 2) 显示 ,所研究的 10种植
物被为分 4类: ( 1) 鹅掌楸单独组成一分支 ; ( 2)厚
朴与凹叶厚朴归为一类 ; ( 3)玉兰 、望春玉兰、武当
玉兰、紫玉兰和山玉兰等 5种植物聚合为一类 ; ( 4)
桂南木莲和红花木莲构成一类。 此结果同经典的系
统分类较为吻合。鹅掌楸属木兰科鹅掌楸属 ( Lirio-
dendron L. ) ,是古老的孑遗植物 ,在该科中地位特
殊。本研究也提示它同木兰科的其余植物亲缘关系
较远。厚朴与凹叶厚朴之间的关系非常密切 ,相似度
指数 F值达 0. 81,它们同属木兰属 (Magnol ia L. )
木兰亚属 ( Subgen Magnolia ) 的皱皮木兰组。 玉
兰、望春玉兰、武当玉兰及紫玉兰都是木兰属中玉兰
亚属 ( Subgen Pleurochasma )的成员。 传统分类将
山玉兰归在木兰亚属 , AP-PCR分析也显示山玉兰
与厚朴的 F值为 0. 59,在所研究的玉兰类植物中
同厚朴的相似性最大。桂南木莲和红花木莲隶属于
木兰科另一属木莲属 (Mangl ietia Bl. )。
分子生物学研究表明 ,通过 DNA分子遗传标
记技术所揭示植物的亲缘关系越近 ,它们所含化学
成分也越相似 [3 ]。事实上 ,山玉兰中厚朴酚、和厚朴
酚的总量大于 0. 1% ,较除厚朴、凹叶厚朴外的其余
样品都高 1倍以上 [3 ] ,说明在一定地区将山玉兰
(野厚朴 )入药是有根据的。但是 ,桂南木莲、红花木
莲经测定其厚朴酚、和厚朴酚含量极低 ,而木兰箭毒
含量较高 ,不宜作厚朴入药 [4 ]。本实验中二者与厚朴
的 1-F 值分别为 0. 50和 0. 49,仅低于鹅掌楸
( 0. 60) ,也在一定程度上映证了这一观点。
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浙江省天南星族药用植物块茎的蛋白质电泳分析
孙红祥
(浙江大学华家池校区动物科学学院 ,浙江 杭州　 310029)
摘　要: 目的　探讨天南星族药用植物间生理生化特征的相关性和差异性 ,分析它们的亲缘关系 ,为其分类鉴定提
供科学依据。方法　应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对天南星族植物 11种 5变种 1变型共 29个样品进行蛋白质电
泳分析 ,从电泳谱中取 49个数量化特征 ,以单链法对这类植物进行聚类分析。 结果　同种植物的蛋白质电泳谱较
相似 ,而不同种植物之间有明显差异。结论　 ( 1)此类植物的蛋白质电泳谱具有一定的稳定性和可靠性 , ( 2)蛋白质
电泳分析结果与传统经典分类结果基本吻合 , ( 3)长管半夏 Pinellia longitubulosa应建立新种 ;粉背盾叶半夏 P .
peltata var. chunanensis和绛斑湘南星 Arisaema hunanense va r. ningpoense宜成立新变种 ;全缘灯台莲 Arisaema
sikok ianum、灯台莲 A . sikok ianum var. serratum 及七叶灯台莲 A . sikokianum va r. henryanu 3变种应予归并。
关键词: 天南星族 ;药用植物 ;新鲜块茎 ;蛋白质电泳 ;聚类分析
中图分类号: R282. 21　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 06 0548 04
·548· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
收稿日期: 2001-08-06